способ получения лечебно-профилактической добавки

Формула изобретения

Способ получения лечебно-профилактической добавки, предусматривающий приготовление питательной среды, введение в нее посевных доз штаммов бактерий Lactobacillus plantarum и Propionibacterium freudenreichii с последующим их культивированием до получения готового продукта, отличающийся тем, что используют штамм Lactobacillus plantarum ВКПМ В-2347 и штамм бактерий Propionibacterium freudenreichii ВКПМ В-6561, питательная среда содержит пептон мясной ферментативный, глюкозу, дрожжевой экстракт, кукурузно-лактозную питательную среду, кобальт серно-кислый, аммоний серно-кислый, агар-агар и дистиллированную воду при следующем содержании компонентов, г/л дистиллированной воды:

Пептон мясной ферментативный	9-11
Глюкоза	29-31
Дрожжевой экстракт	4,5-5,5
Кукурузно-лактозная питательная среда	1,9-2,1
Кобальт сернокислый	0,24-0,26
Аммоний сернокислый	4,5-5,5
Агар-агар	0,9-1,1
Вода дистиллированная	1000 мл,

а инкубирование бактерий в питательной среде осуществляют до

достижения ими титра не менее 1·10⁶ КОЕ в 1 см³ .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к технологии получения кормовых биологически активных добавок и может быть использовано в биотехнологии, микробиологии и сельском хозяйстве, в частности в кормопроизводстве.

Известен способ производства кормопродукта, включающий приготовление сусла, сбраживание его с получением бражки, перегонку бражки с получением этилового спирта и послеспиртовой барды, выращивание микроорганизмов на послеспиртовой барде с получением их биомассы, разделение биомассы на твердую и жидкую фракции и использование твердой фракции в качестве кормопродукта, отличающийся тем, что на послеспиртовой барде выращивают пары штаммов молочно-кислых и пропионово-кислых бактерий: Lactobacillus plantarum B578/25 и Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii Ас103/12 или Lactobacillus plantarum В 578/25 и Propionibacterium acnes Ac 1450/28 (патент РФ № 2250265, МПК С12Р 7/06, опубл. 20.04.05 г.).

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения белково-витаминного корма, заключающийся в инкубации микроорганизмов на питательной среде, содержащей минеральные соли и источник углерода в виде отхода производства по переработке природного сырья или в виде ферментолизата отхода с получением целевого продукта в виде биомассы инкубируемых микроорганизмов, при этом в качестве минеральных солей используют соль кобальта, в качестве отхода производства используют зерно, мукомольные отходы, крахмальные отходы, послеспиртовую барду, пивную дробину, плодовые выжимки или молочную сыворотку, ферментолизат готовят из зерна, мукомольных отходов, крахмальных отходов, пивной дробины или плодовых выжимок, а инкубируют на питательной среде культуры молочно-кислых и пропионово-кислых бактерий (Lactobacillus plantarum 578/25 и Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii 103/12), используемые парами: совместно молочнокислые и пропионово-кислые бактерии (патент РФ № 2243678, МПК А23К 1/06, С12N 1/16, опубл. 10.01.05 г.).

Недостатком указанных аналогов является использование нестандартизованных питательных сред (отходы производства природного сырья), что снижает качество готового продукта в части биологической активности бактерий-пробиотиков, увеличивает время культивирования бактерий (до 48,5 часов). При этом титр бактерий в конечном продукте не указывается. Однако в примере 1 отмечено, что процесс культивирования прекращается в экспоненциальной фазе роста, что косвенно подтверждает низкий титр указанного консорциума бактерий в конечном продукте. Кроме того, известные кормовые добавки в основном исследованы на питательные свойства и не содержат данных о их лечебно-профилактических свойствах.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание такого способа, который позволил бы получать добавку в корм с более широким спектром профилактических и лечебных свойств и в более короткие сроки, а также повышающую продуктивность и стрессоустойчивость животных.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения лечебно-профилактической добавки, предусматривающей приготовление питательной среды, введение в нее посевных доз штаммов бактерий Lactobacillus plantarum и Propionibacterium freudenreichii с последующим их культивированием до получения готового продукта, согласно изобретению используют штамм бактерий Lactobacillus plantarum ВКПМ В-2347 и штамм бактерий Propionibacterium freudenreichii ВКПМ В-6561, питательная среда содержит пептон мясной ферментативный, глюкозу, дрожжевой экстракт, кукурузно-лактозную питательную среду, кобальт сернокислый, аммоний сернокислый, агар-агар и дистиллированную воду, при следующем содержании компонентов, г/л дистиллированной воды:

Пептон мясной ферментативный	9-11
Глюкоза	29-31
Дрожжевой экстракт	4,5-5,5
Кукурузно-лактозная питательная среда	1,9-2,1
Кобальт сернокислый	0,24-0,26
Аммоний сернокислый	4,5-5,5
Агар-агар	0,9-1,1
Вода дистиллированная	1000 мл

а инкубирование бактерий в питательной среде осуществляют до достижения ими титра не менее 1×10⁶ КОЕ в 1 см³.

Дрожжевой экстракт в виде порошка получен автолизом штаммов дрожжей Sacchoromyces cerevisiae, выращенных на средах на мелассе. Физико-химические характеристики: сухое вещество, азот, амино азот, хлорид натрия, протеин, углеводы, рН 7,0. Средний аминокислотный состав: аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фениланин, пролин, серин, теонин, тирозин, триптофан, Валин. Средний витаминный состав: В1, В2, В5, В6, В8, В9, В12, PP. Минеральный состав: натрий, калий, фосфор, кальций, магний, селен, цинк.

Химический состав пептона мясного ферментативного в виде порошка: рН 6,5-7,0; нерастворимые примеси в %, <7,0; сульфированная зола, % <5,0; истинный пептон, % <70,0; общий азот, % >14,0; аминный азот, % >3,0; свободный белок, оптическая плотность <0,25.

