хромогенная селективная питательная среда дагхром агар для выделения и идентификации кишечной палочки и других колиформных бактерий

Формула изобретения

Хромогенная селективная питательная среда для выделения и идентификации E.coli и других колиформных бактерий, содержащая панкреатический гидролизат казеина, агар, фосфатный буфер, хромогенную микстуру, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит сухой питательный бульон из каспийской кильки, парааминобензойную кислоту, желчные соли, бриллиантовый зеленый, а хромогенная микстура содержит 2-нитрофенил -D-галактопиранозид и 5-бром-4-хлор-3-индол -D-глюкуронид циклогексиламмонийной соли, в качестве фосфатного буфера - калий фосфорно-кислый однозамещенный при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

сухой питательный бульон из каспийской кильки	5,0-10,0
панкреатический гидролизат казеина	14,0-16,0
парааминобензойная кислота	0,01-0,015
калий фосфорно-кислый однозамещенный	0,2-0,3
2-нитрофенил -D-галактопиранозид	0,3-0,4
5-бром-4-хлор-3-индол -D-глюкуронид
циклогексиламмонийной соли	0,5-0,6
желчные соли	1,5-2,0
бриллиантовый зеленый	0,0002-0,0003
агар микробиологический	14,0-16,0

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к санитарной и клинической микробиологии, и может быть использовано при исследовании различного материала с подозрением на кишечную палочку и другие колиформные бактерии.

Проблема острых кишечных инфекций (ОКИ) чрезвычайно актуальна в современной медицине, о чем свидетельствуют спорадические вспышки тех или иных острых кишечных заболеваний.

Источником заражения ОКИ являются инфицированные объекты внешней среды - питьевая вода, воды открытых водоемов, предметы обихода, пищевые продукты и их компоненты, особенно промышленного изготовления. В связи с тем, что ОКИ являются заболеваниями с фекально-оральным путем передачи инфекции, важное значение для предупреждения заболевания имеет регулярный санитарно - эпидемиологический надзор за объектами внешней среды, включающий в себя микробиологические исследования окружающей среды и пищевых продуктов с целью оценки их безопасности для здоровья человека.

Для предупреждения внутрибольничных инфекций (ВБИ) также проводят регулярные санитарно-микробиологические исследования на обсемененность в лечебно-профилактических учреждениях: смывы с различных объектов стационара, инструментов, пищеблока и т.п.

Согласно действующим Методическим указаниям по проведению санитарно-микробиологического анализа питьевой воды (МУК 4.2.1018-01) и микробиологическому контролю продуктов питания и их компонентов (МУК 4.2.577-96) в исследуемом материале проводят определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП), так называемых общих колиформных бактерий, как санитарно - показательных микроорганизмов, к которым в соответствии с принятой международной номенклатурой относят грамотрицательные неспорообразующие палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре (37±1)°С в течение 24-48 ч и являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella и Serratia, т.е. учитываются как цитратотрицательные, так и цитратположительные варианты БГКП.Наличие БГКП в исследуемом образце характеризует общее микробное загрязнение. Индикатором свежего фекального загрязнения и косвенным показателем возможного загрязнения патогенными возбудителями кишечных инфекций является непосредственное присутствие в исследуемом материале E.coli - неутилизирующих цитрат, грамотрицательных бесспоровых палочек, способных расти и ферментировать лактозу при температурах выше температуры человека и теплокровных животных (44-44,5)°С.

Известны питательные среды для санитарно-микробиологических исследований объектов внешней среды (1, 2, 3, 4, 5).

К недостаткам указанных сред следует отнести их слабые дифференцирующие свойства из-за сходства биохимических реакций колиформных бактерий (БГКП) по отношению к лактозе, вследствие чего все колонии БГКП идентично окрашиваются. Кроме того, существенным недостатком традиционных сред Эндо и Левина является неспособность их подавлять роение протеев: в случае присутствия в микробной ассоциации роящихся форм протея выделение возбудителя в чистой культуре невозможно, что препятствует дифференциации и идентификации микроорганизмов. По этим причинам для выявления свежего фекального загрязнения требуется обязательная постановка дополнительных идентификационных тестов - температурного, индольного, реакции с метиловым красным, реакции Фогес-Проскауэра, т.е. с ацетилметилкарбинолом и цитратного (ТИМАЦ - тест) (4.5), что удлиняет сроки идентификации выделенных микроорганизмов (не менее 3-х суток) и усложняет сам процесс дифференциации и идентификации. В то же время известно, что при проведении микробиологических исследований важным условием является быстрота получения результатов, что способствует ранней диагностике.

