интегративный плазмидный вектор для экспрессии генов в дрожжах

Формула изобретения

1. Интегративный плазмидный вектор для экспрессии генов в дрожжах, содержащий селективный маркер для отбора трансформантов в клетках E.coli, сайт начала репликации, сайт интеграции и экспрессионную кассету, в состав которой входят промотор, терминатор транскрипции и селективный маркер, отличающийся тем, что в качестве сайта интеграции используют последовательность ДНК, кодирующую область 18S рРНК.

2. Интегративный вектор по п.1, отличающийся тем, что экспрессионная кассета дополнительно содержит сигнальный пептид.

3. Интегративный вектор по п.2, отличающийся тем, что в качестве селективного маркера для отбора трансформантов в клетках E.coli он содержит селективный маркер bla, в качестве сайта начала репликации он содержит pUC ori, в состав экспрессионной кассеты входит промотор GAP, терминатор транскрипции АОХ1 и селективный маркер HIS4, а в качестве сигнального пептида используют -амилазный сигнальный пептид.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и касается получения мультикопийного плазмидного вектора для интеграции и экспрессии генов.

Одним из наиболее распространенных способов повышения количества целевого продукта при его получении путем микробиологического синтеза является внесение гена, ответственного за синтез продуцируемого вещества, в клетку штамма-реципиента и получение целевого продукта путем культивирования сконструированного рекомбинантного штамма. Как правило, для внесения гена в клетку штамма-реципиента используют вектор, содержащий, в частности, экспрессионную кассету (промотор, терминатор транскрипции, селективный маркер) и сайт интеграции.

Известен мультикопийный экспрессионный вектор pNB268 [ATCC 69355] для экспрессии генов в хромосому дрожжей Yarrowia lipolytica, содержащий промотор гена щелочной протеазы XPR2, селективный маркер LEU2, гомологичный участок для интеграции в заданный локус XPR.

Известен (www.invitrogen.com) мультикопийный экспрессионный вектор рРIС9 для экспрессии генов в хромосому дрожжей Pichia pastoris, который содержит в своем составе сильный индуцибильный промотор 5' АОХ1, терминатор транскрипции 3' АОХ1, селективный маркер HIS4, сайт интеграции 3' АОХ1 и -амилазный сигнальный пептид. Однако индуктором экспрессии клонируемого гена в данном случае является метанол, что осложняет его технологическое использование.

Для экспрессии генов, кодирующих нетоксичные для Pichia pastoris белки предложен конститутивный экспрессионный плазмидный вектор pGAPZ A (www.invitrogen.com), содержащий в своем составе промотор GAP, терминатор транскрипции 3' АОХ1, селективный маркер зеоцин, сайт интеграции 3' АОХ1 и -амилазный сигнальный пептид. Однако штаммы, полученные при использовании вектора pGAPZ A, как правило, не обладают высокой продуктивностью, что, возможно, связано с низким числом копий сайта интеграции АОХ1 на хромосоме дрожжей Pichia pastoris.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала экспрессионных векторов интегративного типа для экспрессии генов в дрожжах, а также конструирование рекомбинантных штаммов дрожжей Pichia pastoris, продуцирующих чужеродные белки.

Поставленная задача решена путем конструирования интеграционного вектора для экспрессии генов в дрожжах, содержащего селективный маркер для отбора трансформантов в клетках E.coli, сайт начала репликации, экспрессионную кассету и сайт интеграции, в качестве которого используют последовательность ДНК, кодирующую область 18S рРНК.

Существенным отличием заявляемого вектора является использование в качестве сайта интеграции при его конструировании последовательности ДНК, кодирующей область 18SpPHK.

Последовательность ДНК, кодирующая область 18S рРНК, имеет в клетках дрожжей около 20 копий [Int. J. Syst. Bacteriol, 1996, 46, 542-549], и ее использование в качестве сайта интеграции, по нашему мнению, создает условия для множественной интеграции экспрессионной кассеты в хромосому клетки-хозяина и, следовательно, приводит к увеличению продуктивности штамма.

Заявляемый мультикопийный интеграционный вектор для экспрессии генов в дрожжах конструируют с использованием стандартных генноинженерных методик.

Составные части экспрессионной кассеты, входящей в состав заявляемого вектора, варьируются в зависимости от вида клетки-хозяина, природы экспрессируемого белка, предполагаемого технологического процесса и т.д.