Характеристика штаммов. Lactobacillus plantarum штамм ВКПМ В-2347. Морфологические и тинкториальные свойства: грамположительные неспорообразующие палочки. Образуют на агаризованных питательных средах (МПА) колонии со складчатой поверхностью. Размер клеток, мкм: ширина 0,6-0,8; длина 1,5-3,0. Культуральные свойства: растет на 7% NaCl. Вирулентные и токсигенные свойства: не вирулентен, не токсичен. Условия сохранения штамма на предприятии: на скошенном плотном питательном агаре при (6±2)°С. Условия пассирования штамма: на плотном питательном агаре в чашках Петри при (37±2)°С. Сбраживает фруктозу, лактозу, галактозу, глюкозу (кислота), мальтозу, маннит, рибозу, сахарозу, целлобиозу. Образует DL-формы молочной кислоты. Оптимум рН 5,8-6,0. Оптимум температуры 37°С. Способ, условия и состав среды для размножения штамма: вода дистиллированная - 600 мл, мясная вода - 400 мл, дрожжевой экстракт - 5,0 г, натрия ацетат - 5,0 г, глюкоза - 2,5 г, аммония цитрат - 2,0 г, К₂НРO₄ - 2,0 г, MgSO₄·7Н₂О - 0,2 г, MgO ₄·4Н₂O - 0,05 г, Твин 80 - 1 мл, агар - 5,0 г. Штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасности по другим причинам. Штамм депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов ГосНИИ Генетика (Москва) под номером ВКПМ В-2347 и в НПФ "Исследовательский центр" (Кольцово) под номером IC-762-2-3 (см. табл.1 и 2).

Таблица 1 Характеристика культурально-морфологических свойств штаммов
№ п/п	Признак	Propionibacterium freudenreichii штамм IC-763-3-4, ВКПМ В-6561	Lactobacillus plantarum штамм IC-762-2-3, ВКПМ В-2347
1.	Обычный цвет колоний	Не определялся*	Белый
2.	Форма и размер колоний на твердой питательной среде	Не определялся*	Выпуклые, с цельным краем, непрозрачные диаметром (2-5) мм
3.	Форма колоний на полужидкой питательной среде	Колонии, похожие на хвост кометы	Колонии гвоздикообразной формы
4.	Окраска по Граму	Положительная	Положительная
5.	Подвижность	Неподвижны	Неподвижны
6.	Размер клеток	Не определялся	Не определялся
7.	Форма клеток	Кокковидные палочки, иногда раздвоенные. Располагаются одиночно, в парах, в коротких цепочках	Палочки правильной формы, в коротких цепочках
8.	Спорообразование	Отсутствует	Отсутствует
9.	Отношение к кислороду	Факультативные анаэробы	Факультативные анаэробы, слабо растут в аэробных условиях
10.	Оптимальная для роста температура	37°С	30°С
Примечание: "+" - реакция положительная, "-" - реакция отрицательная, * - параметры не определены в связи с отсутствием нужных для роста условий Propionibacterium freudenreichii штамм ВКПМ В-6561. Штамм депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов ГосНИИ Генетика. Культурально-морфологические особенности штамма: неподвижные палочки размером 0,5-1,5 мкм, иногда образующие короткие изогнутые цепочки, иногда имеют вид кокков. Грамположительные. Неспорообразующие. Аэротолерантные. Сбраживает фруктозу, лактозу, галактозу, глюкозу, маннозу. Главный продукт метаболизма - пропионовая кислота. В клеточной стенке основным компонентом является мезо-ДАН. Оптимум рН 7,0-7,2. Оптимум температуры 37°С.

Таблица 2 Характеристика биохимических свойств штаммов
№ п/п	Признак	Propionibacterium freudenreichii штамм IC-763-3-4, ВКПМ В-6561	Lactobacillus plantarum штамм IC-762-2-3, ВКПМ В-2347
1.	Рост в анаэробных условиях	+	+
2.	Рост в аэробных условиях	-	+
3.	Толерантность к разным концентрациям хлорида натрия (наличие роста):
0,5%	+	+
1%	+	+
2%	+	+
3%	+	+
4%	+	+
5%	+	+
6%	+	+
7%	+	+
8%	+	+
9%	+	+
10%	+	+
11%	+	+
12%	-	-
4.	Каталазная активность	-	-
5.	Амилазная активность	+	+
6.	Протеазная активность	-	-
7.	Образование аммиака	-	-
8.	Образование	-	-
	сероводорода
9.	Образование индола	-	-
10.	Утилизация Сахаров и
- спиртов:
- глюкоза	+	+
- мальтоза	-	+
- рамноза	+	+
- лактоза	-	+
- маннит	+	+
- дульцит	+	+
- арабиноза	+	+
- сорбит	+	+
11.	Лецитиназная активность	+	+
12.	Гидролиз эскулина	+	-
13.	В - гемолиз	-	-
Примечание: "+" - реакция положительная, "-" - реакция отрицательная.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма - лиофилизация в сепарированном молоке в условиях, лишенных кислорода, и 10% сахарозожелатиновом агаре. Способ, условия и состав среды для размножения штамма - вода дистиллированная - 1000 мл, дрожжевой экстракт - 10,0 г, К₂НРО₄ - 1,0, Na₂HPO₄·2H₂O - 3,0 г, лактат Na (70%) - 40 мл. Растворить все ингредиенты и добавить лактат натрия. Оптимум рН 7,0. Штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасности по другим причинам.

Более подробные результаты изучения культурально-морфологических и биохимических свойств бактерий Propionibacterium freudenreichii штамм IC-763-3-4, ВКПМ В-6561 и Lactobacillus plantarum штамм IC-762-2-3, ВКПМ В-2347 представлены в таблицах 1 и 2.

Способ получения кормовой биологически активной добавки.

