ферменты для фармацевтического применения

Формула изобретения

1. Лекарственное средство для лечения экзокринной недостаточности поджелудочной железы, которое представляет собой кислотоустойчивую протеазу, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 1.

2. Применение кислотоустойчивой протеазы, определенной в п.1, для производства лекарственного средства для лечения экзокринной недостаточности поджелудочной железы.

3. Фармацевтическая композиция, содержащая кислотоустойчивую протеазу, определенную в п.1, предпочтительно в виде твердого концентрата, вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом для лечения экзокринной недостаточности поджелудочной железы.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к фармацевтическому применению протеаз, родственных протеазе, полученной из Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (SEQ ID NO: 1), необязательно в комбинации с липазой и/или амилазой. Примерами медицинских показаний являются: лечение пищеварительных расстройств, экзокринная недостаточность поджелудочной железы (PEI), панкреатиты, муковисцидоз, диабет 1 типа и/или диабет 2 типа.

Уровень техники

Некоторые выпускаемые промышленностью лекарственные средства в виде добавок панкреатических ферментов известны для лечения экзокринной недостаточности поджелудочной железы. Активные ингредиенты этих продуктов представляют собой пищеварительные ферменты, в основном амилазу, липазу и протеазу, которые в нормальных условиях вырабатываются в поджелудочной железе и экскретируются в верхние отделы тонкого кишечника (двенадцатиперстную кишку). Ферменты, применяемые в таких лекарственных средствах, выделяют из бычьей или свиной поджелудочной железы.

В US 5614189 (EP 600868) описывается применение некоторых микробных липаз в заместительной терапии панкреатическими ферментами, например, при лечении пациентов, страдающих муковисцидозом.

В WO 00/54799 описывается применение ферментных смесей, имеющих липолитическую, протеолитическую и амилолитическую активность, при лечении сахарного диабета 1 и 2 типа.

В WO 02/060474 описывается применение некоторых липаз, протеаз и амилаз при лечении мальдигестии.

Протеаза, полученная из Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (SEQ ID NO: 1), так же, как и ее получение и различное промышленное применение, описаны в WO 88/03947 и WO 01/58276.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к протеазе, идентичной по меньшей мер, на 70% SEQ ID NO: 1, для применения в качестве лекарственного средства, необязательно в комбинации с липазой и/или амилазой.

Изобретение также относится к применению таких протеаз для производства лекарственного средства для лечения расстройств пищеварения, PEI, недостаточности поджелудочной железы, панкреатита, муковисцидоза, диабета 1 типа и/или диабета 2 типа, и это применение необязательно дополнительно включает в себя применение липазы и/или амилазы.

Изобретение, более того, относится к фармацевтической композиции, содержащей такие протеазы, вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, необязательно включающей липазу и/или амилазу.

Изобретение также относится к способу лечения расстройств пищеварения, PEI, недостаточности поджелудочной железы, панкреатита, муковисцидоза, диабета 1 типа и/или диабета 2 типа путем введения терапевтически эффективного количества таких протеаз, необязательно вместе с липазой и/или амилазой.

Подробное описание изобретения

Ферменты

Термин «протеаза» определяется здесь как фермент, который гидролизует пептидные связи. Он включает любой фермент, принадлежащий группе ферментов ЕС 3.4 (включая каждый из тринадцати ее подклассов, причем эти ферменты в последующем обозначены как «принадлежащие группе ЕС 3.4.-.-»). Номер ЕС относится к Номенклатуре ферментов 1992 г. NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, включая дополнения 1-5, опубликованные в Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; соответственно. Номенклатура регулярно дополняется и обновляется; см., например, сайт по адресу http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

На основании каталитического механизма протеазы классифицируют следующим образом: сериновые протеазы (S), цистеиновые протеазы (С), аспарагиновые протеазы (А), металлопротеазы (М) и неизвестные, или до сих пор не классифицированные, протеазы (U), см. Справочник протеолитических ферментов, A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner (eds), Academic Press (1998), в частности, общую вводную часть.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическому применению протеаз, идентичных по меньшей мере на 70% протеазе SEQ ID NO: 1, которая получена из Nocardiopsis sp. NRRL 18262 и описана в WO 88/03947 и WO 01/58276.

Дополнительные протеазы изобретения раскрыты в WO 2004/111220, WO 2004/111221, WO 2004/111222, WO 2004/111223, WO 2005/035747, WO 2004/111219, включенных здесь в качестве ссылки.

Конкретные примеры протеаз изобретения получены из Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (SEQ ID NO: 2), Nocardiopsis alba DSM 15647 (SEQ ID NO: 3), Nocardiopsis prasina DSM 15648 (SEQ ID NO: 4), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (SEQ ID NO: 5), так же, как и их фрагменты, мутанты и варианты, такие как протеаза 22 (SEQ ID NO: 6), необязательно, каждая из SEQ ID NOs: 1-6 имеет С-концевое расширение, состоящее из одной или более аминокислот, например, неполярных или незаряженных аминокислот, таких как одна или более из Q, S, V, A или Р, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из QSHVQSAP (SEQ ID NO: 7), QSAP, QP, TL, TT, QL, TP, LP, TI, IQ, QP, PI, LT, TQ, IT, QQ и PQ.

В конкретных вариантах осуществления протеазы изобретения выбирают из группы, состоящей из:

(а) протеаз, относящихся к ферментной группе ЕС 3.4.-.-;

(b) сериновых протеаз;

(с) сериновых протеаз семейства пептидаз S2A;

(d) сериновых протеаз семейства пептидаз S1Е, как описано в Biochem.J. 290:205-218 (1993) и в базе данных для протеаз MEROPS, версия 6.20, 24 марта 2003 (www.merops.ac.uk). База данных описана в Rawlings, N.D., O'Brien, E.A & Barrett, A.J. (2002) MEROPS: the protease database. Nucleic Acids Res. 30, 343-346;

и

(е) протеаз, полученных из штаммов Nocardiopsis.

Для определения, является ли данная протеаза сериновой протеазой, или протеазой из семейства S2A, сделана ссылка на вышеописанный Справочник и принципы, определенные в нем. Такое определение может быть проведено для всех типов протеаз, являются ли они встречающимися в природе или протеазами дикого типа; или созданными посредством генной инженерии, или синтетическими протезами.

В конкретных вариантах осуществления степень идентичности SEQ ID NO: 1 составляет по меньшей мере 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99%. В альтернативных вариантах осуществления степень идентичности составляет по меньшей мере приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68% или по меньшей мере 69%.

