способ изготовления рабочего стандарта сывороток, содержащих антитела к вирусу гепатита с

Формула изобретения

1. Способ изготовления рабочего стандарта сывороток, содержащих антитела к вирусу гепатита С, включающий аттестацию образцов сывороток на наличие антител к вирусу гепатита С для оценки возможности использования их в качестве рабочего стандарта, отличающийся тем, что образцы сывороток аттестуют по иммунобиологическим маркерам на содержание HBs антигена, антител к вирусу гепатита С, ВИЧ-1,2 типов и анти-HBs, анти-НВс, анти-НВе антител, и биохимическим свойствам: уровень ферментов, общее содержание белка, рН, в качестве иммуноспецифических образцов для приготовления рабочего стандарта отбирают сыворотки, содержащие РНК вируса гепатита С и положительные по результатам иммуноферментного анализа (ОП>ОПкр), отрицательные образцы плазмы по данным ОТ-ПЦР, имеющие ОП<ОПкр., а в качестве рабочего стандарта используют комплект из отрицательной и нескольких позитивных сывороток, содержащих различные типы антител к вирусу гепатита С.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в рабочем стандарте используют 4 позитивные сыворотки, содержащие антитела к протеинам вируса гепатита С: анти-Соrе, airra-NS3, анти-МS4 и анти-NS5 и 1 отрицательную сыворотку.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при изготовлении каждого положительного образца при формировании рабочего стандарта используют пул из 3-4 сывороток с идентичным спектром антител, каждая из которых разведена до титра 1:5.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофильно высушенные сыворотки рабочего стандарта имеют остаточную влажность не более 1,0 мас.%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления рабочих стандартов, содержащих антитела к возбудителям опасных вирусных заболеваний. Для того чтобы оценить специфические характеристики тест-систем и провести оценку характеристик различных тест -систем, весьма важно иметь хорошо аттестованные образцы сывороток с известной IgG концентрацией в качестве стандарта.

Потребность в скорейшей унификации тест-систем разных производителей обусловлена, в частности, ростом распространения таких опасных инфекций, как ВИЧ, ВГС, ВГВ, причем основной прирост вновь инфицированных идет за счет групп риска. В результате укола "грязной" иглой каждый год 2 млн человек заражаются вирусным гепатитом типа С, а 5% всех новых случаев заражения ВИЧ то же связано с повторным использованием шприцов. Решение этой задачи усложняется тем, что до сих пор не утверждены ВОЗом стандарты на анти-ВГС и анти-ВИЧ. Первым шагом на пути разработки национальных референс-материалов для диагностики ВГС является разработка и сертификация рабочих стандартов анти-ВГС.

Разработка панелей сывороток, содержащих аттестованные количества специфических антител к социально опасным вирусным инфекциям различных генотипов, имеет наивысший приоритет для оценивания качества серологических анализов. Отсутствие научно обоснованных критериев для формирования панелей сывороток препятствуют сертификации референс панелей анти-ВГС и анти-ВИЧ в качестве международных стандартов. Текущее состояние панелей сывороток, их разработка и применение, и проблемы, связанные с их сертификацией и контролем, были детально обсуждены в докладе экспертов Комитета ВОЗ по биологической стандартизации, посвященном оцениванию качества диагностических наборов для детекции анти-ВГС антител [7].

Известны панели сывороток компании BBI (Boston, USA). Эти панели РНА составлены из индивидуальных сывороток, содержащих анти-ВГС антитела в разных концентрациях [1].

Аналогичные панели анти-ВГС антител были разработаны в России [2, 4].