Технологический процесс производства биологически активной добавки к корму Велес включает следующие этапы: размножение штаммов - продуцентов на селективных питательных средах, наработка посевного материала, ферментация, приготовление конечной препаративной формы и фасовка.

Культивирование микроорганизмов. Микробные штаммы, полученные из центрального музея промышленных микроорганизмов ВНИИ Генетика или из музея НПФ "Исследовательский центр", в изотоповском шкафу (ШИ-11) боксового помещения, суспендируют в стерильном физиологическом растворе, а затем полученной суспензией засевают селективные питательные среды в соотношении 0,1 см³ суспензии на 10 см³ питательной среды. В качестве селективной питательной среды для лактобактерий используют МРС среду, для пропионово-кислых - среду на основе лактата натрия и сернокислого аммония. Инкубирование лактобактерий проводят при 32°С в течение 2-3 сут, пропионово-кислых - при 37°С в течение 3-5 сут. Проводят от 2 до 5 пассажей культур на селективных питательных средах с постепенным увеличение объема питательной среды.

Питательная среда для лактобактерий состоит из следующих компонентов (на 1000 см ³):

Пептон ферментативный сухой ГОСТ 13805	10,0
Дрожжевой экстракт «Sigma»	20,0 см3
Глюкоза безводная ГОСТ 6038	20,0 г
Твин-80 ТУ 6-14-938	1,0 см 3
Калий фосфорнокислый двузамещенный ГОСТ 2493	2,0 г
Уксуснокислый натрий ГОСТ 2080	5,0 г
Триаммония цитрат	2,0 г
Сульфата магния	0,2 г
Четырехводный сульфат марганца	50,0 мг
Агар микробиологический ГОСТ 17206	950,0 мг
Мясная вода	1000,0 см3

Питательная среда для пропионово-кислых бактерий состоит из следующих компонентов (на 1000 см³):

Лактат натрия ТУ 9199-060-00334557	40,0 г
Аммоний сернокислый "ч" ГОСТ 3769	10,0 г
Дрожжевой экстракт «Sigma»	5,0 г
Агар микробиологический ГОСТ 17206	950,0 мг

На данном этапе проводят микробиологический и микроскопический анализ штаммов, то есть соответствие их культурально-морфологических признаков паспортным данным.

Штаммы лакто- и пропионово-кислых бактерий на жидких питательных средах хранят в холодильнике при 4-6°С. Для наработки кормовой добавки они могут быть использованы в течение месяца.

Далее нарабатывают кормовую добавку в виде консорциума биомасс Lactobacillus plantarum штамм ВКПМ В-2347 и Propionibacterium freudenreichii штамм ВКПМ В-6561:

Для этого готовят питательную среду следующего состава

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72	1000
Глюкоза	30
Пептон мясной ферментативный	10
Дрожжевой экстракт	5
Питательная среда ГМК	2
Кобальт сернокислый	0,25
Аммоний сернокислый	5
Агар-агар	1.

Для получения кормовой добавки во флаконах среду разливают в градуированные флаконы вместимостью 500 мл по 300 мл. Из пробирок с микроорганизмами (Lactobacillus plantarum штамм ВКПМ В-2347 и Propionibacterium freudenreichii штамм ВКПМ В-6561), заложенными на хранение, переносят над пламенем горелки 9 мл культуры в каждый флакон с питательной средой. Флаконы помещают на стеллаж в термальной комнате и выращивают клетки при температуре (37±1)°С стационарно в течение 18-20 ч до получения титра лакто- и пропионово-кислых бактерий в количестве не менее 1×10⁶ КОЕ в 1 см³.

Для получения кормовой добавки в бутылях готовят питательную среду выше приведенного состава на 40 000 см³. Готовую среду разливают в стерильные стеклянные бутыли по (5000±0,1) см³. После стерилизации бутыли со средой охлаждают до температуры (37±2)°С. Каждую бутыль засевают по 300 см³ (каждого штамма в 1 бутыль) суспензии из флаконов с Lactobacillus plantarum штамм ВКПМ В-2347 и Propionibacterium freudenreichii штамм ВКПМ В-6561. Инкубируют при температуре (37,0±0,5)°С в течение 20-24 ч до получения титра лакто- и пропионо-вокислых бактерий в количестве не менее 1×10 ⁶ КОЕ в 1 см³.

Лактобактерии, в частности Lactobacillus plantarum, синтезируют широкий спектр веществ, которые ингибируют рост других бактерий. К этим веществам относятся конечные продукты метаболизма, такие как органические кислоты (молочная и уксусная), перекись водорода и соединения, известные как бактериоцины: лизоцин, лектролин, низин, лактоцидин, ацидофилин. Бактериоцины - белки, которые продуцируются некоторыми микроорганизмами, и оказывают губительное действие на близкородственные микроорганизмы. В общем, бактериоцины имеют меньший спектр активности, чем антибиотики, но действие их более выражено.

Пропионово-кислые бактерии, в частности Propionibacterium freudenreichii принадлежат к резидентным видам симбиотической микрофлоры кишечного тракта животных. Наибольшее их количество обитает в рубце жвачных животных. В процессе их жизнедеятельности они способны снижать избыточную кислотность силосов, предотвращая тем самым возникновение ацидоза у животных. Продуктами метаболизма пропионовых бактерий служат пропионовая и уксусная кислота, которые хорошо усваиваются животными. Кроме того, пропионовая кислота обладает ярко выраженными бактерицидными и фунгицидными свойствами.

Скармливание культур пропионово-кислых бактерий или препаратов на их основе приводит к элиминации патогенной микрофлоры и увеличению количества лакто-, бифидо- и пропионово-кислых бактерий. Например, дача препарата пропиацин поросятам в течение 7-10 дней 1 раз в день из расчета 0,5% от массы корма приводила к снижению содержания кишечной палочки на 17,1-20,1%, других видов условно-патогенным микроорганизмов на 20,1-24,1%. При этом было отмечено увеличение количества молочнокислых и пропионово-кислых бактерий. Тенденция к уменьшению условно-патогенной и гнилостной микрофлоры сохранялась на 28 и 61 день развития поросят. Животные имели хороший аппетит, интенсивность их роста была выше по сравнению с контролем.