В конкретных дополнительных вариантах осуществления протеаза изобретения является кислотоустойчивой, что означает, что протеазная активность чистого протеазного фермента в разведении, соответствующем А₂₈₀ = 1,0, и последующей инкубацией в течение 2 часов при 37°C в следующем буфере: 100 мМ янтарной кислоты, 100 мМ HEPES, 100 мМ CHES, 100 мМ CABS, 1 мМ CaCl₂, 150 мМ KCl, 0,01% Triton® X-100, pH 3,5, составляет по меньшей мере 40% (или по меньшей мере 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, или по меньшей мере 97%) от контрольной активности, как определено с использованием анализа, описанного в примере 2С WO 01/58276 (субстрат: Suc-AAPF-pNA, рН 9,0, 25°C). Термин «контрольная активность» относится к протеазной активности такой же протеазы с последующей инкубацией в чистом виде в разведении, соответствующем А₂₈₀ = 1,0, в течение 2 часов при 5°C в следующем буфере: 100 мМ янтарной кислоты, 100 мМ HEPES, 100 мМ CHES, 100 мМ CABS, 1 мМ CaCl₂, 150 мМ KCl, 0,01% Triton® X-100, pH 9,0, причем активность определена, как описано выше. Термин А₂₈₀ = 1,0 обозначает такую концентрацию (разведение) упомянутой чистой протеазы, которая дает поглощение, равное 1,0, при 280 нм и при длине пути в кювете 1 см, по отношению к буферному контролю. Термин «чистая протеаза» относится к образцу с вышеупомянутым отношением А₂₈₀/А_260, превышающим или равным 1,70 (см. пример 2Е WO 01/58276), и для которого интенсивность окрашивания полосы, соответствующей упомянутой протеазе, измеренная сканированием геля, окрашенного кумасси после SDS-PAGE-электрофореза, составляет по меньшей мере 95% интенсивности (см. пример 2А WO 01/58276).

В еще дополнительных конкретных вариантах осуществления необязательно может применяться дополнительная протеаза, например протеаза млекопитающего, например, в виде экстракта поджелудочной железы свиней, или микробная протеаза, например, полученная из бактериальных или грибковых штаммов, таких как Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus или Rhizopus. Протеаза может, в частности, быть получена из штамма Aspergillus, такого как Aspergillus oryzae или Aspergillus melleus, в частности, продукт Prozime 6 (нейтральная, щелочная протеаза ЕС 3.4.21.63), который коммерчески доступен от Amano Pharmaceuticals, Japan.

Протеаза изобретения может применяться в комбинации с липазой.

В настоящем контексте липаза обозначает гидролазу карбоксильного сложного эфира ЕС 3.1.1., которая включает такие вещества, как триацилглицериновую липазу ЕС 3.1.1.3, фосфолипазу А1 ЕС 3.1.1.4, лизофосфолипазу ЕС 3.1.1.5, галактолипазу ЕС 3.1.1.26, фосфолипазу А1 ЕС 3.1.1.32, ферулоилэстеразу ЕС 3.1.1.73. В конкретном варианте осуществления липаза представляет собой триацилглицериновую липазу ЕС 3.1.1.3.

В конкретных вариантах осуществления липаза представляет собой липазу млекопитающих, например, в виде экстракта поджелудочной железы свиней, или микробную липазу, например, полученную из бактериальных или грибковых штаммов, таких как Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus или Rhizopus . Липаза может, в частности, быть получена из штамма Rhizopus, такого как Rhizopus javanicus, Rhizopus oryzae или Rhizopus delemar, например, продукт Lipase D Amano 2000 (также обозначенная как Lipase D2 ), которая коммерчески доступна от Amano Pharmaceuticals, Japan.

В дополнительных конкретных вариантах осуществления липаза для применения в настоящем изобретении представляет собой рекомбинантно произведенную микробную липазу, например, полученную из гриба, такого как Humicola или Rhizomucor, из дрожжевых грибков, таких как Candida, или из бактерий, таких как Pseudomonas. В предпочтительном варианте осуществления липаза получена из Humicola lanuginose или Rhizomucor miehei.

Липаза Humicola lanuginosa (синоним Thermomyceslanuginosus) (SEQ ID NO: 8) описана в ЕР 305216, и конкретные варианты липазы описаны, например, в WO 92/05249, WO 92/19726, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 99/42566, WO 00/32758, WO 00/60063, WO 01/83770, WO 02/055679 и WO 02/066622. Кроме того, дополнительными примерами грибковых липаз являются кутиназа Humicola insolens, которая описана в ЕР 785994, и фосфолипаза Fusarium oxysporum, которая описана в ЕР 869167. Примерами липаз дрожжевых грибков являются липаза А и В Candida аntarctica, липаза А которой описана в ЕР 652945, а липаза В описана, например, Uppenberg et al. in Structure, 2 (1994), 293. Примером бактериальной липазы является липаза, полученная из Pseudomonas cepacia, которая описана в ЕР 214761.

В предпочтительном варианте осуществления липаза идентична по меньшей мере на 70% липазе SEQ ID NO: 8. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления степень идентичности SEQ ID NO: 8 составляет по меньшей мере 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99%. В альтернативных вариантах осуществления степень идентичности составляет по меньшей мере приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68% или по меньшей мере 69%.

В еще одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления липаза, подобная липазе поджелудочной железы млекопитающих, представляет собой специфическую в 1,3-положении липазу.

Протеаза изобретения, с липазой или без, как описано выше, может также применяться в комбинации с амилазой.

В настоящем контексте амилаза представляет собой фермент, который катализирует эндо-гидролиз крахмала и других неразветвленных и разветвленных олиго- и полисахаридов. Амилозная часть крахмала богата 1,4-альфа-глюкозидными связями, в то время как амилопектиновая часть является более разветвленной, содержащей не только 1,4-альфа, но также 1,6-альфа-глюкозидные связи. В конкретном варианте осуществления амилаза представляет собой фермент, принадлежащий группе ЕС 3.2.1.1.

В конкретных вариантах осуществления амилаза является амилазой млекопитающего, например, в виде экстракта поджелудочной железы свиней, или микробной амилазы, например, полученной из бактериальных или грибковых штаммов, таких как Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus или Rhizopus.

Амилаза может, в частности, быть получена из штамма Aspergillus, такого как Aspergillus niger, Aspergillus oryzae или Aspergillus melleus, например, быть любым из продуктов Amylase A1 , полученной из Aspergillus oryzae, которая коммерчески доступна от Amano Pharmaceuticals, Japan, или Amylase EC , полученной из Aspergillus melleus, которая коммерчески доступна от в Extract-Chemie, Germany.

Другими примерами грибковых амилаз являются амилаза Aspergillus niger (SWISSPROT Р56271), которая также описана в примере 3 WO 89/01969, и амилаза Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 9). Примеры вариантов амилазы Aspergillus oryzae описаны в WO 01/34784.

Альфа-амилаза, полученная из Bacillus licheniformis, является примером бактериальной альфа-амилазы. Эта амилаза, например, описана в WO 99/19467, вместе с другими гомологичными бактериальными альфа-амилазами, полученными, например, из Bacillus amyloliquefaciens или Bacillus stearothermophilus, так же, как и их варианты. Примеры дополнительных вариантов амилазы описаны в патенте США № 4933279; ЕР 722490 и ЕР 904360.

В конкретном варианте осуществления амилаза по меньшей мере на 70% идентична амилазе SEQ ID NO: 9. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления степень идентичности SEQ ID NO: 9 составляет по меньшей мере 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99%. В альтернативных вариантах осуществления степень идентичности SEQ ID NO: 9 составляет по меньшей мере приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68% или по меньшей мере 69%.