Недостатки таких панелей связаны, главным образом, с неполной аттестацией образцов по биохимическим показателям, а также с тем, что для приготовления образцов используются не нативные, а разведенные сыворотки.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является британский рабочий стандарт (БРС) для анти-ВГС (The British Working Standard for anti-HCV) [3]. БРС является разведенным пулом анти-ВГС позитивных сывороток, подтвержденных в иммуноблоте (Lia HCV, RIBA HCV 3.0). Пул составляют из индивидуальных сывороток, каждую из которых разводят до концентрации антител, в 30 раз превышающей значение ОПкрит тест-системы 2-го поколения. Равные объемы каждой сыворотки смешивают и аликвоты хранят при - 20°С. Рабочий стандарт готовят из этих аликвот разведением в 30 раз в 5% сывороточном альбумине человека (ЧСА) в ФСБ, содержащем 0,05% азида натрия.

Основными недостатками прототипа являются:

1. Использование в качестве разводящего раствора 5% ЧСА в ФСБ. При такой технологии изготовления PC имеет матрикс, который значительно отличается от нативной сыворотки человека.

2. Условия хранения PC - в жидком состоянии PC хранится только при очень низких температурах (-70°С). Это значительно ограничивает круг государств, которые могут использовать британский PC, только развитыми странами, имеющими холодовые цепи.

3. Использование пула сывороток в качестве стандарта не дает возможности оценить качество каждого из антигенов: core, NS3, NS4 и NS5, используемых при создании иммуноферментных тест-систем для выявления антител к различным протеинам ВГС.

Техническим результатом заявляемого технического решения является создание такого способа изготовления рабочего стандарта сывороток, содержащих антитела к ВГС, который позволил бы изготавливать рабочие стандарты, близкие к нативным сывороткам человека, оценить качество каждого из антигенов: core, NS3, NS4 и NS5, используемых при создании иммуноферментных тест-систем для выявления антител к различным протеинам ВГС, а также хранить и транспортировать рабочие стандарты при более высоких температурах.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе изготовления рабочего стандарта (PC) сывороток, содержащих антитела к вирусу гепатита С, включающем аттестацию образцов сыворотки на наличие антител к вирусу гепатита С для оценки возможности использования их в качестве рабочих стандартов, согласно изобретения образцы сыворотки аттестуют по иммунобиологическим маркерам на содержание HBs антигена, антител к вирусу гепатита С, ВИЧ-1,2 типов и анти-HBs, анти-НВс, анти-НВе антител, и биохимическим свойствам: уровень ферментов, общее содержание белка, рН; в качестве иммуноспецифических образцов для приготовления панели рабочих стандартов отбирают сыворотки, содержащие РНК вируса гепатита С и положительные по результатам иммуноферментного анализа (ОП>ОПкр), отрицательные образцы плазмы по данным ОТ-ПЦР, имеющие ОП<ОПкр, а в качестве панели рабочих стандартов используют комплект из отрицательной и нескольких позитивных сывороток, содержащих различные типы антител к вирусу гепатита С.

Наиболее оптимально в рабочем стандарте сывороток использовать 4 позитивных сыворотки, содержащие антитела к протеинам ВГС анти-Core, анти-NS3, анти-NS4 и анти-NS5 и 1 отрицательную сыворотку. При изготовлении каждого положительного образца при формировании рабочих стандартов используют пул из 3-4 сывороток с идентичным спектром антител, каждая из которых разведена до титра 1:5. Лиофильно высушенные сыворотки панели имеют остаточную влажность не более 1,0 мас.%.

При хранении лиофильных сывороток PC при температуре 4°С они сохраняют свои специфические характеристики в течение более 2-х лет.

Учитывая уникальный характер инфекции гепатита С, сконструирован PC анти-ВГС как комплект образцов, содержащих антитела к различным протеинам ВГС, а именно анти-Core, анти-NS3, анти-NS4 и анти-NS5. В комплект входят образцы, содержащие антитела только к индивидуальным белкам ВГС и образцы с антителами к двум или нескольким протеинам.

Комплект включает 4 позитивные сыворотки и 1 отрицательную сыворотку в качестве внутреннего стандарта. Состав сывороток PC устанавливают с помощью теста «Спектр» из компании ЗАО «Вектор Бест» и белков ЗАО «Диагностические системы» (таблица 1).

