штамм гриба dendryphion penicillatum (corda) fr. 1.39, обладающий микогербицидной активностью против мака снотворного

Формула изобретения

Штамм гриба Dendryphion penicillatum (Corda) Fr. (ВИЗР) 1.39, обладающий микогербицидной активностью против мака снотворного.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к области биологической борьбы с нежелательной растительностью. Представляет собой штамм гриба Dendryphion penicillatum (Corda) Fr. 1.39, выделенный из семян Papaver somniferum.

Борьба с нелегальным производством и употреблением героина в качестве одной из профилактических мер предполагает уничтожение незаконных посевов мака. Для борьбы с маком снотворным в таких посевах могут использоваться химические гербициды (Horowitz, 1980). В последние десятилетия в связи с негативными последствиями применения химических гербицидов для борьбы с нежелательной растительностью и, в том числе, с незаконными посевами мака снотворного стало уделяться внимание разработке биологического метода с использованием фитопатогенных грибов.

Подобные исследования проводились в США, Узбекистане, России. В качестве возможных агентов биоконтроля изучались Fusarium oxysporum (Dolgovskaya et al., 1996; Podlipaev et al., 1996; Reznik et al., 1996; Connik et al., 1998), Dendryphion penicillatum и Pleospora papaveracea (Farr et al., 1999; Bailey et al., 2000, 2004; O'Neil et al., 2000; Glukhova, Abdukarimov, 2007). В России в настоящее время грибы как микогербициды в практике борьбы с нежелательной растительностью и, в том числе, с незаконными посевами наркотических растений не применяются.

Вид F. oxysporum отличается высокой гетерогенностью и несмотря на выявление большого количества специализированных форм характеризуется отсутствием строгой специфичности к определенным растениям-хозяевам (O'Donnell et al., 1998), поэтому его применение в качестве микогербицида может быть ограничено. Наряду с существующей опасностью поражения экономически значимых растений штаммы F. oxysporum могут продуцировать опасные для здоровья человека и животных микотоксины, а также могут являться возбудителями оппортунистических микозов у людей с иммунодефицитом (O'Donnell et al., 2004).

Dendryphion penicillatum и Pleospora papaveracea характеризуются высокой агрессивностью и специфичностью (Bailey et al., 2000; O'Neil et al., 2000; Glukhova, Abdukarimov, 2007). Аналогичных исследований с данными видами в России ранее не проводилось.

Наиболее близким к предлагаемому и принятым за прототип является штамм Dendryphion penicillatum Cf96, патогенность которого к маку снотворному изучалась в Белтсвилле (O'Neil et al., 2000). При опрыскивании в тепличных условиях 8-недельных растений мака снотворного споровой суспензией штамма Cf96 с концентрацией 3×10⁵ спор/мл при 24-часовом росяном периоде на 8 сутки интенсивность развития болезни не превышала 50%. Предлагаемый штамм характеризуется большей агрессивностью для мака снотворного.

Задачей изобретения является получение штамма гриба, обладающего более высокой по сравнению с прототипом микогербицидной активностью для подавления мака снотворного на территории России.

В результате скрининга коллекции штаммов микромицетов, выделенных из образцов пораженных органов мака снотворного, собранных на территории России, на патогенность были выявлены штаммы, обладающие микогербицидной активностью для мака снотворного.

Штамм был выделен из семян Papaver somniferum из Дагестана.

Идентификация штамма проведена по определителю В.А.Мельника (2000).

Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ВИЗР, ему присвоен коллекционный номер 1.39. Штамм предназначен для борьбы с незаконными посевами Papaver somniferum.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Колонии на агаризованных средах сверху и снизу оливково-бурые, по текстуре вначале бархатистые, затем войлочно-бархатистые. На агаризованной среде Чапека гифы воздушного мицелия септированные, ветвящиеся, гладкостенные, бесцветные, толщиной 2.5-5 мкм; гифы субстратного мицелия образованы вздутыми клетками,

7-9.5 мкм толщиной, извилистые, древовидно разветвленные, бледно-оливковые. Конидиеносцы простые или с несколькими веточками, иногда коленчатые,

2.5-3(6)×18-39(60) мкм, бледно-оливковые. Конидии одиночные или в цепочках, цилиндрические с закругленными концами или обратно-булавовидные, бледно-оливковые, гладкие, с 1-5 (обычно с 3) перегородками, 5.5-9×15-40 мкм. На конидиях часто формируются вторичные конидиеносцы, они обычно коленчато-изогнутые, с несколькими рубчиками, 3.5-5×9.5-19.5 мкм.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм хорошо растет как на агаризованных средах (картофельно-сахарозный (глюкозный) агар, агар Чапека), так и на жидких средах (в стационарной культуре и на качалке). На картофельной агаризованной среде без добавления сахарозы или глюкозы спороношение не развивается. На среде Чапека максимальный рост отмечен на среде с мальтозой, на втором месте по усвояемости находятся сахароза и глюкоза. Из источников азота лучше всего усваиваются нитрат натрия и пептон. Среди источников углерода наибольшая интенсивность спороношения (3.2×10⁵ спор/см²) отмечена на средах с сахарозой и глюкозой. Такая же интенсивность спороношения зарегистрирована на средах с аспарагином и нитратом натрия в качестве источников азота (табл.1).

Максимальная скорость роста на картофельно-сахарозной агаризованной среде (КСА) отмечена при 24-28°С. При повышении и понижении температуры скорость роста снижается (табл.2). Облучение культуры гриба на КСА эритемными лампами значительно повышает интенсивность спороношения. При культивировании на перловой крупе интенсивность спороношения составляет 8×10⁴ спор/г сухого субстрата.