Одной из главных отличительных особенностей пропионово-кислых бактерий является их способность продуцировать высокое количество витаминов группы В, преимущественно В12. Использование биомассы пропионовых бактерий в качестве источника витамина В12 не уступает по эффективности синтетическим аналогам. Было отмечено увеличение ежесуточных привесов и снижение затрат корма 1 кг прироста поросят. Наиболее оптимальные дозировки биомассы пропионовых бактерий в пересчете на витамин В12 составляли 10-40 мкг на 1 кг живой массы. Аналогичные результаты по использованию биомассы бактерий в качестве источника витамина В12 были получены на цыплятах. При этом привес живой массы увеличился (1,1-6,9%) по сравнению с коммерческим препаратом В12.

Участие пропионовых бактерий в процессах пищеварения также связано с их высокой ферментативной активность. Например, некоторые штаммы обладают амилазной, протеолитической активностью; способны усваивать широкий спектр углеводов.

Пример 1. Влияние кормовой добавки Велес на резидентную микрофлору кишечного тракта животных, эффективность кормовой добавки при лечении дисбактериозов

Изучение влияния кормовой добавки на видовой состав микрофлоры желудочно - кишечного тракта животных проводили в лабораторных условиях на клинически здоровых белых беспородных мышах (3 серии опытов по 100 животных в каждом); цыплятах-бройлерах кросса «Кобб»: 3 серии опытов - по 100 цыплят в каждом; в домашних и клинических условиях на собаках: общее количество животных различных пород и полов - 120 особей; телятах: в условиях животноводческих комплексов, ферм и подворий - 312 животных; поросятах: общее количество животных 450 особей. Кормовую добавку скармливали индивидуальным способом из расчета 0,5 см³ на 1 кг живого веса 3 раза в день.

В ходе работы было показано, что скармливание кормовой добавки Велес приводит к нормализации видового состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных. Так, в экспериментах на белых беспородных мышах было установлено, что скармливание кормовой добавки приводит к 10-100-кратному увеличению количества лакто- и бифидобактерий. При этом не было отмечено изменения численности штаммов кишечной палочки, протей, грибов, стафилококков и стрептококков. Эффект от применения кормовой добавки сохранялся в течение месяца после прекращения ее скармливания, что, вероятно, свидетельствует о способности лакто- и пропионово-кислых бактерий, входящих в состав препарата, приживаться в желудочно-кишечном тракте животных. Аналогичные результаты были получены при скармливании кормовой добавки другим видам животных: поросятам, цыплятам, телятам, собакам (табл.3).

Таблица 3. Влияние кормовой добавки на резидентную микрофлору ЖКТ
Группы микроорганизмов	Количество микроорганизмов в зависимости от сроков продолжительности скармливания кормовой добавки, КОЕ/г экскрементов
До начала	Через 5 дней	Через 10 дней	Через 20 дней	Через 40 дней
Мыши
Патогенные энтеробактерии	0	0	0	0	0
Кишечная палочка с нормальной ферментативной активностью	9,1×105	8,7×105	9,0×105	8,6×105	8,3×105
Кишечная палочка с пониженной ферментативной активностью (лактозонегативные)	8,8×102	1,3×103	0,9×103	7,2×102	0,8×103
Кишечная палочка с гемолитической активностью	0	0	0	0	0
Протеи	5,4×102	4,2×102	6,5×102	5,6×102	8,3×102
Другие условно-патогенные бактерии	7,0×102	3,0×102	8,0×102	6,0×102	4,0×102
Стафилококки плазманегативные	8,1×102	7,4×102	9,0×102	8,8×102	7,3×102
Стрептококки гемолитические	1,2×106	0,9×106	0,7×106	0,6×106	1,0×106
Грибы	9,2×102	8,3×102	8,2×102	7,9×102	7,3×102
Клостридии	0	0	0	0	0
Лактобактерии	0,2×107	3,0×107	5,1×107	4,5×107	3,5×107
Бифидобактерии	1×107	100,0×107	200,4×107	250,7×107	220,5×107
Телята
Патогенные энтеробактерии	0	0	0	0	0
Кишечная палочка с нормальной ферментативной активностью	5,1×106	8,1×106	6,2×106	6,5×106	4,1×106
Кишечная палочка с пониженной ферментативной активностью (лактозонегативные)	3,3×106	5,8×105	5,6×105	4,9×105	3,7×105
Кишечная палочка с гемолитической активностью	0	0	0	0	0
Протеи	0	0	0	0	0
Другие условно-патогенные бактерии	0	0	0	0	0
Стафилококки плазманегативные	0	0	0	0	0
Стрептококки гемолитические	5,0×104	6,1×104	4,8×104	4,7×104	4,2×104
Грибы	0	0	0	0	0
Клостридии	0	0	0	0	0
Лактобактерии	1,2×107	8,4×107	8,1×107	7,9×107	8,2×107
Бифидобактерии	8,3×107	98,0×107	111,1×107	114,2×107	122,6×107
Поросята
Патогенные энтеробактерии	0	0	0	0	0
Кишечная палочка с нормальной ферментативной активностью	3,6×105	3,4×105	4,1×105	3,8×105	4,2×105
Кишечная палочка с пониженной ферментативной активностью (лактозонегативные)	3,5×103	3,6×103	3,7×103	3,8×103	4,1×103
Кишечная палочка с гемолитической активностью	0	0	0	0	0
Протеи	6,5×103	0	0	0	0
Другие условно-патогенные бактерии	0	0	0	0	0
Стафилококки плазманегативные	0	0	0	0	0
Стрептококки гемолитические	4,4×104	4,9×104	4,7×104	4,6×104	3,9×10
Грибы	0	0	0	0	0
Клостридии	0	0	0	0	0
Лактобактерии	0,8×106	6,0×107	8,0×107	8,1×107	9,0×107
Бифидобактерии	0,8×108	9,0×108	62,1×108	50,2×108	32,6×l08
Цыплята
Патогенные энтеробактерии	0	0	0	0	0
Кишечная палочка с нормальной ферментативной активностью	1,1×105	2,1×105	1,5×105	2,3×105	2,7×105
Кишечная палочка с пониженной ферментативной активностью (лактозонегативные)	2,9×106	3,1×106	2,8×106	3,2×106	2,9×106
Кишечная палочка с гемолитической активностью	0	0	0	0	0
Протеи	4,8×104	3,9×102	4,7×10	5,1×102	5,1×102
Другие условно-патогенные бактерии	0	0	0	0	0
Стафилококки плазманегативные	0	0	0	0	0
Стрептококки гемолитические	1,1×106	1,9×106	2,0×106	1,7×106	1,6×106
Грибы	0	0	0	0	0
Клостридии	0	0	0	0	0
Лактобактерии	0,8×106	6,0×107	8,0×107	8,1×107	9,0×107
Бифидобактерии	0,8×108	9,0×108	62,1×108	50,2×108	32,6×108