Так, экспрессионные кассеты, используемые в Pichia pastoris, могут содержать в качестве промотора, например, АОХ1 либо GAP, а в качестве селективного маркера - Zeocin либо HIS4, экспрессионные кассеты, используемые в Saccharomyces cerevisiae, могут содержать в качестве промотора GAL1 либо ADH1, а в качестве селективного маркера - HIS3 либо URA3 и т.д.

Если вектор предназначен для экспрессии генов секретируемых белков, экспрессионная кассета дополнительно содержит сигнальный пептид, например -амилазный сигнальный пептид из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

В частности, для экспрессии генов, кодирующих нетоксичные для Pichia pastoris белки, предложен вектор рР10, который в качестве сайта интеграции содержит последовательность ДНК, кодирующую область 18S рРНК, в качестве селективного маркера для отбора трансформантов в клетках E.coli содержит селективный маркер bla, в качестве сайта начала репликации содержит pUC ori, в состав экспрессионной кассеты входит промотор GAP, терминатор транскрипции АОХ1, селективный маркер HIS4, а в качестве сигнального пептида вектор содержит - амилазный сигнальный пептид (фиг.1).

Поставленная задача решена также путем конструирования рекомбинантной плазмиды pP10PhyA-Cf для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена из Citrobacter frendii, ответственного за синтез фермента фитазы PhyA-Cf. Сконструированная плазмида имеет размер 11250 п.о. и состоит из следующих элементов (фиг.2):

1) фрагмент 5' 18S рРНК: 1-269 п.о.;

2) промотор GAP: 270-1026 п.о.;

3) -амилазный сигнальный пептид: 1029-1295 п.о.;

4) ген фитазы PhyA-Cf: 1304-2534 п.о.;

5) терминатор транскрипции 3' АОХ1: 2552-2885 п.о.;

6) HIS4 ORF: 3279-5813 п.о.;

7) фрагмент 3' 18S рРНК: 6085-6774 п.о.;

8) pUC ori: 7974-8648 п.о.;

9) ген резистентности к ампициллину: 9448-10308 п.о.

Поставленная задача решена также путем конструирования рекомбинантной плазмиды pP10PhyA-Op для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена из Obesumbacterium proteus, ответственного за синтез фермента фитазы PhyA-Op. Сконструированная плазмида имеет размер 11243 п.о. и состоит из следующих элементов (фиг.3):

1) фрагмент 5' 18S рРНК: 1-269 п.о.;

2) промотор GAP: 270-1026 п.о.;

3) -амилазный сигнальный пептид: 1029-1295 п.о.;

4) ген фитазы PhyA-Op: 1304-2518 п.о.;

5) терминатор транскрипции 3' АОХ1: 2552-2885 п.о.;

6) HIS4 ORF: 3279-5813 п.о.;

7) фрагмент 3' 18S рРНК: 6085-6774 п.о.;

8) pUC ori: 7974-8648 п.о.;

9) ген резистентности к ампициллину: 9448-10308 п.о.

Поставленная задача решена также путем конструирования рекомбинантной плазмиды pP10PLC-Bc для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена из Bacillus cereus, ответственного за синтез фермента фосфолипазы С PLC-Bc. Сконструированная плазмида имеет размер 10770 п.о. и состоит из следующих элементов (фиг.4):

1) фрагмент 5' 18S рРНК: 1-269 п.о.;

2) промотор GAP: 270-1026 п.о.;

3) -амилазный сигнальный пептид: 1029-1295 п.о.;

4) ген фосфолипазы С PLC-Bc: 1304-2054 п.о.;

5) терминатор транскрипции 3' АОХ1: 2088-2421 п.о.;

6) HIS4 ORF: 3279-5813 п.о.;

7) фрагмент 3' 18S рРНК: 6085-6774 п.о.;

8) pUC ori: 7974-8648 п.о.;

9) ген резистентности к ампициллину: 9448-10308 п.о.

Задача решена также путем конструирования штамма Pichia pastoris PhyA-Cf-1 ВКПМ Y-3357 - продуцента фитазы PhyA-Cf.

Задача решена также путем конструирования штамма Pichia pastoris PhyA-Op-1 ВКМП Y-3358 - продуцента фитазы PhyA-Ор.

Задача решена также путем конструирования штамма Pichia pastoris PLC-Bc-1 ВКПМ Y-3359 - продуцента фосфолипазы С PLC-Bc.

Заявляемый вектор рР10 конструируют следующим образом.