Наиболее близким решением задачи того же назначения по совокупности признаков и достигаемому эффекту является сухая питательная среда фирмы "Fluka" - HiCrome ECC Selective Agar, в состав которой входят в г/л дистиллированной воды:

Agar	10.0 g/1
Casein enzymic hydrolisate	3.3 g/l
Chromogenic mixture	0.43 g/l
Disodium hydrogen phosphate	1 g/l
Peptone, special	6.0 g/l
Sodium chloride	2 g/l
Sodium dihydrogen phosphate	1 g/l
Sodium pyruvite	1 g/l
Sorbitol	1 g/l
Tergitol 7	0.15 g/l
Tryptophan	1 g/l

Эта среда обеспечивает в течение 24 ч идентификацию колиформных бактерий, в т.ч. Е.coli, с помощью хромогенных индикаторов (субстратов), входящих в состав среды и позволяющих выявить у обнаруженных микроорганизмов группоспецифический (для колиформ) фермент - -галактозидазу и видоспецифический (для E.coli) фермент -глюкуронидазу(6).

Отечественная промышленность аналогичных сред не выпускает.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании HiCrome ECC Selective Agar-среды, принятой за прототип, является неспособность ее подавить роение протея и сложность в приготовлении, т.к. из-за присутствия в среде термолабильных компонентов требуется щадящая стерилизация путем обработки среды в открытой струе пара.

Цель изобретения - получение отечественной среды аналогичного назначения с улучшенными дифференцирующими свойствами и упрощение процесса ее приготовления. Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предлагаемая питательная среда для подавления роения протея и исключения необходимости стерилизации ее содержит бриллиантовый зеленый и желчные соли. Для стимуляции роста и усиления проявления ферментативных реакций микроорганизмов среда содержит сухой питательный бульон из каспийской кильки и парааминобензойную кислоту. Для обеспечения поддержания рН в процессе роста микроорганизмов среда содержит фосфат калия однозамещенный. Дифференцирующие свойства обеспечиваются двумя хромогенными индикаторами: 2-нитрофенил -D-галактопиранозид - хромогенный субстрат для обнаружения наличия -галактозидазы -группоспецифического фермента колиформных бактерий и 5-бром-4-хлор-3-индол -D-глюкуронид циклогексиламмонийной соли - хромогенный субстрат для выявления -глюкуронидазы - видоспецифического фермента E.coli. Для придания плотности среде она содержит агар микробиологический.

Состав предлагаемой среды - ДагХром агар в г/л дистиллированной воды:

сухой питательный бульон из каспийской кильки ФС42-3505-98	- 5,0-10,0
панкреатический гидролизат казеина РП № 816-98	- 14,0-16,0
парааминобензойная кислота, фирма «Sigma»	- 0,01-0,015
калий фосфорнокислый однозамещенный, з-д химреактив. г Шостка	- 0,2-0,3
2-нитрофенил -D-галактопиранозид, фирма «Sigma»	- 0,3-0,4
5-бром-4-хлор-3-индол -D-глюкуронид
циклогексиламмонийной соли, фирма «Sigma»	- 0,5-0,6
желчные соли № 3, фирма «Oxoid»	- 1,5-2,0
бриллиантовый зеленый, з-д химреактив. г Шостка	- 0,0002-0,0003
агар микробиологический, ГОСТ 17206-84	- 14,0-16,0

Сухую селективную питательную среду ДагХром агар получают следующим образом.

Пример 1. В шаровую мельницу-смеситель емкостью 100 литров загружают последовательно 5,0 кг сухого питательного бульона из каспийской кильки, 0,01 кг парааминобензойной кислоты, 0,2 кг калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,0002 кг бриллиантового зеленого и 1,5 кг желчных солей. Люк мельницы закрывают и перемешивают все ингредиенты в течение 20 минут. Затем в мельницу-смеситель вносят последовательно 14 кг агара микробиологического, 14 кг панкреатического гидролизата казеина, 0,3 кг 2-нитрофенил -D-галактопиранозида и 0,5 кг 5-бром-4-хлор-3-индол -D-глюкуронида циклогексиламмонийной соли.

Содержимое мельницы-смесителя перемешивают в течение 45-60 мин, после чего получают гомогенную сухую питательную среду.