Собаки
Патогенные энтеробактерии	0	0	0	0	0
Кишечная палочка с нормальной ферментативной активностью	2,7×105	2,1×105	3,1×105	3,0×105	3,2×105
Кишечная палочка с пониженной ферментативной активностью (лактозонегативные)	3,1×104	3,0×10 4	2,8×10 4	2,9×10 4	3,0×10 4
Кишечная палочка с гемолитической активностью	0	0	0	0	0
Протеи	0	0	0	0	0
Другие условно-патогенные бактерии	0	0	0	0	0
Стафилококки плазманегативные	0	0	0	0	0
Стрептококки гемолитические	0	0	0	0	0
Грибы	0	0	0	0	0
Клостридии	0	0	0	0	0
Лактобактерии	0,5×107	5,5×107	6,7×107	6,0×107	6,9×107
Бифидобактерии	1,2×10 8	11,2×10 8	12,3×10 8	14,8×10 8	15,7×10 8

Изучено влияние кормовой добавки на видовой состав микрофлоры животных в зависимости от нормы расхода. Опыты были выполнены на цыплятах различных пород в 5 повторах. В каждой группе не менее 1000 птиц.

Установлено, что влияние кормовой добавки на видовой состав микрофлоры проявляется в дозировках, начиная от 0,1 см ³ на 1 кг живой массы при групповом способе дачи. Повышение нормы расхода более 0,5 см³ не приводит к увеличению эффекта (табл.3).

На чертеже представлен график влияния кормовой добавки Велес на количество лакто-, бифидо- и пропионовых бактерий у цыплят в зависимости от нормы ее расхода.

В ходе работы была изучена эффективность кормовой добавки при лечении дисбактеризов животных. С этой целью в животноводческих хозяйствах и на птицефабриках были выбраны животные, у которых выявлено пониженное содержание лакто- и бифидобактерий.

В опытах были задействованы 3200 цыплят различных кроссов и 410 телят различных пород, 450 поросят различных пород. Кормовую добавку задавали с питьевой водой из расчета 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 см³ на 1 кг живого веса. Продолжительность дачи препарата - 10 дней, кратность - от 1 до 3 раз в день.

Было установлено (табл.4 и 5), что скармливание кормовой добавки приводит к резкому увеличению количества лакто- и бифидобактерий. Эффективность кормовой добавки напрямую зависимосит от дозировки и кратности применения. Максимальная эффективность была получена при 3-кратном использовании кормовой добавки по 0,5 см³ на 1 кг живого веса. Снижение количества лакто- и бифидобактерий не было зарегистрировано в течение 2 месяцев после прекращения скармливания кормой добавки, что свидетельствует о способности штаммов, входящих в состав кормовой добавки, приживаться в желудочно-кишечном тракте животных.

Таблица 4. Влияние кормовой добавки Велес на содержание лактобактерий в желудочно-кишечном тракте цыплят в зависимости от кратности и нормы расхода препарата (Количество лактобактерий, КОЕ/г экскрементов)
Кратность, раз в сутки	Дозы препарата, см3 на кг живого веса
0,1	0,2	0,3	0,4	0,5
Цыплята
1	90,3×10 4	110,1×10 4	930,2×10 4	2550,6×10 4	3560,3×0 4
2	100,7×10 4	150,1×10 4	3500,3×10 4	1950,7×10 4	9700,5×10 4
3	250,8×10 4	1070,3×10 4	1480,8×10 4	3207,3×10 4	10500,7×10 4
Поросята
1	10,5×10 4	524,3×10 4	327,6×10 4	2590,1×10 4	4000,4×10 4
2	50,3×10 4	375,2×10 4	2567,1×10 4	5240,3×10 4	6500,5×10 4
3	150,7×10 4	1800,7×10 4	3195,5×10 4	6700,7×10 4	8500,6×10 4
Телята
1	150,2×10 4	54,4×10 4	274,4×10 4	3500,3×10 4	4000,2×10 4
2	300,5×10 4	250,5×10 4	2579,6×10 4	4500,2×10 4	4980,7×10 4
3	900,4×10 4	1980,4×10 4	3256,7×10 4	5439,1×10 4	5400,1×10 4