Фрагменты ДНК, кодирующие промотор GAP и область 18S рРНК, амплифицируют полимеразной цепной реакцией. Амплифицированную последовательность GAP промотора по тупым концам лигируют в вектор pPIC9 (Invitrogen), из которого по сайтам BglII и BamHI предварительно вырезают последовательность 5' АОХ1 промотора. Получают вектор pPIC9G.

Амплифицированную последовательность гена, кодирующего область 18S рРНК, по тупым концам лигируют в вектор pGEM5Zf(-) (Promega), предварительно расщепленный рестриктазами по сайтам EcoRV и HincII, и получают вектор pNS4, который далее расщепляют рестриктазой по сайту Есо147I и лигируют с фрагментом ДНК, кодирующим экспрессионную кассету из pPIC9G, который предварительно расщепляют рестриктазой PaeI и затупляют.

Сконструированный вектор рР10 используют далее для получения рекомбинантных плазмид, предназначенных для экспрессии генов целевых белков в дрожжах Pichia pastoris.

Важной генетической характеристикой вектора рР10 является набор фрагментов ДНК определенных размеров, который образуется в ходе полимеразной цепной реакции, проведенной с использованием специально подобранных селективных праймеров, сконструированных на основе его нуклеотидной последовательности.

Данная характеристика может быть использована для идентификации штаммов, полученных на основе данного вектора.

Рекомбинантные плазмиды конструируют путем встраивания гетерологичного гена в вектор рР10 по сайтам EcoRI, NotI или SnaB1 с использованием традиционных методов.

Штаммы Pichia pastoris PhyA-Cf-1 - продуцент фитазы PhyA-Cf, Pichia pastoris PhyA-Op-1 - продуцент фитазы PhyA-Op и Pichia pastoris PLC-Bc-1 - продуцент фосфолипазы С PLC-Bc, получают путем трансформации клеток Pichia pastoris GS 115 (his4) ВКПМ Y2837 рекомбинантной плазмидой pP10PhyA-Cf, pP10 PhyA-Op или рР10 PLC-Bc соответственно. Трансформанты отбирают на минимальной среде М9 [T.Maniatis et. al. Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 390, 1982] по способности к росту без источника гистидина.

У отобранных трансформантов определяют активность фитазы по методу Фиске-Суббарроу [J.Biol. Chem. 66, 376-400] или активность фосфолипазы по модифицированному методу Куриоки [Biotecnology Letters 26, 1475-1479, 2004] и отбирают клон, обладающий максимальной фитазной или фосфолипазной активностью соответственно.

Штамм Pichia pastoris PhyA-Cf-1 - продуцент фитазы PhyA-Cf, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ) и имеет регистрационный номер ВКПМ Y-3357.

Штамм хранят в среде с глицерином при температуре -70°С или в лиофильно-высушенном виде при температуре +4°С.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки

При росте на среде «Malt agar» [The yeasts of toponomic study. Ed. N.J.W. Kreger-van Rij, Amsterdam, Elsevier Sci. Publ.B.V., 1984, p.421] клетки образуют гладкие круглые колонии с матовой поверхностью светло-кремового цвета.

При росте на среде «Malt extract» [The yeasts of toponomic study. Ed. N.J.W. Kreger-van Rij, Amsterdam, Elsevier Sci. Publ.B.V., 1984, p.421] клетки образуют интенсивную ровную суспензию. Культура имеет характерный запах дрожжей.

На среде «Malt agar» после 3 дней культивирования культура образует клетки округлой, слегка овальной формы размером 5-10 мкм, часть клеток имеет на поверхности почки или соединена с дочерними клетками.

Культуральные признаки

Клетки хорошо растут на полной органической среде YEPD следующего состава (мас%): пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, глюкоза - 2 (или глицерин - 1), вода - остальное.

Кроме того, клетки хорошо растут на минимальной среде М9, а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих в качестве источника углерода глюкозу или глицерин.

Клетки штамма отличаются слабым ростом на средах, содержащих в качестве источника углерода метанол.

Физиолого-биохимические признаки

Клетки растут при температуре от 4°С до 37°С. Оптимальной температурой выращивания является 30°С.

Оптимум рН для роста составляет 4,5-6,5.

В качестве источника углерода клетки используют глюкозу, глицерин, метанол. В качестве источника азота - минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевину.

Клетки способны к аэробному и анаэробному росту.