1. Образцы плазмы для изготовления PC

Сыворотки для изготовления PC заготавливают в инфекционных больницах и на СПК методом плазмафереза в соответствии с этическими нормами и Санитарными правилами. Каждый образец плазмы аттестуют по 10 иммунобиологическим и биохимическим показателем.

2. Разводящий раствор

Для титрования позитивных образцов плазмы и изготовления образцов PC используют разводящий раствор, разработанный для изготовления референс-препаратов инфекционных заболеваний [4]. Мертиолят и гентамицин добавляют в качестве бактерицидов в количестве 0,015%.

В качестве фосфатно-солевого буфера, рН 7.1 - 7.6 - используют раствор, предложенный [5] (SOP MED 84, NIBSC), г.

NaCl	80+/- 1 g
KCl	2.0+/- 0.1 g
CaCl2*2H2O	1.3 g
MgCl 2*6H2O	1.0 g
Na 2HPO4*12H2O	29.0+/- 0.1 g
KH2PO4	2.0

на 100 л дист. H₂O

3. Аттестация образцов плазмы

Критерием для определения позитивности образца плазмы служит результат ОТ- ПЦР RNA HCV. Позитивные образцы плазмы должны содержать RNA HCV и быть положительными по результатам ИФА, т.е. иметь ОП>ОПкр. Отрицательные образцы плазмы должны быть отрицательными в ОТ-ПЦР и иметь ОП<ОПкр в ИФА.

Кандидаты в PC а-ВГС титруют первоначально с шагом 5, начиная с разведения 1:10 в 2-х тест системах «Бест - анти-ВГС» (ВекторБест) и «Вектор анти-ВГС» (Вектор). Отбирают 10 кандидатов со значениями ОП/ОПкр от 2,5 до 8,0.

На 2-м этапе все эти образцы анализируют в тестах «РекомбиБест анти-ВГС Спектр» ЗАО ВекторБест и «Спектр анти-ВГС», построенный на белках ЗАО «Диагностические системы», т.е. определяют титр антител к индивидуальным антигенам.

Из 10 кандидатов отбирают 5, которые имеют нужный титр анти-ВГС антител.

На 3-м этапе 5 образцов повторно оттитровывают в 2-х указанных тест-системах с шагом 2 для того, чтобы определить диапазон разведения, в котором зависимость ОП=f(развед) имеет линейную форму. Результаты исследований представлены в таблицах 1-4.

В таблице 1 приведены результаты титрования кандидатов в PC. Титрование проб V-1, V-3, V-5, V-6 и проб 1, 3, 5, 6. Первое разведение 1:5, затем титровка с шагом 3.

Тест-система ИМ ДИ. (37UС, качалка). ОПкр=0,205

Таблица 1 Результаты титрования кандидатов в рабочие стандарты антител
	V-1	V-3	V-5	V-6	1	3	5	6	К+К-	титр
А	2,806	2,794	0,690	2,782	2,760	2,739	0,659	2,782	2,871	5
В	2,761	2,703	0,069	2,731	2,782	2,771	0,067	2,751	2,804	15
С	2,575	2,633	0,049	2,693	2,618	2,693	0,048	2,740	0,051	45
D	2,713	2,566	0,044	2,600	2,783	2,783	0,047	2,732	0,051	135
Е	2,852	2,785	0,045	2,840	2,755	2,785	0,057	2,852	0,046	405
F	2,370	0,834	0,049	2,988	2,875	0,833	0,054	3,039	0,048	1215
G	0,474	0,104	0,051	2,491	0,993	0,116	0,053	2,627		3645
Н	0,094	0,056	0,055	0,434	0,186	0,058	0,046	0,470		10935