Как правило, ферменты протеаза, липаза и амилаза (далее здесь «фермент(ы)») для применения в соответствии с изобретением могут быть природными или ферментами «дикого» типа, получаемыми из животных, в частности млекопитающих, например ферменты человека или свиньи; из растений или микроорганизмов, но также и любые их мутанты, варианты, фрагменты и т.д., проявляющие требуемую ферментную активность, так же, как и синтетические ферменты, такие как неспецифические ферменты и консенсусные ферменты.

В определенном варианте осуществления фермент(ы) представляют собой гипоаллергенные варианты, созданные для того, чтобы вызывать сниженный иммунный ответ при действии на животных, включая человека. Термин «иммунный ответ» следует понимать как любую реакцию иммунной системы животного на фермент(ы). Одним из типов иммунного ответа является аллергический ответ, приводящий к повышению уровня IgE у животных, подвергающихся воздействию. Гипоаллергенные варианты могут быть получены с использованием методов, известных в данной области. Например, фермент(ы) могут быть конъюгированы с полимерными молекулами, защищающими части или эпитопы фермента(ов), вовлеченных в иммунный ответ. Конъюгация с полимерами может включать in vitro химическое связывание полимера с ферментом(ами), например, как описано в WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026 и/или WO 99/00489. Кроме того, конъюгация может дополнительно или в качестве альтернативы включать in vivo связывание полимера с ферментом(ами). Такой конъюгации можно достичь с помощью генной инженерии нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент(ы), вставки консенсусных последовательностей, кодирующих дополнительные сайты гликозилирования в ферменте(ах) и экспрессии фермента(ов) в хозяине, способном к гликозилированию фермента(ов), см., например, WO 00/26354. Другим путем создания гипоаллергенных вариантов является генная инженерия нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент(ы) так, чтобы вызывать самопроизвольную олигомеризацию фермента(ов), в результате чего мономеры фермента могут защищать эпитопы других мономеров фермента, и, таким образом, снижая антигенность олигомеров. Такие продукты и их получение описаны, например, в WO 96/16177. Эпитопы, вовлеченные в иммунный ответ, могут быть определены различными способами, такими как способ фагового дисплея, описанный в WO 00/26230 и WO 01/83559, или рандомизированный подход, описанный в ЕР 561907. Если эпитоп был определен, то его аминокислотная последовательность может быть изменена для получения измененных иммунологических свойств фермента(ов) известными методами генной манипуляции, такими как направленный мутагенез (см., например, WO 00/26230, WO 00/26354 и/или WO 00/22103), и/или может быть осуществлена конъюгация полимера в достаточной близости к эпитопу для защиты эпитопа полимером.

В конкретных вариантах осуществления ферменты протеаза, липаза и/или амилаза являются (i) стабильными при рН 4-8, предпочтительно также при рН 3-4, более предпочтительно при рН 3,5; (ii) активными при рН 4-9, предпочтительно 4-8, более предпочтительно при рН 6,5; (iii) стабильными от разрушения пепсином и другими пищеварительными протеазами (такими как протеаза поджелудочной железы, т.е., главным образом, трипсин и химотрипсин); и/или (iv) стабильными и/или активными в присутствии желчных солей.

Термин «в комбинации с» относится к комбинированному применению в соответствии с изобретением протеазы, липазы и/или амилазы. Комбинированное применение может быть одновременным, перекрывающимся или последовательным, причем эти три термина в целом рассматриваются в свете назначения, сделанного терапевтом.

Термин «одновременный» относится к условиям, при которых ферменты являются активными в одно и то же время, например, когда они вводятся в одно и то же время в одной и той же фармацевтической композиции.

Термин «последовательный» относится к таким случаям, когда один и/или два фермента действуют первыми, а второй и/или третий фермент позже. Последовательное действие может быть получено путем введения рассматриваемых ферментов как отдельных фармацевтических рецептур с требуемыми интервалами, или как одной фармацевтической композиции, в которой рассматриваемые ферменты представлены по-разному (разделены), например, с целью получения разного времени высвобождения, обеспечивая повышенную стабильность продукта, или для оптимизации дозы фермента.

Термин «перекрывающийся» относится к таким случаям, когда периоды активности ферментов не являются ни полностью одновременными, ни последовательными, то есть существует определенный период, когда оба или все ферменты являются активными.

Термин, представленный единственным числом, например, когда он применяется в контексте протеазы, липазы и/или амилазы изобретения, обозначает по меньшей мере одну. В конкретных вариантах осуществления единственное число обозначает «один или более» или «по меньшей мере один», что опять же означает один, два, три, четыре, пять и т.д.

Для задач настоящего изобретения степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяется при помощи программы align , которая представляет собой выравнивание Needleman-Wunsh (т.е. универсальное выравнивание). Последовательности выравниваются при помощи программы с использованием по умолчанию матрицы подсчета BLOSUM50. Снижение счета для первого остатка разрыва составляет 12, для последующих остатков разрыва это снижение равно 2.

Align является частью пакета FASTA версии v20u6 (см. W.R. Pearson and D.J. Lipman (1988), Improved Tools for Biological Sequence Analysis , PNAS 85:2444-2448, и W.R. Pearson (1990) Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA , Methods in Enzymology 183:63-98). Выравнивание протеинов по FASTA использует выравнивание по алгоритму Smith-Waterman, с ограничением размера разрыва (см. Smith-Waterman algorithm , T.F. Smith and M.S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197).

Активность фермента(ов) изобретения может быть определена с использованием подходящего анализа. Как правило, анализ рН и анализ температуры адаптированы к рассматриваемому ферменту. Примерами значений рН для проведения анализа являются рН 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12. Примерами температуры для проведения анализа являются 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 или 95°C.

Например, протеазная активность может быть определена с использованием любого анализа, в котором применяется субстрат, который включает пептидные связи, соответствующие специфичности рассматриваемой протеазы.

Примеры подходящего ферментного анализа включены в экспериментальную часть. Другие примеры представляют собой Ph.Eur. анализ для активности липазы и амилазы.

Лекарственное средство

В настоящем контексте термин «лекарственное средство» обозначает соединение или смесь соединений, которые лечат, предотвращают и/или облегчают симптомы заболевания. Лекарственное средство может быть назначено терапевтом или может представлять собой продукт, продаваемый без рецепта.

Фармацевтические композиции

Выделение, очистка и концентрирование фермента(ов) изобретения могут быть осуществлены общепринятыми средствами.

В конкретном варианте осуществления концентрированный твердый или жидкий препарат каждого фермента (ферментов) получают отдельно. Эти концентраты могут также, по меньшей мере частично, применяться по отдельности, как объяснено более подробно ниже.

В дополнительном конкретном варианте осуществления фермент(ы) включают в фармацевтические композиции изобретения в виде твердых концентратов. Фермент(ы) может быть приведен в твердое состояние различными способами, известными в данной области. Например, твердое состояние может быть или кристаллическим, когда молекулы фермента расположены в высокоупорядоченном виде, или преципитатом, когда молекулы фермента расположены в менее упорядоченном или беспорядочном виде.

Кристаллизацию можно, например, осуществлять при рН, близком к рI фермента(ов), и при низкой проводимости, например, 10 мСм/см или менее, как описано в ЕР 691982 (см. также здесь пример 2).