Штамм не нуждается в гистидине для своего роста.

Штамм Pichia pastoris PhyA-Op-1 - продуцент фитазы PhyA-Op, депонирован в ВКПМ, имеет регистрационный номер ВКПМ Y-3358.

Клетки хранят в глицерине при температуре -70°С или в лиофильно-высушенном виде при температуре +4°С.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки

При росте на среде «Malt agar» клетки образуют гладкие круглые колонии с матовой поверхностью светло-кремового цвета.

При росте на среде «Malt extract» клетки образуют интенсивную ровную суспензию. Культура имеет характерный запах дрожжей.

На среде «Malt agar» после 3 дней культивирования культура образует клетки округлой, слегка овальной формы размером 5-10 мкм, часть клеток имеет на поверхности почки или соединена с дочерними клетками.

Культуральные признаки

Клетки хорошо растут на полной органической среде YEPD, на минимальной среде М9, а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих в качестве источника углерода глюкозу или глицерин.

Клетки штамма отличаются слабым ростом на средах, содержащих в качестве источника углерода метанол.

Физиолого-биохимические признаки

Клетки растут при температуре от 4°С до 37°С. Оптимальной температурой выращивания является 30°С.

Оптимум рН для роста составляет 4,5-6,5.

В качестве источника углерода клетки могут использовать глюкозу, глицерин, метанол. В качестве источника азота - минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевину.

Клетки способны к аэробному и анаэробному росту.

Штамм не нуждается в гистидине для своего роста.

Штамм Pichia PLC-Bc-1 - продуцент фосфолипазы С PLC-Bc, депонирован в ВКПМ, имеет регистрационный номер ВКПМ Y-3359.

Штамм хранят в среде с глицерином при температуре -70°С или в лиофильно-высушенном виде при температуре +4°С.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки

При росте на среде «Malt agar» клетки образуют гладкие круглые колонии с матовой поверхностью светло-кремового цвета.

При росте на среде «Malt extract» клетки образуют интенсивную ровную суспензию. Культура имеет характерный запах дрожжей.

На среде «Malt agar» после 3 дней культивирования культура образует клетки округлой, слегка овальной формы размером 5-10 мкм, часть клеток имеет на поверхности почки или соединена с дочерними клетками.

Культуральные признаки

Клетки хорошо растут на полной органической среде YEPD, на минимальной среде М9, а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих в качестве источника углерода глюкозу или глицерин.

Клетки штамма отличаются слабым ростом на средах, содержащих в качестве источника углерода метанол.

Физиолого-биохимические признаки

Клетки растут при температуре от 4°С до 37°С. Оптимальной температурой выращивания является 30°С.

Оптимум рН для роста составляет 4,5-6,5.

В качестве источника углерода клетки могут использовать глюкозу, глицерин, метанол. В качестве источника азота - минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевину.

Клетки способны к аэробному и анаэробному росту.

Штамм не нуждается в гистидине для своего роста.

Изобретение проиллюстрировано следующими чертежами.

Фиг.1 - схема вектора рР10.

Фиг.2 - схема рекомбинантной плазмиды pP10PhyA-Cf.

Фиг.3 - схема рекомбинантной плазмиды pP10PhyA-Op.

Фиг.4 - схема рекомбинантной плазмиды pP10PLC-Bc.

Пример 1. Конструирование вектора рР10

Вектор pPIC9 (Invitrogen, № К171001) расщепляют ферментами рестрикции BglII и BamHI в буфере 2Х Tango^TM (yellow) (Fermentas) для удаления последовательности, кодирующей 5' АОХ1 промотор. Реакцию проводят в течение 1 часа при 37°С и останавливают прогреванием при 65°С в течение 10 мин. BglII-BamHI фрагмент вектора pPIC9 (7052 п.о.) выделяют электроэлюированием из 1% агарозного геля и дефосфорилируют бактериальной щелочной фосфатазой.

Из штамма Pichia pastoris GS115 (his4) ВКПМ Y2837 фенольным методом [T.Mamatis et. al. Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, v.3, 1982] выделяют хромосомную ДНК, которая служит матрицей для синтеза GAP промотера. Последовательность, кодирующую GAP промотор, амплифицируют методом ПЦР. Для ПЦР-синтеза используют праймеры, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей GAP промотор (23-SI, 29-SI):

прямой - 5'-aaggatccGCAGCGGATCCTTTTTTGTAGAA-3', и

обратный - 5'-aaagatctAAAGATCTTTGATAGTTGTTCAATTGATT-3'.