Таблица 5. Влияние кормовой добавки Велес на содержание бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте цыплят в зависимости от кратности и нормы расхода препарата (Количество бифидобактерий, КОЕ/г экскрементов)
Кратность, раз в сутки	Дозы препарата, см3 на кг живого веса
0,1	0,2	0,3	0,4	0,5
Цыплята
1	142,2×10 5	306,3×10 5	92,1×10 6	306,2×10 6	2090,3×10 6
2	546,3×10 5	905,4×10 5	450,2×10 6	1500,3×10 6	5999,1×10 6
3	1650,2×10 5	550,1×10 6	2780,2×10 6	7754,2×10 6	9006,3×10 6
Телята
1	120,1×10 6	127,3×10 6	92,5×10 6	306,4×10 6	809,3×10 6
2	37,3×10 6	305,4×10 6	450,3×10 6	1500,3×10 6	5999,2×10 6
3	212,5×10 6	455,6×10 6	2780,2×10 6	7754,1×10 6	9006,6×10 6
Поросята
1	164,1×10 6	274,2×10 6	587,7×10 6	1200,4×10 6	3100,3×10 6
2	247,3×10 6	684,3×10 6	950,5×10 6	1700,5×10 6	6600,6×10 6
3	594,4×10 6	1050,1×10 6	1587,3×10 6	2788,3×10 6	8500,7×10 6

Пример 2. Эффективность применения кормовой добавки Велес при кормлении лактирующих коров

Было изучено влияние кормовой добавки на молочную продуктивность коров. Испытания препарата проводили в различных условиях содержания коров: животноводческих комплексах, на фермах и частных подворьях. Породы животных были различные, в том числе и беспородные. Общее количество животных, задействованных в опыте, составило 940 коров различного возраста. Препарат задавали с водой из расчета 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 см³ на 1 кг живого веса по 2 раза в день на одну корову.

Испытания показали, что дача препарата в течение 10 дней приводит к достоверному повышению удоев. В целом удои в опытной группе животных были на 1,5-2,8 л больше по сравнению с удоями в контрольной группе. При этом жирность молока увеличилась с 3,31-3,48% до 3,69-4,1%. Результаты эксперимента представлены в табл.6.

Таблица 6. Влияние кормовой добавки на удои молока у коров.
Показатели	Контроль	Опыт, расход препарата на кг живого веса
0,1	0,2	0,3	0,4	0,51
Начало опыта
Среднесуточные удои молока фактической жирности, кг	32,2	31,3	30,9	31,8	32,4	32,0
Содержание жира, %	3,46	3,31	3,43	3,34	3,48	3,40
Конец опыта
Среднесуточные удои молока фактической жирности, кг	31,3	33,7	33,1	34,0	34,2	33,9
Содержание жира, %	3,50	3,69	3,72	3,82	4,10	3,72

В другой серии экспериментов было изучено влияние кормовой добавки на удои молока, а также расходы кормов при производстве 1 кг молока (табл.7). Эксперименты также проводили на черно-пестрой породе коров в условиях промышленного содержания. Экспериментальные и контрольные группы животных состояли из 25 животных. Повторность эксперимента 4-х кратная. Условия содержания и кормления животных были одинаковыми в контрольной и опытных группах. Препарат задавали с питьевой водой из расчета 0,1 см³ на 1 кг живого веса по 1 и 2 раза в день на протяжении 10 дней.

Таблица 7. Влияние кормовой добавки на удои молока, а также расходы кормов при производстве 1 кг молока
Показатели	Контроль	Опыт, кратность дачи препарата в сутки
1 раз	2 раза
Среднесуточное потребление сухого вещества, кг	21,9	21,8	21,4
Среднесуточное потребление кормовых единиц	18,9	18,7	18,6
Ежедневный расход обменной энергии, МДж	234	235	231
Удои натурального молока, кг	2490	2629	2532
Содержание белка в молоке, %	4,10	4,11	4,09
Суточный удой молока 4%-ной жирности	25,7	27,1	26,1
Затраты на 1 кг молока 4%-ной жирности сухого вещества, г	0,84	0,80	0,82
Затраты на 1 кг молока 4%-ной жирности кормовых единиц	0,74	0,69	0,71
Затраты на 1 кг молока 4%-ной жирности обменной энергии, МДж	9,11	8,67	8,85

Таким образом, использование кормовой добавки Велес способствует увеличению продуктивных показателей коров в период лактации. При этом под влиянием кормовой добавки происходит существенное снижение затрат на производство единицы молока. Увеличение удоев и содержания жира в молоке, вероятно, связано с положительным влиянием кормовой добавки на процесс пищеварения и как следствие на обмен веществ в организме коров.

Пример 3. Влияние кормовой добавки Велес на иммунологические показатели организма животных

Эксперименты проводили в условиях вивария НПФ ИЦ. Объектом исследования были цыплята-бройлеры 7-дневного возраста кросса «Смена». Для эксперимента отбирали по 400 цыплят и содержали в одинаковых условиях. В возрасте 20 дней цыплят переводили на комбикорм пшенично-ячменного типа. Цыплят делили на четыре группы по 100 особей в каждой. Первая группа не получала кормовую добавку (контроль), вторая и третья получала кормовую добавку из расчета 0,1, 0,3 и 0,5 см³ на 1 кг живого веса. Продолжительность скармливания препарата составляла 10 дней.

В ходе работы было установлено, что скармливание кормовой добавки приводит к статически достоверному повышению уровня лизоцима, бета-лизинов и бактерицидной активности крови цыплят. После прекращения скармливания кормовой добавки было зарегистрировано постепенное снижение уровня изучаемых показателей до уровня контроля. Максимальное влияние кормовой добавки на иммунологические показатели крови цыплят было отмечено при норме ее расхода 0,5 см³ на 1 кг живого веса. Следует также отметить, что влияние кормовой добавки сохраняется около месяца после прекращения ее скармливания. Результаты эксперимента представлены в табл.8.