В данной области известны различные способы преципитации, включая преципитацию с солями, такими как сульфат аммония и/или сульфат натрия; с органическими растворителями, такими как этанол и/или изопропанол; или с полимерами, такими как PEG (полиэтиленгликоль). В качестве альтернативы, фермент(ы) можно преципитировать из раствора путем удаления растворителя (обычно воды) различными способами, известными в данной области, например, лиофилизацией, выпариванием (например, при пониженном давлении) и/или сушкой распылением.

В дополнительном конкретном варианте осуществления твердый концентрат фермента(ов) имеет содержание активного белка фермента по меньшей мере 50% (мас.) по отношению к общему содержанию белка в твердом концентрате. В еще дополнительных конкретных вариантах осуществления содержание активного белка фермента, относительно к общему содержанию белка в твердом концентрате, составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или по меньшей мере 95% (мас.). Содержание белка может быть определено, как это известно в данной области, например, с использованием коммерческого набора, такого как Protein Assay ESL, порядковый номер 1767003, который коммерчески доступен от Roche, или на основании способа, описанного в примере 8 WO 01/58276.

Фармацевтическая композиция изобретения содержит фермент(ы), предпочтительно в виде концентрированных ферментных препаратов, более предпочтительно твердых концентратов, вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом или дополнительным материалом, таким как (i) по меньшей мере один носитель и/или эксципиент; или (ii) по меньшей мере один носитель, эксципиент, разбавитель и/или адъювант. Неограничивающими примерами, необязательно, других ингредиентов, все из которых фармацевтически приемлемы, являются дезинтеграторы, лубриканты, буферные агенты, увлажняющие агенты, консерванты, ароматизаторы, растворители, растворяющие агенты, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы, пропелленты и носители.

Как правило, в зависимости от, среди прочего, рассматриваемых медицинских показаний, композиция изобретения может быть предназначена для всех способов введения, известных в данной области, включая энтеральное введение (через пищеварительный тракт) и парентеральное введение, например, путем инъекции (такой как подкожная, внутримышечная или внутривенная и т.д.). Таким образом, композиция может быть твердой, полутвердой, жидкой или газообразной, такой как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, микросферы, мази, кремы, пены, растворы, суппозитории, инъекции, ингаляторы, гели, микросферы, лосьоны и аэрозоли.

Следующие способы и вспомогательные материалы являются только примерными и никоим образом не ограничивающими.

В твердом пероральном препарате фермент(ы) может использоваться один или в комбинации с соответствующими добавками для изготовления таблеток, порошков, гранул или капсул, например, со стандартными носителями, такими как лактоза, маннит, кукурузный крахмал или картофельный крахмал; с эксципиентами или связующими веществами, такими как кристаллическая или микрокристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, камедь, кукурузный крахмал или желатины; с дезинтегрантами, такими как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или натрий-карбоксиметилцеллюлоза; с лубрикантами, такими как карнаубский воск, белый воск, шеллак, сухой коллоидный диоксид кремния, макрогол 6000, повидон, тальк, монолеин или стеарат магния; и, при необходимости, с разбавителями, вспомогательными веществами, буферными агентами, увлажняющими агентами, консервантами, такими как метилпарагидроксибензоат (Е218), красителями, такими как диоксид титана (Е171), и ароматизаторами, такими как сахароза, сахарин, апельсиновое масло, масло лимона и ванилин. Пероральные препараты являются примерами предпочтительных препаратов для лечения медицинских проявлений PEI.

Фермент(ы) может также, как правило, входить в состав препаратов для инъекций или жидких пероральных препаратов посредством их разведения, суспендирования или эмульгирования в водном растворителе, таком как вода, или неводных растворителях, таких как растительные или другие такие же масла, синтетические глицериды алифатических кислот, сложные эфиры высших алифатических кислот, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, такой как PEG 4000, или низшие спирты, такие как неразветвленные или разветвленные С₁-С₄ спирты, например, 2-пропанол; и, при необходимости, со стандартными вспомогательными материалами или добавками, такими как повышающие растворимость вещества, адъюванты, разбавители, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, стабилизаторы и консерванты.

Фермент(ы) может, более того, также, как правило, использоваться в аэрозольных рецептурах для введения ингаляцией, например, путем приготовления находящихся под давлением приемлемых пропеллентов, таких как дихлородифторметан, пропан, азот и тому подобное.

Более того, фермент(ы) может, как правило, входить в состав суппозиториев для ректального введения путем смешивания с различными основами, такими как эмульгирующие основы или водорастворимые основы. Суппозиторий может содержать носители, такие как масло какао, карбоваксы и полиэтиленгликоли, которые плавятся при температуре тела, однако затвердевают при комнатной температуре.

Применение липосом в качестве средства доставки является другим способом, возможно, представляющим общий интерес. Липосомы сливаются с клеткой в месте-мишени и доставляют содержимое полости внутрь клетки. Липосомы поддерживаются в контакте с клетками в течение достаточного для слияния времени, используя различные пути для поддержания контакта, такие как изоляция, связывающие агенты и тому подобное. В одном аспекте изобретения липосомы предназначены для распыления при внутрилегочном введении. Липосомы могут быть получены вместе с очищенными белками или пептидами, которые содействуют слиянию мембран, такими как вирус Сендай или вирус гриппа и т.д. Липиды могут представлять собой любые пригодные комбинации известных липидов, образующих липосомы, включая катионные или цвиттер-ионные липиды, такие как фосфатидилхолин. Остальные липиды будут, как правило, нейтральными или кислыми липидами, такими как холестерин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин и тому подобное. Для получения липосом может быть использована методика, описанная Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361.

Могут быть предоставлены единичные дозированные формы для перорального или ректального введения, такие как сиропы, эликсиры, порошки и суспензии, где каждая единица дозирования, например чайная ложка, столовая ложка, капсула, таблетка или суппозиторий, содержит заранее определенное количество фермента (ферментов). Аналогичным образом, единичные дозированные формы для инъекций или внутривенного введения могут содержать фермент(ы) в композиции в виде раствора в стерильной воде, физиологическом растворе или другом фармацевтически приемлемом носителе.

Термин «единичная дозированная форма», используемый здесь, относится к физически отдельным единицам, пригодным в качестве единичных доз для субъектов-людей и животных, причем каждая единица содержит заранее определенное количество фермента (ферментов), достаточное для получения желаемого эффекта.

В конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция изобретения предназначена для энтерального, предпочтительно перорального, введения.

В дополнительных конкретных вариантах осуществления композиция для перорального приема представляет собой (i) жидкую композицию, содержащую кристаллы фермента (ферментов); (ii) жидкую суспензию взвеси (высоко)очищенного фермента (ферментов); (iii) гель, содержащий фермент(ы) в твердом или растворенном виде; (iv) жидкую суспензию иммобилизованного фермента (ферментов) или ферментов, адсорбированных в виде частиц и т.п.; или (v) твердую композицию в виде порошка, драже, гранул или микросфер, содержащих фермент(ы), при необходимости в виде таблеток, капсул или тому подобное, которые необязательно покрыты оболочкой, например, кислотоустойчивым покрытием.