На 5'-конце каждого праймера находится сайт рестрикции для эндонуклеазы, образующей липкие концы: BamHI для прямого праймера и BglII для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом).

Для проведения полимеразной цепной реакции используют 100 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 нг ДНК-матрицы, 1 мкМ праймера 23-SI, 1 мкМ праймера 29-SI, 2,5 ед. Tag-полимеразы 10 мкл 10х Tag-буфера, 1,5 мМ MgCl ₂, 0,8 мМ dNTP. Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (1 мин), 59°С - отжиг (1 мин), 72°С - полимеризация (1 мин). Всего проводят 30 циклов амплификации. Амплифицированный фрагмент ДНК очищают при помощи «DNA extraction KIT» (Fermentas).

Полученный таким образом ПЦР-амплификат гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BglII и BamHI, очищают в агарозном геле и лигируют с BglII - BamHI фрагментом вектора рРIС9 (7052 п.о.), используя ДНК-лигазу фагаТ4.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Escherichia coli (E.coli) С600, приготовленные накануне обработкой хлористым кальцием. После стандартной процедуры трансформации (0°С - 40 мин, 42°С - 2 мин, 0°С - 5 мин) клетки разводят в 10 раз средой LB (Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984, с. 84), подращивают в течение одного часа и высевают на агар LB, содержащий ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Посевы инкубируют при 37°С.

На следующие сутки выросшие ампициллинрезистентные колонии тестируют с помощью вышеприведенных праймеров и отбирают позитивные клоны, из которых выделяют плазмидную ДНК по стандартной методике (Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984, с.89). Выделенные плазмидные ДНК гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BglII и BamHI и проверяют на наличие вставок, соответствующих последовательности, кодирующей GAP промотор. Из клонов, плазмидная ДНК которых содержит последовательность, кодирующую GAP промотор, выделяют вектор pPIC9G.

Хромосомальная ДНК, выделенная из штамма Pichia pastoris GS 115 (his4) ВКПМ Y2837, как описано выше, служит матрицей для ПЦР-синтеза фрагмента последовательности, кодирующей область 18S рРНК. Для амплификации используют праймеры, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей область 18S рРНК (NS1, NS2):

прямой - 5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3', и

обратный - 5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3'.

Условия при которых проводят полимеразную цепную реакцию описаны выше.

Полученный ПЦР-амплификат очищают в агарозном геле и лигируют (используя ДНК-лигазу фагаТ4) с вектором pGEM5Zf(-), который предварительно расщепляют рестриктазами по сайтам EcoRV и HincII.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli C600, как описано выше. Отбирают ампициллинрезистентный клон, выделяют из него плазмиду, проверяют ее на наличие вставок методом ПЦР, используя вышеописанные праймеры. Получают новый плазмидный вектор pNS4.

Вектор pPIC9G расщепляют эндонуклеазой рестрикции PaeI, липкие концы превращают в тупые с помощью Pfu полимеразы и из агарозного геля вырезают фрагмент длиной 3889 п.о. Вырезанный фрагмент очищают при помощи «DNA extraction KIT» и лигируют с вектором pNS4, предварительно расщепленным эндонуклеазой рестрикции Есо147I.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli C600, как описано выше. Отбирают ампициллинрезистентные клоны, выделяют из них плазмидную ДНК, проверяют ее на наличие вставляемого фрагмента методом ПЦР, используя все вышеописанные праймеры. В результате получен вектор рР10 (фиг.1).

На основе нуклеотидной последовательности вектора рР10 конструируют праймеры, которые используют для генетической характеристики полученного вектора:

прямой (N1) - 5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3', и

обратный (N2) - 5'-AAAGATCTTTGATAGTTGTTCAATTGATT-3',

прямой (N3) - 5'-AGGCCCCGTGGCCGGGGGACT-3', и

обратный (N4) - 5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3'.

Полимеразную реакцию проводят, как описано выше, используя в качестве праймеров пары N1, N2 и N3, N4.

Размер полученных в результате ПЦР фрагментов определяют гельэлектрофоретически с использованием красителя (бромистый этидий) (Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984, с.84).

При использовании праймеров N1 и N2 в ходе полимеразной цепной реакции нарабатывается фрагмент размером 2300 пар нуклеотидов, а при использовании праймеров N3 и N4 - фрагмент размером 380 пар нуклеотидов.