Таблица 2 Аттестация образцов плазмы, отобранных для изготовления рабочих стандартов анти-ВГС (ЗАО «ДС»,10.11.07)
№ образца	ОП для сывороток комплекта PC анти-ВГС
	Core	NS3	NS4	NS5	Отнесение
1	0,496	0,101	0,093	0,105	Core
2	1,665	0,086	1,98	0,070	Core+NS4
3	0,214	0,152	2,444	0,170	NS4
4	2,393	0,871	0,280	0,287	Core+NS3+NS5
5	0,141	0,138	2,672	0,672	NS4+NS5
6	0,145	0,118	0,099	0,097	Отриц.
7	0,116	0,126	0,109	0,096	Отриц.
8	0,138	0,122	0,090	0,100	Отриц.
СО	0,250	0,254	0,236	0,264

Таблица 3 Аттестация образцов плазмы, отобранных для изготовления рабочих стандартов анти-ВГС (ЗАО «В-Бест», 15.11.07)
№ образца	ОП для сывороток комплекта PC анти-ВГС
	Core	NS3	NS4	NS5	Отнесение
1	1,934	0,352	0,265	0,353	Core
2	2,249	0,073	1,463	0,146	Core+NS4
3	0,020	0,021	1,137	0,033	NS4
4	1,517	0,705	0,07	1,004	Core+NS3+NS5
5	0,027	3,532	0,360	0,641	NS3+NS5
6	0,024	0,028	0,019	0,029	Отриц.
7	0,026	0,023	0,020	0,026	Отриц.
8	0,025	0,017	0,014	0,019	Отриц.
СО	0,212	0,211	0,217	0,209

Таблица 4 Титрование антител кандидатов для формирования панелей РС
Контроль	Титр	ОП для сывороток комплекта PC анти-ВГС
		1	2	3	4	5
3,6	1:5	2,589	2,967	2,983	3,045	3,063
3,5	1:10	0,647	0,578	1,002	2,977	3,099
0,019	20	0,158	0,134	0,235	2,977	2,892
0,009	40	0,121	0,069	0,09	1,214	0,862
0,011	80	0,081	-	0,071	0,273	0,193
0,012	160	-	-	-	0,112	0,079
0,017	320	-	-	-	0,075	-
0,015	640	-	-	-	-	-

Из 5 кандидатов положительных сывороток и 3-х кандидатов отрицательных по результатам исследования спектра антител выбирают 4 положительные и 1 отрицательную сыворотку (Таблица 4).

При рассмотрении результатов титрования и по спектральному репертуару антител из 8 кандидатов выбирают в состав PC положительные образцы № 1, 2, 3, 5 и отрицательный образец № 6 (плазма донора).

Таким образом, PC анти-ВГС представляет собой набор из 4-х позитивных сывороток и 1 отрицательной сыворотки, выполняющей роль внутреннего стандарта для контроля правильной работы диагностического набора. Каждая позитивная сыворотка набора имеет свой характерный спектр антител. Это позволяет проконтролировать тест-систему на качество диагностического антигена составленного из 4-х протеинов: Core, NS3, NS4 и NS5.

4. Формирование пулов-кандидатов панели антител

Значения титров индивидуальных образцов плазмы используют для подбора коэффициентов разведения (КР) перед пулированием образцов плазмы. При таком подходе антитела к ВГС от каждого образца будут представлены в пуле в равном количестве. КР соответствует разведению образца, в среднем, до титра -1:30.

Конкретный пример выполнения заявляемого способа.

Поступление сывороток здоровых доноров

Плазма доноров поступает на производство в гемаконах CPDA емкостью 250 мл, герметично укупоренных.

Каждая донорская сыворотка, поступающая на производство для изготовления панели антител, должна иметь паспорт с характеристиками - ИН (индивидуальный номер) донора, объем сыворотки, дату забора крови, предприятие-изготовитель, а также отвечать следующим требованиям: без признаков гемолиза и гиперлипидиемии, прозрачная, цвет - янтарный или светло-желтый, посторонние механические примеси, взвесь, осадок отсутствуют.

Инактивация сывороток здоровых доноров

Флаконы с донорской сывороткой помещают в термостат при температуре 56°С. Фиксируют время начала инактивации. Инкубирование сыворотки проводят 3 часа. После истечения этого времени сыворотку достают из термостата, фиксируют время окончания инактивации. Дату инактивации регистрируют в «Журнале регистрации движения материала».