Таблица 8. Влияние кормовой добавки на иммунологические показатели организма цыплят
Показатели	Контроль	Опыт, дозы препарата, мл на кг живого веса
0,1	0,3	0,5
До начала скармливания препарата
Лизоцим, мкг/мл	3,2	3,3	3,1	3,3
Бета-лизины, %	25,4	26,2	25,2	26,3
Бактерицидность, %	52,7	53,1	52,8	52,7
Через 10 дней после начала скармливания препарата
Лизоцим, мкг/мл	3,3	3,5	3,7	4,0
Бета-лизины, %	27,1	34,1	36,2	38,8
Бактерицидность, %	53,1	58,4	59,8	61,9
Через 30 дней после начала скармливания препарата
Лизоцим, мкг/мл	3,2	3,6	3,5	3,5
Бета-лизины, %	26,4	31,8	32,9	32,4
Бактерицидность, %	52,8	59,7	58,4	57,9
Через 50 дней после начала скармливания препарата
Лизоцим, мкг/мл	3,3	3,4	3,2	3,3
Бета-лизины, %	25,9	27,9	27,8	28,1
Бактерицидность, %	52,7	54,4	53,7	53,6

Таким образом, применение кормовой добавки повышает неспецифическую резистентность организма животных. Подобное воздействие, вероятно, связано с повышением антигенной нагрузки на организм животных при скармливании кормовой добавки.

Пример 4. Влияние кормовой добавки Велес на рост, развитие, сохранность животных и распространение заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) диарейной симптоматики (табл.9).

Эксперименты проводили на цыплятах-бройлерах кросса «Кобб». Эксперимент включал 4 варианта по 10000 голов. Контролем служил первый вариант (животные не получали препарат), три других варианта были опытными, животные из этих вариантов получали кормовую добавку групповым методом из расчета 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 см³ на 1 кг живого веса. Продолжительность периода скармливания составляла 10 дней по 1 разу в день. Эксперимент проводили в двух вариантах с применением антибиотиков и без применения антибиотиков. В первом случае кормовую добавку начинали скармливать на 5 день после отмены антибиотиков, во втором кормовую добавку начинали давать с 1 дня жизни цыплят. Продолжительность периода скармливания в обоих вариантах составляла 10 дней по 1 разу в день.

Из данных, представленных в табл.10 видно, что скармливание кормовой добавки приводит к существенному повышению сохранности цыплят и снижению распространения заболеваний желудочно-кишечного тракта диарейной симптоматики. При скармливании кормовой добавки повышается конверсия корма, увеличиваются привесы животных. Вероятно, положительное влияние кормовой добавки обусловлено тем, что при ее использовании оптимизируется видовой состав микрофлоры жкт и нормализуется процесс пищеварения.

Таблица 9. Влияние кормовой добавки на рост, развитие, сохранность животных и распространение заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) диарейной симптоматики

Показатели	Контроль	Опыт, норма расхода препарата, мл на кг живой массы
0,1	0,2	0,3	0,4	0,5
Без применения антибиотиков
Живая масса, кг	2,276	2,316	2,325	2,34	2,37	2,38
Сохранность, %	96,1	96,3	97,1	97,5	98,9	99,0
Конверсия корма, кг/кг	1,870	1,830	1,840	1,81	1,79	1,78
Распространения заболеваний жкт диарейной симптоматики, %	15,6	13,2	12,2	5,1	1,85	1,65
После применения антибиотиков
Живая масса, кг	2,199	2,218	2,305	2,31	2,34	2,350
Сохранность, %	95,5	96,4	97,7	98,2	99,1	99,1
Конверсия корма, кг/кг	1,870	1,830	1,840	1,81	1,790	1,780
Распространения заболеваний жкт диарейной симптоматики, %	3,2	2,95	1,54	0,85	0,75	0,55

Было изучено влияние кормовой добавки на сохранность поросят. Для эксперимента было отобрано 200 опоросных свиноматок. После родов свиноматок с пороятами разделили на опытную и контрольную группу. Поросята опытной группы получали препарат из расчета 0,1 см³ по 3 раза в день. Поросята контрольной группы препарат не получали.

Таблица 10. Влияние кормовой добавки Велес 6.59 на сохранность поросят
Показатели	Опыт	Контроль
Среднее количество поросят на свиноматку	10,1	11,2
Сохранность, %	90	78
Масса при рождении, г	1200	1250
Масса при отъеме, г	6900	5800

Было установлено, что дача препарата существенно (более чем на 10%) повышает сохранность молодняка и увеличивает привесы на 18,9%.

Было изучено влияние кормовой добавки на сохранность и увеличение привесов у животных по сравнению с кормовыми антибиотиками (табл.11). Эксперименты проводили на проросятах и цыплятах. Кормовую добавку скармливали животным 3 раза в день из расчета по 0,1 см³ на 1 кг живой массы в течение 10 дней. Животные контрольной группы препаратов не получали. Определение показателей развития животных проводили через 30 дней после применения препарата.

Таблица 11. Влияние кормовой добавки Велес на сохранность и развитие животных в сравнении с кормовыми антибиотиками
Показатели	Велес 6.59	Бацитрацин	Биовит	Контроль
Поросята
Количество животных	1500	1300	1300	1300
Начальная масса, г	7120	7250	7070	7089
Конечная масса	22700	20258	20182	19174
Ежедневная прибавка, г	389,5	325,2	327,8	302,1
Сохранность, %	96,4	96,2	95,5	85,0
Цыплята-бойлеры
Количество животных	22000	25000	23000	22000
Начальная масса, г	42	45	40	43
Конечная масса	2100	1987	1900	1750
Ежедневная прибавка, г	51,5	48,6	46,5	42,6
Сохранность, %	98,7	99,0	98,0	87,0

Таким образом, скармливание кормовой добавки повышает сохранность животных и стимулирует их развитие. Кроме того, кормовая добавка может быть использована в качестве эффективного средства лечения и профилактики желудочно-кишечных инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта. При этом по эффективности кормовая добавка не уступает кормовым антибиотикам.

Исследовано влияние кормовой добавки в качестве лечебного средства при гастроэнтеритах пушных зверей (табл. 12). Эксперименты проводили на базе экспериментального хозяйства СО РАСХ. В качестве подопытных животных были использованы серебристо-черные лисицы в возрасте 4-5 месяцев с массой 4,0-4,3 кг. Кормовую добавку давали животным из расчета 0,5 см³ 3 раза в день. Лисиц контрольной группы лечили фуролизидоном по стандартной схеме. Кормовую добавку давали с питьевой водой. У животных проводили изучение гематологического статуса до и после проведения опыта - гематологические показатели. Изменение массы животных проводили через 30 дней после начала эксперимента.