Размер образующихся фрагментов ДНК является индивидуальной характеристикой заявляемого вектора и позволяет идентифицировать штаммы, полученные с использованием вектора рР10.

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмиды pP10PhyA-Cf

Из штамма Citrobacter freundii ВКПМ В-4090 фенольным методом выделяют хромосомную ДНК, которая служит матрицей для синтеза гена фитазы PhyA-Cf.

Последовательность, кодирующую ген фитазы PhyA-Cf, амплифицируют методом ПЦР. Для ПЦР-синтеза используют праймеры, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей ген фитазы PhyA-Cf (pic3638D, pic3638R). На 5'-конце каждого праймера внесен сайт рестрикции для эндонуклеазы, образующей липкие концы: EcoRl для прямого праймера и Not1 для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом):

прямой - 5'-aggaattcGAAGAGCAGAACGGTATGA-3', и

обратный - 5'-agcggccgcTTACTTATTCCGTAACTG-3'.

Для проведения полимеразной цепной реакции используют 100 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 нг ДНК-матрицы, 1 мкМ праймера pic3638D, 1 мкМ праймера pic3638R, 2,5 ед. Tag-полимеразы 10 мкл 10х Tag-буфера, 1,5 мМ MgCl₂, 0,8 мМ dNTP. Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (1 мин), 57°С - отжиг (1 мин), 72°С - полимеризация (1 мин). Всего проводят 30 циклов амплификации. Амплифицированный фрагмент ДНК очищают при помощи «DNA extraction KIT».

Полученный таким образом ПЦР-амплификат гидролизуют эндонуклеазами рестрикции EcoR1 и Not1 (Fermentas), очищают в агарозном геле и лигируют с вектором рР10, расщепленным ферментами рестрикции по сайтам EcoR1-Not1, используя ДНК-лигазу фагаТ4.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli C600, как описано в примере 1.

Отбор трансформантов, выделение плазмидной ДНК и гидролиз осуществляют, как описано в примере 1, с использованием праймеров pic3638D и pic3638R и эндонуклеаз рестрикции EcoR1 и Not1. В результате получают рекомбинантную плазмиду pP10PhyA-Cf (фиг.2).

Плазмиду pP10PhyA-Cf гидролизуют рестриктазой BglII, электроэлюируют в 1% агарозном геле и используют для трансформации клеток дрожжей, как описано в примере 5.

Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмиды pP10PhyA-Op

Из штамма Obesumbacterium proteus ВКПМ В-6897 фенольным методом выделяют хромосомную ДНК, которая служит матрицей для синтеза гена фитазы PhyA-Op.

Последовательность, кодирующую ген фитазы PhyA-Op, амплифицируют методом ПЦР. Для ПЦР-синтеза используют праймеры, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей ген фитазы PhyA-Cf (Ob2, Оb3). На 5'-конце каждого праймера внесен сайт рестрикции для эндонуклеазы, образующей липкие концы: EcoR1 для прямого праймера и Not1 для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом):

прямой - 5'-aa gaattcAGTGAAACCGAACCTTCC-3', и

обратный - 5'-aagcggccgcTTATAATTATTGGCAC-3'.

Реакцию ПЦР, лигирование с вектором рР10, трансформацию клеток E.coli C600 и выделение рекомбинантной плазмиды pP10PhyA-Op осуществляют, как описано в примере 2, используя для реакции ПЦР праймеры Оb2 и Оb3 (фиг.3).

Плазмиду pP10PhyA-Op гидролизуют рестриктазой BglII, электроэлюируют в 1% агарозном геле и используют для трансформации клеток дрожжей, как описано в примере 6.

Пример 4. Конструирование рекомбинантной плазмиды pP10PLC-Bc

Из штамма Bacillus cereus ATCC 14579 фенольным методом выделяют хромосомную ДНК, которая служит матрицей для синтеза гена фосфолипазы С PLC-Вс.

Последовательность, кодирующую ген фосфолипазы С PLC-Bc, амплифицируют методом ПЦР. Для ПЦР-синтеза используют праймеры, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей ген фосфолипазы С PLC-Bc (Plc1, Рlс2). На 5'-конце каждого праймера внесен сайт рестрикции для эндонуклеазы Есо 47III для прямого праймера и Not1 для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом):

прямой - 5'-atataagcgct GGTCTGCTGAAGATAAACA-3', и

обратный - 5'-aa gcggccgcTTAACGATTTCCGTACGTAT-3'.