В другом конкретном варианте осуществления композиции фермент(ы) являются разделенными, то есть отделены друг от друга, например, разделяющими покрытиями.

В еще одном дополнительном конкретном варианте осуществления композиции протеаза отделена от других ферментных компонентов композиции, таких как липаза и/или амилаза.

Доза фермента (ферментов) будет широко варьировать в зависимости от определенного фермента(ферментов) для введения, частоты введения, способа введения, выраженности симптомов и чувствительности субъекта к побочным эффектам и тому подобное. Некоторые конкретные ферменты могут быть более эффективными, чем другие.

Амидные (пептидные) связи, так же как и амино- и карбоксильные концы, могут быть изменены для более высокой стабильности при пероральном приеме. Например, карбоксильный конец может быть амидирован.

Способы лечения

Протеаза изобретения, необязательно в комбинации с липазой и/или амилазой (ферментом(ами) изобретения), является пригодной для терапевтического и/или профилактического лечения различных заболеваний или нарушений у животных. Термин «животное» включает всех животных и, в частности, человека. Примерами животных являются нежвачные, жвачные, такие как овцы, козы, лошади, и крупный рогатый скот, например мясной скот, коровы и молодые особи. В конкретном варианте осуществления животное представляет собой нежвачное животное. Нежвачные животные включают животных с однокамерным желудком, например поросят или свиней (включая, но не ограничиваясь ими, поросят, поросят-подростков и свиноматок); домашнюю птицу, такую как индейки, утки и куры (включая, но не ограничиваясь ими, цыплят-бройлеров, несушек); молодняк; домашних животных, таких как кошки и собаки; и рыбу (включая, но не ограничиваясь ими, лосося, форель, тилапию, сома и карпов); и ракообразных (включая, но не ограничиваясь ими, креветок и больших креветок). В конкретном варианте осуществления животное является млекопитающим, более конкретно, человеком.

Например, фермент(ы) являются пригодными для лечения пищеварительных расстройств, таких как мальдигестия или диспепсия, которые часто бывают вызваны недостаточной продукцией и/или секрецией в пищеварительном тракте пищеварительных ферментов, обычно секретируемых, среди прочего, желудком и поджелудочной железой.

Кроме того, фермент(ы) являются пригодными для лечения PEI. PEI может быть верифицирована с использованием, среди прочего, теста Borgström (JOP. J Pancreas (Online) 2002; 3(5):116-125), и она может быть вызвана таким заболеваниями и состояниями, как рак поджелудочной железы, хирургическое вмешательство на поджелудочной железе и/или желудке, например, тотальная или частичная резекция поджелудочной железы, гастрэктомия, состояние после наложения желудочно-кишечного анастомоза (например, гастроэнтеростомия по Бильрот II); хронический панкреатит; синдром Швачмана-Даймонда; обструкция протока поджелудочной железы или общего желчного протока (например, новообразованием); и/или муковисцидоз (наследственное заболевание, при котором густая слизь закупоривает протоки поджелудочной железы). Фермент(ы) могут также быть пригодными для лечения острого панкреатита.

Эффект фермента(ферментов) при пищеварительных расстройствах может быть измерен, как в общем описано в ЕР 0600868, в примере 2 которого описывается тест на перевариваемость in vitro для определения стабильности липазы в условиях желудка, а в примера 3 - тест на перевариваемость in vitro для определения активности липазы в присутствии желчных солей. Соответствующие тесты могут быть проведены для протеазы и амилазы. Также в WO 02/060474 раскрываются подходящие тесты, например, (1) тест in vitro для измерения переваривания липидов в тестируемом корме для свиней и (2) проба in vivo на свиньях с недостаточностью поджелудочной железы, у которых измеряли перевариваемость жира, белка и крахмала.

В конкретном варианте осуществления эффект протеазы изобретения измеряли с использованием in vitro модели пищеварительной недостаточности поджелудочной железы примера 1 настоящего описания, в котором при необходимости могут применяться различные другие субстраты, например животный белок, другие растительные белки, крупы, животные или растительные жиры и масла, так же как и их смеси.

В других конкретных вариантах осуществления эффект протеазы изобретения измеряли с использованием скринингового теста in vivo для определения активности протеазы примера 4 или полной in vivo пробы на перевариваемость примера 5.

В качестве другого примера фермент(ы) являются пригодными для лечения сахарного диабета типа I, и/или типа II, в особенности для адъювантного лечения при терапии, проводимой у больных диабетом при пищеварительных нарушениях, обычно сопровождающих это заболевание, с целью сократить поздние осложнения.

Эффект фермента (ферментов) при сахарном диабете может быть определено одним или более способами, описанными в WO 00/54799, например, посредством контроля уровня гликозилированного гемоглобина, уровня глюкозы крови, приступов гипогликемии, содержания жирорастворимых витаминов, таких как витамин А, D и Е, требуемой суточной дозы инсулина, индекса массы тела и периодов гипергликемии.

Изобретение, описанное и заявленное здесь, не ограничено в объеме конкретными вариантами осуществления, раскрытыми здесь, так как эти варианты осуществления представлены в качестве иллюстрации некоторых аспектов изобретения. Любые сходные варианты осуществления предназначены быть в объеме данного изобретения. Фактически, различные модификации изобретения, в дополнение к модификациям изобретения, показанным и описанным здесь, станут очевидными для специалистов в данной области из вышеприведенного описания. Такие модификации также предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения. В случае конфликта настоящее раскрытие, включая определения, будет проверено.

Здесь приведены различные ссылки, раскрытия которых в полном объеме включены в качестве ссылки.

Примеры

Пример 1: Модель пищеварительной недостаточности поджелудочной железы in vitro

Очищенный препарат протеазы, полученной из Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (SEQ ID NO: 1), получают, как в целом описано в примере 2 WO 01/58276, и проверяют на модели in vitro, имитирующей пищеварение у индивидуума, страдающего недостаточностью поджелудочной железы.

Система in vitro состоит из 24 колб, в которых субстрат (на основе кукурузы и пищи из соевых бобов (SBM)) вначале инкубируют с HCl/пепсином (имитирующими пищеварение в желудке), а затем при двух в разной степени сниженных уровнях панкреатина, имитирующих кишечное пищеварение у индивидуума с частичной и полной недостаточностью поджелудочной железы. Включают также эксперимент для положительного контроля при нормальном уровне панкреатина.

10 колб содержат протеазу при начале желудочной фазы, тогда как оставшиеся колбы являются контролем. В конце фазы кишечной инкубации образцы пищеварения in vitro извлекают и исследуют на предмет растворенного и переваренного белка.