Для длительного хранения перед использованием сыворотки хранят в морозильной камере Medical freezer MDF 436 (Sanyo), при - 35°C. Это обеспечивает сохранение свойств сывороток в течение 5-7 лет.

Добавление к сыворотке раствора консерванта

В каждый флакон с донорской плазмой добавляют компоненты стабилизатора [2], раствор мертиолята из расчета 0,01 - 0,02 г на 100 мл сыворотки и раствор хлористого кальция для осаждения балластных белков. Сыворотку тщательно перемешивают.

Фасовка сывороток здоровых доноров

Из каждого гемакона в стерильном боксе в ламинаре автоматической пипеткой отбирают 5 аликвот по (1±0,05) мл плазмы в пластиковые пробирки «Эппендорф» емкостью 1,5 мл для контроля биохимических показателей и для исследования вирусных маркеров в ПЦР и ИФА. Пробирки закрывают, на каждой пробирке маркером пишут кодовый номер образца плазмы.

Оставшийся объем сыворотки фасуют в стерильные пластиковые флаконы емкостью 25-30 мл.

Хранение сывороток здоровых доноров

Гемаконы с донорской плазмой и их аликвоты помещают на хранение в морозильные камеры при температуре минус 35°С. Гемаконы до переработки можно хранить при этих условиях в течение 5-7 лет. Допускается однократное замораживание и оттаивание сывороток.

Контроль биохимических показателей сывороток здоровых доноров

По 2 мл каждой донорской сыворотки, полученной на предыдущей стадии, передают в биохимическую лабораторию для контроля биохимических показателей (уровень ферментов, общее содержание белка, рН). Содержание белка определяют микрометодом Лоури.

Сыворотки, не соответствующие физиологической нормам по биохимическим показателям, отбраковываются и утилизируются.

Контроль аликвот сывороток здоровых доноров методом ИФА

Вторую аликвоту каждой донорской сыворотки передают в ИФА лабораторию для исследования сывороток на содержание HBs антигена, антител к ВГС, ВИЧ-1,2 типов и анти-HBs, анти-НВс, анти-НВе антител. ИФА анализ проводят на аттестованных ГИСК им. Л.А.Тарасевича иммуноферментных тест-системах.

Сыворотки, не соответствующие требованиям, предъявляемым к качеству сывороток здоровых доноров (т.е. содержащие HBs антиген, антитела к ВИЧ-1,2 и к HBV), отбраковывают и помещают в банк сывороток для выполнения исследовательских работ.

Изготовление Рабочих стандартов

Для изготовления PC все 4 позитивные сыворотки разводят в стабилизированной НЧС примерно до титра 30-40. Расчетное количество каждого образца сыворотки, которое необходимо развести в пуле донорских сывороток для получения уровня антител, соответствующего титру 1:30-1:40, определяют по кривым предварительного титрования положительных сывороток, выполненных с шагом 2.

Розлив и лиофильная сушка

Каждый кандидат разливают по 0,3 мл во флаконы, коэффициент вариации погрешности розлива равен 0,2%. Флаконы в кассетах загружают на ночь в морозильник - 60°С. Утром замороженные флаконы размещают равномерно на полках лиофильной камеры, предварительно охлажденных до минус 35°С. При этой температуре полки лиофильной камеры выдерживают более 3-х час. Температура конденсора не превышает - 70°С. В течение 3-х часов вакуум достигает своего минимума. И оператор включает программу нагрева полок от -35°С до +20°С в течение 20-ти часов. На заключительной стадии при комнатной температуре образцы термостатируют с откачкой в течение 6-ти часов. Затем опускают прижимные плиты и запрессовывают пробки во флаконы. Флаконы удаляют из лиофильной камеры, закатывают алюминиевыми колпачками и размещают в хранилище при - 35°С.

После лиофилизации контролируют специфическую активность сывороток методом ИФА.