Для проведения полимеразной цепной реакции используют 100 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 нг ДНК-матрицы, 1 мкМ праймера Plc1, 1 мкМ праймера Рlс2, 2,5 ед. Tag-полимеразы 10 мкл 10х Tag-буфера, 1,5 мМ MgCl₂, 0,8 мМ dNTP. Реакцию осуществляют по следующей схеме: 94°С - денатурирование (1 мин), 59°C - отжиг (1 мин), 72°С - полимеризация (1 мин). Всего проводят 30 циклов амплификации. Амплифицированный фрагмент ДНК очищают при помощи «DNA extraction KIT».

Полученный таким образом ПЦР-амплификат гидролизуют эндонуклеазами рестрикции Есо 47III и Not1 (Fermentas), очищают в агарозном геле и лигируют с вектором рР10, расщепленным ферментами рестрикции по сайтам SnaB1 - Not1, используя ДНК-лигазу фагаТ4.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli C600, как описано в примере 1.

Отбор трансформантов, выделение плазмидной ДНК и гидролиз осуществляют, как описано в примере 1, с использованием праймеров Plc1 и Рlс2 и эндонуклеаз рестрикции Есо 47III и Not1. Получают рекомбинантную плазмиду pP10PLC-Bc (фиг.4).

Плазмиду pP10PLC-Bc гидролизуют рестриктазой Bgl II, электроэлюируют в 1% агарозном геле и используют для трансформации клеток дрожжей, как описано в примере 7.

Пример 5. Получение штамма дрожжей Pichia pastoris PhyA-Cf-1 ВКПМ Y-3357 - продуцента фитазы PhyA-Cf

Для получения штамма дрожжей Pichia pastoris PhyA-Cf-1 продуцента фитазы PhyA-Cf клетки дрожжей штамма Pichia pastoris GS115 (his4) ВКПМ Y-2837 трансформируют плазмидой pP10PhyA-Cf.

1 мл ночной культуры клеток дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-2837 выращивают в 100 мл среды YEPD при 30°С до достижения культурой оптической плотности, соответствующей 2 ед. поглощения при длине волны 600 нм. Клетки дважды промывают стерильной водой, после чего суспендируют в 0,3 мл 100 мМ раствора ацетата лития и инкубируют при 30°С в течение 30 мин. К 50 мкл полученной суспензии клеток добавляют 1 мкг плазмидной ДНК, 50 мкг ДНК спермы лосося, предварительно денатурированной нагреванием (10 мин при 100°С), и 0,3 мл раствора 100 мМ ацетата лития, содержащего 40% полиэтиленгликоля 4000. Далее пробу инкубируют 30 мин при 30°С и 20 мин при 42°С, помещают на 15 секунд в ледяную баню и центрифугируют 10 секунд при 10000 об/мин. Клетки суспендируют в 1 мл стерильной воды и высевают на твердую среду М9 с добавлением 0,3 об.% микроэлементов. Клоны трансформантов выращивают 2 суток.

Полученные трансформанты высевают в жидкую среду YEPD и выращивают при 30°С до стационарной фазы роста в течение 2 суток. Далее клетки осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 5 минут, отбирают 100 мкл супернатанта и определяют фитазную активность по накоплению в реакционной среде свободного фосфат-иона, детектируемого методом Фиске-Субарроу. Одна единица активности фермента соответствует высвобождению 1 мкМ фосфата за 1 минуту. Активность фермента измеряют при помощи спектрофотометра при длине волны 700 нм.

Трансформант, показавший наибольшую активность фитазы PhyA-Cf в культуральной жидкости, заложен на хранение и депонирован в ВКПМ под номером Y-3357.

В отличие от исходного штамма полученный штамм не нуждается в гистидине для своего роста.

Для доказательства наличия вектора рР10 в геноме полученного штамма дрожжей Pichia pastoris PhyA-Cf-1 используют генетическую характеристику, основанную на получении фрагментов ДНК заданного размера. Фрагменты нарабатывают в ходе полимеразной цепной реакции с использованием праймеров N1, N2, N3 и N4 (пример 1).

При использовании праймеров N1 и N2 получают фрагмент ДНК размером 2300 пар нуклеотидов, при использовании праймеров N3 и N4 - фрагмент ДНК размером 380 пар нуклеотидов.