Для приготовления плотной среды, готовой к употреблению, в 1 л дистиллированной воды растворяют 35,5 г сухой среды, трехкратно кипятят по 1-2 мин при помешивании, не допуская пригорания агара, до появления крупнопузырчатой пены. Среду охлаждают до температуры 45-50°С, после чего разливают в стерильные чашки Петри. После застывания агаровой пластинки чашки со средой подсушивают в термостате при 37°С в течение 50-60 мин с соблюдением правил асептики.

Готовая к употреблению среда прозрачная, светло-соломенного цвета, рН среды 7,4±0,2.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в шаровую мельницу-смеситель последовательно вносят 7,5 кг сухого питательного бульона из каспийской кильки, 0,0125 кг парааминобензойной кислоты, 0,25 кг калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,00025 кг бриллиантового зеленого и 1,75 кг желчных солей. Далее - по примеру 1. Затем в мельницу-смеситель вносят последовательно 15 кг агара микробиологического, 15 кг панкреатического гидролизата казеина, 0,35 кг 2-нитрофенил -D-галактопиранозида и 0,55 кг 5-бром-4-хлор-3-индол -D-глюкуронида циклогексиламмонийной соли. Далее - по примеру 1.

Для приготовления плотной среды, готовой к употреблению, в 1 л дистиллированной воды растворяют 40,4 г сухой среды. Далее - по примеру 1.

Пример 3. Отличается от примера 1,2 тем, что в шаровую мельницу-смеситель последовательно вносят 10 кг сухого питательного бульона из каспийской кильки, 0,015 кг парааминобензойной кислоты, 0,3 кг калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,0003 кг бриллиантового зеленого и 2,0 кг желчных солей. Далее - по примеру 1,2. Затем в мельницу-смеситель вносят последовательно 16 кг агара микробиологического, 16 кг панкреатического гидролизата казеина, 0,4 кг 2-нитрофенил -D-галактопиранозида и 0,6 кг 5-бром-4-хлор-3-индол -D-глюкуронида циклогексиламмонийной соли. Далее - по примеру 1,2.

Для приготовления плотной среды, готовой к употреблению, в 1 л дистиллированной воды растворяют 45,3 г сухой среды. Далее - по примеру 1, 2.

Через 18-24 ч инкубации посевов (при 37±1°С) на предлагаемой среде колиформные бактерии (БГКП) образуют колонии желтого цвета вследствие расщепления хромогенного индикатора (субстрата) -D-галактопиранозида группоспецифическим ферментом этих бактерий -галактозидазой и выделением в среду желтого хромофора. Колонии Е.coli на предлагаемой среде окрашиваются в сине-зеленый цвет, т.к. обладают ферментами -галактозидазой и -глюкуронидазой, вследствии чего происходит расщепление обоих хромогенных индикаторов - -D-галактопиранозида и -D-глюкуронида, выделяющих в среду хромофоры желтого и синего цвета соответственно. Остальные грамотрицательные микроорганизмы образуют бесцветные колонии, поскольку названные ферменты у них отсутствуют.

В известную среду HiCrome ECC Selective Agar, взятую за прототип, дополнительно введен триптофан для подтверждения принадлежности выделенного микроорганизма к E.coli путем постановки индольного теста с помощью реактива Ковача.

В предлагаемую среду ДагХром агар введение триптофана не требуется, т.к. необходимое его количество для постановки индольного теста с реактивом Ковача обеспечивается присутствием в составе среды сухого питательного бульона из каспийской кильки, богатого триптофаном. При этом вследствие оптимальной комбинации используемых в предлагаемой среде хромогенных субстратов изменение окраски колоний E.coli при постановке подтверждающего индольного теста легче учитывается: на предлагаемой среде - от сине-зеленой к ярко-розовой, на известной среде - от фиолетовой к оранжево-красной.

Селективные свойства предлагаемой среды, обеспеченные введением в ее состав желчных солей и бриллиантового зеленого, позволяют не только полностью ингибировать грамположительные микроорганизмы, но и подавить роение протея, а так же исключить пророст споровой микрофлоры, в результате чего стерилизация плотной среды не требуется, что в совокупности улучшает дифференцирующие свойства среды и упрощает процесс приготовления ее к употреблению (посеву).

Указанные преимущества предлагаемой среды в совокупности повышают эффективность диагностики при проведении санитарно-микробиологических и клинических исследований.

Сравнительная характеристика предлагаемой и известной среды представлена в таблице 1.