Испытания стабильности

Стабильность сывороток в различных условиях хранения в темноте во флаконах определяют по результатам теста термодеградации при температурах: -20°С, +4°С, +37°С и 45°С [6].

Объединенную выборку лиофилизованных кандидатов анти-ВГС панели исследуют в тесте ускоренной термодеградации. Образцы термостатируют в условиях контролируемой температуры, извлекают через определенные промежутки времени, растворяют в бидистиллированной воде и анализируют в дублях в тест-системах «РекомбиБест анти-ВГС - спектр» и "Бест анти-ВГС" (ЗАО ВекторБест). В эксперименте не отмечены экспериментально значимые потери активности антител. Средние величины рассчитанных процентов потери активности за месяц и за год приведены в таблице 2. Образцы демонстрируют высокую стабильность. Предсказываемая потеря активности за год при +4°С составляет около 0.3% для кандидатов.

Таблица 5 Предсказание активности образцов панели антител на основе ускоренных испытаний
Температура хранения, °С	Потеря активности за год, %	Потеря активности за месяц, %
4	0,28	0,0215
37	44	4,4
45	86	14
60	99	63

Предсказанная потеря активности за месяц составляет примерно 4% при 37°С, что позволяет кратковременно хранить сыворотки панели при повышенных температурах, например при транспортировке образцов.

Таким образом, при хранении лиофильных сывороток PC анти-ВГС при температуре 4°С они сохраняют свои специфические характеристики в течение более 2-х лет.

Разведенные образцы PC антител рекомендуется использовать при хранении при 4°С в течение месяца. Стабильность жидких образцов панели испытывают в тесте замораживание (-35°С) - оттаивание (37°С). Результаты испытаний показывают, что специфические свойства кандидатов не изменяются в течение 4-х циклов замораживания-оттаивания

Основной целью национальных PC является ежедневный и длительный мониторинг клинических диагностических лабораторий (КДЛ). Использование PC в качестве «да/нет» контролей требует, чтобы их показатели фиксировали ежедневно для каждого планшета и каждый день.

Отдельная проблема, которую можно решать с использованием этих материалов, является централизованное сравнение, анализ и накопление результатов от пользователей. Это предполагает сравнение показателей PC для выбранного аналитического центра относительно результатов из других аналитических центров, которые используют те же самые тест-системы и основанием для национальных экспертов качества (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) выделять КДЛ, которые наиболее успешно справляются с анализом PC и передавать методику этих КДЛ в лаборатории, которые менее успешно справляются с анализом PC.

Источники информации

1. Product catalog 2003/2004. Quality control products for infectious disease testing. Бостон, США.

2. Kanev A.N., Netesov S.V., Maksuytov A.Z. et al. Razrabotka reference panelei syvorotok dla kontrola kachestva immunofermentnyx test-systems in the Russia. Vestnik Akad. Med. Nauk, 1998; 43(3): 37-41. Russian.

3. WHO working group On international reference preparations for testing diagnostic kits used for the detection of HBsAg and anti- HCV antibodies. (WHO Headquarters, Geneva, 6-7 October 2003).

4. Канев A.H., Воробьева M.C., Шалунова H.B. и др. Конструирование и производство референс-панелей сывороток для контроля качества тест-систем в России. // Вестник АМН 1998, № 3, 47-52.

5. СОП ГИСК, MP «Отраслевые стандартные образцы. Основные положения, порядок разработки, изготовления, аттестации, утверждения и регистрации»./ Ред. Петухов В.Г., ГИСК им. Л.А.Тарасевича, М., май 2003.

6. Kirkwood T.B.L Принципы приготовления и утверждения международных и других стандартов и эталонных материалов биологических препаратов. Сер.техн. докл. № 37. ВОЗ, Женева, 1990. 14а// J. biol. Standardization. - 1984. - Vol.12. - P.207-224.

7. Ferguson M., Holmes H., Sands ED. UK blood transfusion service working standards for: HBsAg, anti - HCV and anti - HIV - l.//Vox Sang. 2001, 80: 205-210.