Пример 6. Получение штамма дрожжей Pichia pastoris PhyA-Op-1 ВКПМ Y-3358 - продуцента фитазы PhyA-Ор

Для получения штамма дрожжей Pichia pastoris PhyA-Op-1 - продуцента фитазы PhyA-Op, клетки дрожжей штамма GS115 (his4) ВКПМ Y2837 трансформируют плазмидой pP10PhyA-Op.

Клетки дрожжей выращивают в 100 мл среды YEPD и осуществляют трансформацию, как описано в примере 5. Клоны трансформантов выращивают 3 суток.

Полученные трансформанты высевают в жидкую среду YEPD, выращивают при 30°С до стационарной фазы роста в течение 2 суток и определяют фитазную активность культуральной жидкости, как описано в примере 5.

Трансформант, показавший наибольшую активность фитазы PhyA-Op в культуральной жидкости, заложен на хранение и депонирован в ВКПМ под номером Y-3358.

Идентификацию штамма Pichia pastoris PhyA-Op-1, полученного с использованием плазмиды pP10PhyA-Op, осуществляли по примеру 5.

При использовании праймеров N1 и N2 получают фрагмент ДНК размером 2300 пар нуклеотидов, при использовании праймеров N3 и N4 - фрагмент ДНК размером 380 пар нуклеотидов.

Пример 7. Получение штамма дрожжей Pichia pastoris PLC-Bc-1 ВКПМ Y-3359 - продуцента фосфолипазы С PLC-Bc

Для получения штамма дрожжей Pichia pastoris PLC-Bc-1 - продуцента фосфолипазы С PLC-Bc, клетки дрожжей штамма GS115 (his4) ВКПМ Y2837 трансформируют плазмидой pP10PLC-Bc.

Клетки дрожжей выращивают в 100 мл среды YEPD, трансформацию осуществляют как описано в примере 5. Клоны трансформантов выращивают 3 суток.

Полученные трансформанты высевают в жидкую среду YEPD и выращивают при 30°С до стационарной фазы роста в течение 2 суток. Далее клетки осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 5 минут, отбирают 100 мкл супернатанта и определяют фосфолипазную активность по накоплению в реакционной среде паранитрофенола, детектируемого методом Куриоки. Одна единица активности фермента соответствует количеству фермента, которое разлагает 1 мкМ паранитрофенилфосфатидилхолина за 1 минуту. Активность фермента измеряют при помощи спектрофотометра при длине волны 410 нм.

Трансформант, показавший наибольшую активность фосфолипазы С PLC-Bc в культуральной жидкости, заложен на хранение и депонирован в ВКПМ под номером Y-3359.

Идентификацию штамма Pichia pastoris PLC-Bc-1, полученного с использованием плазмиды pP10PLC-Bc, осуществляли по примеру 5.

При использовании праймеров N1 и N2 получают фрагмент ДНК размером 2300 пар нуклеотидов, при использовании праймеров N3 и N4 - фрагмент ДНК размером 380 пар нуклеотидов.

Пример 8. Культивирование штамма-продуцента Pichia pastoris PhyA-Cf-1

Посевную культуру штамма-продуцента Pichia pastoris PhyA-Cf-1 ВКПМ Y-3357 выращивают в 5 мл жидкой среды YEPD при 30°С в течение ночи. Полученной ночной культурой инокулируют колбу Эрленмейера объемом 750 мл, содержащую 100 мл среды YEPD, в соотношении 1:100. Культуру инкубируют при 30°С и интенсивном встряхивании до достижения стационарной фазы в течение 2 суток. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 5 минут, супернатант переносят в другую емкость, отбирают аликвоту объемом 100 мкл и определяют фитазную активность, как описано в примере 5.

Фитазная активность составляет 700 ед/мл культуральной жидкости.

Пример 9. Культивирование штамма-продуцента Pichia pastoris PhyA-Op-1

Штамм-продуцент Pichia pastoris PhyA-Op-1 ВКПМ Y-3358 выращивают, как описано в примере 8, и определяют фитазную активность, как описано в примере 5.

Фитазная активность составляет 500 ед./мл культуральной жидкости.

Пример 10. Культивирование штамма-продуцента Pichia pastoris PLC-Bc-1

Штамм-продуцент Pichia pastoris PLC-Bc-1 ВКПМ Y-3359 выращивают, как описано в примере 8, и определяют фосфолипазную активность, как описано в примере 7.

Фосфолипазная активность составляет 200 ед./мл культуральной жидкости.