Было установлено, что через 2-3 дня после скармливания кормовой добавки лисицам улучшается их общее состояние, устраняются признаки угнетения, обезвоживания, анемии и диарей, повышается аппетит и поедаемость корма. Выздоровление лисиц наступало на 4-5 день. Каловые массы приобретали оформленную форму и плотную консистенцию. Стенки брюшной полости при пальпации были безболезнены, животные были подвижны и имели хороший аппетит. Аналогичные результаты были получены в контроле при использовании фуролизидона.

Таблица 12. Эффективность кормовой добавки при лечении гастроэнтерита лисиц
Показатели	Контроль	Опыт
Начало выздоровления, дни	2-3	2-3
Продолжительность лечения, дни	5-7	4-5-7
Средняя масса до лечения, г	4190	4140
Средняя масса через 30 дней после лечения, г	4520	4620
Среднесуточный прирост, г

Таблица 13. Гематологические показатели лисиц при скармливании кормовой добавки Велес 6.59
Показатели	До начала лечения	После лечения
Контроль	Опыт	Контроль	Опыт
Эритроциты, 1012/л	8,56±0,02	8,50±0,05	9,02±0,1	9,83±0,2
Гемоглобин, г %	11,0±0,32	10,8±0,30	11,3±0,25	13,0±0,37
Лейкоциты, 109/л	5,64±0,68	5,78±0,51	6,32±0,04	6,76±0,04
Общий белок, г/л	61,2±0,29	60,8±0,4	62,5±0,65	65,5±0,58

Установлено, что применение кормовой добавки приводит к повышению количества эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина и общего белка (табл.13).

Таким образом, кормовая добавка Велес является эффективным средством лечения гастроэнтеритов лисиц. Кроме того, она может быть использована в качестве иммуностимулирующего средства.

Пример 5. Эффективность использования кормовой добавки Велес в условиях стресса

При промышленном животноводстве животные подвергаются воздействию различных стресс-факторов. В результате у них существенно нарушается развитие, снижается продуктивность и устойчивость к инфекционным заболеваниям. Нами была изучена возможность использования кормовой добавки Велес в качестве адаптогенного средства для повышения устойчивости животных к абиотическим стресс-факторам (табл.14).

Опыты были выполнены на цыплятах кросса «Смена» в условиях теплового стресса. Кормовую добавку применяли по ранее описанной схеме. Количество цыплят в контрольной и опытных группах составляло 15000 голов.

Таблица 14. Эффективность кормовой добавки в качестве противострессового препарата
Показатели	Контроль	Опыт
Живая масса, кг	1587	1750
Сохранность, %	75,6	92,1
Конверсия корма, кг/кг	2,2	1,8

Продолжительность эксперимента 42 дня.

В другой серии экспериментов было изучено влияние кормовой добавки в качестве средства для профилактики вакцинного стресса у цыплят и формирования иммунитета к вирусу ньюкаслской болезни. Для этого были сформированы контрольная и опытная группа по 120 голов. Эксперименты проводили на цыплятах-бройлерах кросса «Бройлер-6». Для эксперимента использовали животных с одинаковой массой и нулевыми титрами специфических антител к вирусу ньюкаслской болезни. Определение титра вируса проводили в реакции задержки гемагглютинации по общепринятому методу через 15 и 35 дней после вакцинации. Препарат задавали с кормом из расчета 0,5 см³ на 1 кг живого веса. Скармливание препарата начинали за 3 дня до вакцинации и продолжали в течение 7 дней после вакцинации. Контрольная группа кормовую добавку не получала.

Таблица 15. Влияние кормовой добавки Велес на формирование иммунитета к вирусу ньюкаслской болезни
Показатели	Контроль	Опыт
Титр антител, на 15 день после вакцинации, log	5,7	6,4
Титр антител на 35 день после вакцинации, log	0,4	0,4
Масса, г	1850	2020
Сохранность, %	97,2	98,9

Было показано, что под влиянием кормовой добавки происходит существенное увеличение количества антител к вирусу ньюкаслской болезни. Кроме того, скармливание кормовой добавки положительно отражается на сохранности и привесах животных (табл.15).

Таким образом, на основе данных, полученных в результате экспериментальной апробации кормовой добавки Велес, установлено, что данная добавка для корма животных эффективна при применении с целью нормализации видового состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта, повышения сохранности и продуктивности, увеличения устойчивости к стресс-факторам, инфекционным и неинфекционным заболеваниям, стимуляции роста и развития молодняка животных: сельскохозяйственных (крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, лошади), домашних (кошки, собаки и др.), диких, в том числе птицы и пушных зверей.

Препарат можно назначать животным внутрь индивидуально или групповым методом с питьем (молоком, молозивом, не содержащей асептических препаратов или кипяченой остуженной водой) и кормом (зерносмесью, комбикормов и т.д.), а также ректально после проведения очистительной клизмы.

Оптимальная норма расхода Велес при его назначении групповым методом в процессе комплексного выращивания сельскохозяйственных животных и птиц составляет не менее 1500 см³ на 1 тонну корма или воды.

Оптимальная норма расхода Велес при индивидуальном пероральном и ректальном применении составляет от 0,1 до 0,5 см³ на 1 кг живого веса.

Установлено, что эффект от применения Велес находятся в прямой зависимости от кратности его применения.

В рекомендуемых дозах кормовая добавка Велес не оказывает побочного действия и не вызывает осложнений.

Побочных явлений и осложнений при применении препарата Велес в рекомендуемых дозах не выявлено. Противопоказаний для применения не установлено.

Продукты животноводства после применения препарата могут быть использованы в пищевых целях без ограничений.