Общая схема процедуры in vitro

Добавленные компоненты	рН	Температура	Время цикла	Имитируемая фаза пищеварения
10 г субстрата из кукурузы/SBM (6:4), 41 мл HCl (0,105М)	3,0	40°C	t=0 мин	Смешивание
5 мл HCl (0,105М/пепсин (3000 ед/г субстрата), 100 мг протеазы ЕР/кг субстрата)	3,0	40°C	t=30 мин	Желудочное пищеварение
16 мл Н2О	3,0	40°C	t=1,0 час	Желудочное пищеварение
7 мл NaOH (0,39М)	6,8	40°C	t=1,5 часа	Кишечное пищеварение
5 мл NaHCO3 (1М)/панкреа-тин (0, 4 или 8 мг/г субстрата)	6,8	40°C	t=2,0 часа	Кишечное пищеварение с дефектом по панкреатину (плюс положительный контроль)
Окончательная инкубация	7,0	40°C	t=6,0 часов

Условия

Субстрат: 4 г SBM, 6 г кукурузы (предварительно смешанные)

HCl: 0,105 М на 1,5 часа (т.е. предварительное смешивание HCl с субстратом в течение 30 мин)

пепсин: Sigma P-7000; 3000 ед/г субстрата в течение 1 часа

панкреатин: Sigma P-7545; 0, 4 или 8 мг/г субстрата в течение 4 часов (при предполагаемом нормальном уровне панкреатина, составляющем 8 мг/г)

протеаза: 100 мг белка фермента протеазы (ЕР)/кг субстрата (белок фермента рассчитывают на основании величин А₂₈₀ и аминокислотных последовательностей (аминокислотных композиций), используя принципы, описанные в S.C.Gill & P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989))

рН: 3,0 на желудочной стадии/6,8-7,0 на кишечной стадии

температура : 40°C

Параллельные опыты: 5(4)

Растворы

0,39 М NaOH

0,105 M HCl

0,105 M HCl, содержащей 6000 ед. пепсина на 5 мл

1 M NaHCO₃, содержащего 16 мг панкреатина на мл

125 мM NaAc-буфера, рН 6,0

Экспериментальная методика для модели in vitro

Экспериментальная методика соответствует вышеприведенной схеме. рН измеряют через 1, 2,5 и 5,5 часов. Инкубацию заканчивают через 6 часов и образцы по 30 мл забирают и помещают на лед до центрифугирования (10000 × g, 10 мин, 4°C). Супернатант удаляют и хранят при -20°C.

Анализ

Все образцы исследуют на содержание растворенного и переваренного белка с использованием гель-фильтрации.

Оценка растворенного и переваренного белка

Содержание растворенного белка в супернатантах из образцов, переваренных in vitro, подсчитывают путем определения количества непереваренного белка (СР), используя ВЭЖХ с гель-фильтрацией. Супернатанты размораживают, фильтруют через 0,45 мкм поликарбонатные фильтры и разводят Н ₂О (1:50 в объемном отношении). Разведенные образцы хроматографируют методом ВЭЖХ с применением колонок для гель-фильтрации (Global) Superdex Peptide PE (7,5 × 300 мм). Элюент, используемый для изократического элюирования, представляет собой 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 150 мМ NaCl. Общий объем элюента на каждую хроматографию составляет 26 мл, и скорость тока составляет 0,4 мл/мин. Профили элюирования регистрируют при 214 нм и общую площадь под профилями определяют путем интеграции. Для оценки содержания белка из интегрированных площадей, калибровочная кривая (R²=0,9993) выводится из серийных разведений in vitro переваренных контрольных образцов кукурузы/SBM с известным общим содержанием белка. Определение белков в этом контрольном образце осуществляют с использованием стандартного способа (в данном случае способ Kjeldahl для определения %-ного содержания азота; A.O.A.C. (1984) Official Methods of Analysis 14th ed., Washington DC).

Содержание переваренного белка оценивают путем интегрирования площади хроматограммы, соответствующей пептидам и аминокислотам, имеющим молекулярную массу 1500 дальтон или ниже (Savoie,L.; Gauthier,S.F. Dialysis Cell For The In-vitro Measurement Of Protein Digestibility. J. Food Sci. 1986, 51, 494-498; Babinszky,L; Van,D.M.J.M.; Boer,H.; Den,H.L.A. An In-vitro Method for Prediction of The Digestible Crude Protein in Pig Feeds. J. Sci. Food Agr. 1990, 50, 173-178; Boisen,S.; Eggum,B.O. Critical Evaluation of In-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals. Nutrition Research Reviews 1991, 4, 141-162). Для определения разделяющей линии 1500 дальтон гель-фильтрационные колонки калибруют с применением в качестве стандартов молекулярной массы цитохрома С (Boehringer, Germany), апротинина, гастрина I и вещества Р (Sigma Aldrich, USA).

Результаты экспериментов показаны в таблице 1. В таблице 1 колонка «Фермент» показывает количество панкреатина (сокращенно «пан») на грамм субстрата, так же как и количество протеазы Nocardiopsis (в квадратных скобках). В следующей колонке "n" представляет собой количество параллельных измерений в каждом эксперименте. Следующая группа колонок показывает процентное отношение перевариваемого непереваренного белка (сокращенно % пер.СР), включая стандартное отклонение (SD) и значение буквы индекса, как объяснено в примечании ниже таблицы. И, наконец, последняя группа колонок показывает процентное отношение растворенного непереваренного белка (сокращенно % раств. СР), также включая SD и значение букв индекса.

Как ясно из таблицы 1, имеется стойкая тенденция (р<0,10) к повышению процентного отношения растворенного, так же как и перевариваемого белка, при добавлении протеазы Nocardiopsis, и это так в эксперименте с количеством панкреатина 4 мг/г, так же как и в эксперименте с количеством панкреатина 0 мг/г (сравн. «4 мг пан, [100]» с «4 мг пан, [0]»; и «0 мг пан, [100]» с «0 мг пан, [0]»). Это значит, что протеза Nocardiopsis способна полностью или частично компенсировать отсутствие панкреатина.

Таблица 1
Фермент [мг ЕР/кг]	N	Общий белок % пер. СР		SD	% раств. СР		SD
8 мг пан, [0]	5	54,7	C	3,0	98,2	C	4,0
4 мг пан, [0]	5	47,0	А	2,2	88,1	B	4,0
0 мг пан, [0]	4	45,1	А	4,1	83,8	А	2,4
4 мг пан, [100]	5	55,0	С	1,2	95,8	С	1,8
0 мг пан, [100]	5	49,9	В	0,7	88,8	В	1,2
LSD 90%
Значения в колонке с различными верхними буквами индексов указывают на стойкую тенденцию к различию (односторонний ANOVA, Тест на наименьшее значимое различие (LSD), р<0,10). SD=стандартное отклонение.

Пример 2: Получение кристаллизованных препаратов протеазы

Протеазу SEQ ID NO: 1 ферментируют, как описано в примере 1, и бульон, содержащий протеазу, центрифугируют при рН 4,5. Полученный супернатант подвергают ультрафильтрации, используя мембрану с исключаемым молекулярным весом 6 килодальтон и диафильтрацию до достижения в растворе, содержащем протеазу, проводимости 2 мСм/см. Содержание протеазы составляет приблизительно 100 мг/мл.

Концентрированный и диафильтрованный раствор протеазы кристаллизуют, доводя pH гидроксидом натрия до значения 8,5, т.е. близкого к pI протеазы (который составляет 9,3). После установления рН раствор оставляют на ночь при комнатной температуре, и происходит кристаллизация.

На следующий день кристаллизованную протеазу собирают центрифугированием.

Пример 3: Ферментный анализ

Протеаза

Субстрат: Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388).

Буфер, применяемый при анализе: 100 мМ янтарной кислоты, 100 мМ HEPES, 100 мМ CHES, 100 мМ CABS, 1 мМ CaCl₂ , 150 мМ KCl, 0,01% Triton® X-100, приведенные к рН 9,0 с использованием HCl или NaOH.

Температура анализа: 25°C.

300 мкл образца разбавленной протеазы смешивают с 1,5 мл буфера для анализа и реакцию начинают добавлением 1,5 мл субстрата pNA (50 мг, растворенные в 1,0 мл ДМСО и дополнительно разбавленные в 45 раз 0,01% Triton® X-100) и, после смешивания, с помощью спектрофотометра наблюдают повышение А₄₀₅ как меру активности протеазы. Перед измерением активности образцы протеазы разводят для уверенности в том, что все измерения активности попадают в линейный участок кривой доза-ответ для анализа.

FIP-анализ протеазы

Активность протеазы можно также определять с использованием FIP-анализа (Fédération Internationale Pharmaceutique), 1 единица FIP = 1 единице Ph.Eur. (European Pharmacopeia). Этот анализ описан, вместе с другими FIP-анализами в: Fédération Internationale Pharmaceutique, Scientific Section: International Commission for the standardisation of pharmaceutical enzymes, a) "Pharmaceutical Enzymes," Editors: R. Ruyssen and A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Belgium (1978), b) European Pharmacopoeia. See also Deemester et al in Lauwers A, Scharpe S (eds): Pharmaceutical Enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385.

Принцип: Субстрат казеин подвергают гидролизу протеазой при рН 7,5 и температуре 35°C. Реакцию останавливают добавлением трихлоруксусной кислоты и негидролизированный казеин отфильтровывают. Количество пептидов, остающихся в растворе, определяют спектрофотометрией при 275 нм.

Определение активности: Протеазную активность определяют как количество пептидов, не преципитированных 5,0%-ным (масса/объем, т.е. 5,0 г/100 мл) раствором трихлоруксусной кислоты, исходя из известной активности FIP контрольного образца порошка поджелудочной железы (контрольный стандарт протеазы).

Материалы и способы:

Раствор казеина:

1,25 г казеина (сухого вещества), например, Calbiochem no. 218680, суспендируют в воде до получения практически прозрачного раствора. рН доводят до 8,0 и раствор разбавляют водой до конечного объема 100 мл. Здесь и в дальнейшем вода обозначает деионизированную воду.

Боратный буфер, рН 7,5:

2,5 г хлорида натрия, 2,85 г тетрабората динатрия и 10,5 г борной кислоты растворяют в 900 мл воды, рН доводят до рН 7,5+/-0,1 и разбавляют до 1000 мл водой.

Фильтровальная бумага:

Складчатые фильтры диаметром 125 мм, например, Schleicher & Schuell no. 1573 . Тест фильтровальной бумаги: 5 мл 5,0%-ной трихлоруксусной кислоты фильтруют через фильтр. Абсорбция фильтрата при 275 нм должна быть менее 0,04 с использованием нефильтрованного раствора трихлоруксусной кислоты в качестве контроля.

Эталон протеазы:

Протеаза (поджелудочной железы) коммерчески доступна от International Commission on Pharmaceuticals Enzymes, Centre for Standards, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent, Belgium. Стандарт имеет маркированную активность (А) в FIP/Ph.Eur.-единиц/г. Точно взвесить количество, соответствующее приблизительно 130 протеазным FIP/Ph.Eur.-единицам. Добавить на кончике шпателя морского песка, смочить несколькими каплями охлажденного до 0°C 0,02М раствора хлорида кальция (рН 6,0-6,2) и растереть полностью стеклянной палочкой с плоским концом. Развести в приблизительно 90 мл такого же охлажденного льдом раствора хлорида кальция и перемешать суспензию в течение 15-30 мин на ледяной бане. Доводят рН до 6,1 и объем доводят до 100 мл таким же раствором хлорида кальция. Разводят 5,0 мл этой суспензии боратным буфером, рН 7,5, до 100 мл. Для определения активности 1,0, 2,0 и 3,0 мл этого раствора используют в качестве контроля (обозначенные ниже как S1, S2 и S3, S - от Stansard).

Тест-суспензия:

Приготовить суспензию образца, как описано выше для протеазного эталона, используя количество образца, эквивалентное приблизительно 260 FIP/Ph.Eur.-единицам. Доводят рН до 6,1 и добавляют воду до 100 мл. Смешивают 5,0 мл этого раствора с 5 мл раствора хлорида кальция. Дополнительно разводят 5 мл этого разведения до 100 мл боратным буфером. Взять 2,0 мл этого раствора для анализа (образец обозначен далее как Un, образец неизвестной (Unknown) активности, количество (number) n).

Методика анализа (тест на активность):

Этот анализ проводят для трех эталонных суспензий (S1, S2 и S3) и для суспензии образца (Un), все в трех параллелях. Для каждого образца достаточно одного контроля (обозначенного S1b, S2b, S3b и Unb, соответственно). Буферный контроль (В) для спектрофотометра получают без образца/стандарта. Боратный буфер добавляют в пробирки следующим образом: буферный контроль (B) 3 мл; образец (Un) 1,0 мл; стандарты (S1, S2 и S3) 2,0, 1,0 и 0 мл, соответственно. Протеазный эталон добавляют к S1, S2 и S3 следующим образом: 1,0, 2,0 и 3,0 мл, соответственно. Тест-суспензию добавляют в пробирки с образцом следующим образом (Un): 2,0 мл. 5 мл трихлоруксусной кислоты добавляют ко всем буферным контролям (S1b, S2b, S3b, Unb и B) с последующим немедленным перемешиванием. Все пробирки закупоривают стеклянными пробками и помещают вместе с раствором субстрата на водяную баню с постоянной температурой (35+/-0,5°C). Когда будет достигнута температура равновесия, в нулевой момент времени, в пробирки S1, S2, S3 и Un добавляют по 2,0 мл раствора казеина, с последующим немедленным перемешиванием. Ровно через 30 минут в каждую пробирку добавляют 5,0 мл трихлоруксусной кислоты и сразу перемешивают. Пробирки извлекают из водяной бани и оставляют при комнатной температуре на 20 минут для завершения преципитации белков. Содержимое каждой пробирки дважды фильтруют через один и тот же фильтр и измеряют поглощение фильтратов при 275 нм, используя фильтрат из пробирки В в качестве буферного контроля. Активность образца (Un) в единицах FIP рассчитывают относительно известной маркированной активности (А) стандартов (S1, S2, S3). Значения поглощения, за вычетом соответствующих буферных контролей (например, поглощение S1 минус поглощение S1b), должны находиться в интервале 0,15-0,60.

Липаза

Субстрат: пара-нитрофенил(pNP)валерат

рН анализа: 7,7

Температура анализа: 40°C

Время реакции: 25 мин

Переваренный продукт желтого цвета имеет характерное поглощение при 405 нм. Это значение определяют спектрофотометрией. Одна единица липазы представляет собой количество фермента, которое при данных условиях анализа освобождает за минуту 1 микромоль титруемой масляной кислоты. Более подробное описание анализа, AF95/6-GB, доступно по запросу в Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark.

Амилаза

Субстрат: таблетки Phadebas (Pharmacia Diagnostics; поперечно-связанный, нерастворимый, полимер крахмала голубого цвета, который смешивают с альбумином бычьей сыворотки и буферным веществом и производят в виде таблеток)

Температура анализа: 37°C

рН анализа: 4,3

Время реакции: 20 мин

После суспендирования в воде крахмал гидролизуют альфа-амилазой с получением растворимых голубых фрагментов. Поглощение полученного голубого раствора, измеренное при 620 нм, представляет собой функцию активности альфа-амилазы. Одна единица активности грибковой альфа-амилазы (1 FAU) представляет собой количество фермента, которое расщепляет 5,26 г крахмала (Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Batch 9947275) в час при стандартных условиях анализа. Более подробное описание анализа, APTSMYQI-3207, доступно по требованию в Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark.

Пример 4: Скрининговый тест in vivo для определения эффективности протеазы

Протеазу, описанную в примере 1, тестируют на самках миниатюрных свиней Göttingen (Ellegaard). У миниатюрных свиней проток поджелудочной железы перевязывают, чтобы вызвать экзокринную недостаточность поджелудочной железы (PEI), и им устанавливают илеоцекальную возвратную канюлю, все под обезболиванием галотаном, и при массе приблизительно 25 кг, как описано в Tabeling et al., J. 1999, Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution, J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263 (hereinafter referred to as "Tabeling 1999"); and in Gregory et al., J. 1999. Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation in "Biology of the Pancreas in Growing Animals" (SG Pierzynowski & R. Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393 (hereinafter referred to as "Gregory et al 1999"). Период в течение по меньшей мере 4 недель предназначен для восстановления после хирургической операции, перед началом исследований. До начала исследования статус PEI каждой свиньи подтверждают при помощи фекального химотрипсинового теста (коммерчески доступен от Immundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Germany, catalogue No. К 6990)

Во время исследований свиньи содержатся в клетках измененного метаболизма при 12:12-часовом цикле смены дня и ночи и имеют свободный доступ к воде и кормятся два раза в день. Для определения эффективности протеазы свиньям дают 250 г тестовой пищи, смешанной с 1 литром воды, 0,625 г Cr₂O₃ (хромоксидный маркер), и с которой непосредственно перед кормлением смешивают различные количества протеазы (0, 1000, 2500, 6000 FIP ед. протеаза/пища (FIP-единицы протеазы, см. пример 3)). Пробная еда содержит 21,4% белка, 51,9% крахмала, 2,6% жира и имеет следующую композицию (г/100 г сухого вещества): рыбный продукт 3,5, мясо птицы 10,2, пшеничная мука 29,5, шелушеный рис 14, картофельный крахмал 11, кукурузный крахмал 14, казеин 5,9, целлюлозная мука 4,3, витамины, минералы и микроэлементы 7,6 (согласно питательным потребностям свиней/поросят, см. например, таблицу А WO 01/58276).

Химус подвздошной кишки собирают на лед в течение в общей сложности 8 часов после первого появления пищевого маркера в подвздошной кишке (зеленый химус) и сохраняют при -20°C до анализа. Между отдельными определениями допускают по меньшей мере один день промывания.

Говоря кратко, замороженные образцы лиофилизируют и определяют количество сухого вещества (DM) и непереваренного белка. DM оценивают по массе после лиофилизирования с последующей 8-часовой инкубацией при 103°C. Непереваренный белок рассчитывают как азот (N), умноженный на фактор 6,25, т.е. непереваренный белок (г/кг)= N (г/кг) × 6,25, как установлено в Animal Nutrition, 4th edition, Chapter 13 (Eds. P. McDonald, R. A. Edwards and J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN 0-582-40903-9). Содержание азота определяют при помощи способа Kjeldahl (Naumann and Bassler, 1993, Die chemische Untersuchung von Futtermitteln. 3 edition VDLUFA-Verlag, Darmstadt, Germany (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten).

Подсчет выявленного переваривания белков в тонкой кишке производят в соответствии с формулой:

выявленное переваривание (%) = 100 - [%Cr₂O₃ в корме/%Cr ₂O₃ в образце × %белка в образце/%белка в корме × 100],

в которой Cr₂ O₃ и белок выражены как г/100 г сухого вещества.

Таблица 2 Влияние ферментной добавки на выявленное переваривание белков
Ферментная добавка	0	1000 ед. FIP	2500 ед. FIP	6000 ед. FIP
Добавка отсутствует	14,7±2,1
Панкреатин		31,7±12,4	59,4±4,9	70,7±0,9
Протеаза		55,2±4,3	61,7±4,8	68,4±3,9
Значения являются средними ± SD

Пример 5: Полный тест на переваривание in vivo

Протеазу, описанную в примере 1, тестируют на самках миниатюрных свиней Göttingen (Ellegaard), у которых перевязывают проток поджелудочной железы, чтобы вызвать PEI, и им устанавливают илеоцекальную возвратную канюлю, все под обезболиванием галотаном, и при массе приблизительно 25 кг, как описано ранее (Tabeling 1999; Gregory et al 1999). Контрольных миниатюрных свиней подготавливают таким же образом, но проток поджелудочной железы оставляют интактным. Период в течение по меньшей мере 4 недель предназначен для восстановления после хирургической операции, перед началом исследований. До начала исследования статус PEI каждой свиньи подтверждают при помощи фекального химотрипсинового теста (см. пример 4).

Свиньи имеют свободный доступ к воде и кормятся дважды в день по 250 г на прием, в 08.00 и 20.00 часов, хорошо перемолотой пищей (как в примере 4), смешанной с 1 литром воды, 0,625 г Cr₂O_3, и с которой непосредственно перед кормлением смешивают различные количества протеазы (0, 6000 FIP ед. протеазы/на прием пищи). Каждая доза дается свиньям в течение 2 недель и химус из подвздошной кишки собирают на лед в течение 12 часов последние 3 дня. Образцы сохраняют при -20°C до анализа.

Говоря кратко, замороженные образцы лиофилизируют и определяют сухое вещество (DM) и общий белок. Определяют DM и общий белок, и переваривание белка в тонкой кишке (выявленное переваривание) рассчитывают, как описано в примере 4.

Переваривание белка в тонкой кишке составляло приблизительно 80% у контрольных (с функционирующей поджелудочной железой) миниатюрных свиней на использованной диете. У необработанной миниатюрной свиньи с PEI переваривание белка значительно снижалось по сравнению с контрольными значениями, но ферментная добавка панкреатина или микробной протеазы в выраженной степени улучшала пищеварение, которое приближалось к контрольным значениям (см. результаты в таблице 3 ниже).

Таблица 3 Влияние ферментной добавки на выявленное переваривание белка
	0 ферментов	6000 ед. на прием
Контроль	81,3±2,6	-
PEI нелеченная	30,5±6,8	-
PEI + панкреатин	-	71,5±4,1
PEI + протеаза	-	65,3±0,7
Средние значения ± SD