Штамм гриба хранят в пробирках на скошенном картофельно-сахарозном агаре в бытовом холодильнике при температуре +5-8°С в течение 1-1.5 лет без пересева.

Методы использования штамма описаны в примерах, а результаты представлены в таблицах.

Пример 1. Пример культивирования штамма.

Штамм культивировали по стандартной методике (Наумов, 1937) на агаризованной картофельно-сахарозной среде в чашках Петри при 24°С в темноте в течение двух недель. Споровую суспензию получали методом смыва конидий с поверхности культуры 0,1% раствором Tween 80, количество спор в суспензии подсчитывали при помощи камеры Горяева и доводили концентрацию спор до 1×10 ⁵ спор/мл. При выращивании на картофельно-сахарозной агаризованной среде при 24°С в темноте в течение 2 недель с одной чашки Петри выход спор может достигать 4×10⁷.

Пример 2. Пример использования штамма.

Патогенность штамма определяли методом искусственного заражения растений мака снотворного. Растения выращивали в горшках на смеси садовой почвы и песка (3:1) на светоустановке при люминесцентном освещении (12/12) в течение 6 недель. Растения опрыскивали споровой суспензией при помощи пульверизатора до появления стекающих капель и помещали на 24 часа во влажные камеры. Затем горшки с растениями переносили на светоустановку. Учет симптомов проводили на 7 сутки. Определяли площадь пораженной поверхности каждого листа растения по 0-6-балльной шкале (0=нет симптомов, 1=0-5%; 2=6-25%; 3=26-75%; 4=76-95%; 5>95%; 6=гибель листа). Площадь пораженной поверхности растения определяли по формуле: 2.5×n₁+15×n₂ +50×n₃+85×n₄+97.5×n ₅+100×n₆/N, где n_x - число листьев с данным баллом, N - общее число листьев (Pfirter, Defago, 1998).

Штамм 1.39 проявляет высокую патогенность для Papaver somniferum. Через неделю после обработки в тепличных условиях растений мака снотворного споровой суспензией штамма интенсивность развития заболевания составила 98.6%, а гибель растений достигала 94.4%. По данным N.R. O'Neil et al. (2000), при опрыскивании в тепличных условиях 8-недельных растений мака снотворного споровой суспензией штамма Cf96, принятого нами за прототип с концентрацией 3×10⁵ спор/мл при 24-часовом росяном периоде на 8 сутки интенсивность развития болезни не превышала 50%. Таким образом, эффективность предлагаемого штамма в 1,5 раза выше, чем у прототипа.

Таблица 1
Влияние источников азота и углерода на рост штамма 1.39 Dendryphion penicillatum
Источник	Диаметр колонии, мм	Споровая продуктивность, спор/см2	Морфолого-культуральные особенности колоний
на 7 сут	на 14 сут
Мальтоза	46.5±1.1	84.5±1.4	5.3×10 5	Бархатистые, сверху и снизу темно-бурые
Сахароза	41.2±0.7	79.5±1.9	3.2×105	Бархатистые, сверху и снизу темно-бурые
Глюкоза	37.0±0.6	77.8±3.9	3.2×105	Рыхло-бархатистые, мучнистые, сверху и снизу от серых до темно-бурых
Лактоза	32.3±1.0	57.0±5.0	1.9×10 5	Бархатистые, сверху и снизу темно-бурые, край лопастной, древовидно разветвленный
Галактоза	24.7±1.1	35.2±1.0	8.0×10 4	Войлочные, от светло-серых до темно-бурых, реверс темно-бурый
Манит	31.0±1.4	56.5±4.8	5.3×104	Бархатистые, сверху и снизу темно-бурые, край лопастной, древовидно разветвленный
NaNO3	40.0±0.7	86.3±1.3	3.2×105	Бархатистые, сверху и снизу темно-бурые
Мочевина	36.0±1.0	54.7±1.7	1.2×104	Бархатистые, от светло-бурого в центре до темно-бурого по краям, реверс от коричневого в центре до темно-бурого по краям, глубоко лопастные
Пептон	38.0±1.6	86.0±1.7	4.2×105	Клочковато-войлочные, сверху светло-бежевые, снизу от сероватых до темно-бурых в центре
Аспарагин	34.0±0.7	57.0±4.2	3.2×105	Войлочно-бархатистые, сверху и снизу темно-бурые
NH4NO 3	18.3±0.8	27.0±0.9	0	Бархатистые, слегка радиально складчатые, сверху и снизу телесного цвета

Таблица 2
Влияние температуры на рост штамма 1.39 Dendryphion penicillatum
Температура, °С	Диаметр колоний, мм на 14 сут	Морфолого-культуральные особенности колоний
5	21.3±0.2	Колонии пушистые, сверху белые, снизу оливково-коричневые
16	40.0±0.6	-«-
20	59.5±0.9	Колонии войлочные, сверху светло-серые, снизу от светло-серого до темно-бурого цвета в центре, в периферической зоне крапчатые
24	88.8±1.2	Колонии войлочные, сверху от темно-серого до темно-бурого цвета, снизу темно-бурые
28	88.5±1.2	-«-
32	41.3±1.2	Колонии войлочно-бархатистые, сверху от темно-серого до темно-бурого цвета, снизу темно-бурые

Использованная литература

1. Мельник В.А. Класс Hyphomycetes. СПб.: Наука, 2000. 371 с.

2. Наумов Н.А. Методы микологических и фитопатологических исследований. М.-Л.: Госиздат колхозной и совхозной литературы, 1937, 272 с.

3. Bailey В.А., Apel-Birkhold Р.С., O'Neil N.R. 2000. Evaluation of infection processes and resulting disease caused by Dendryphion penicillatum and Pleospora papaveracea on Papaver somniferum. Phytopathology, 90, pp.699-709.

4. Bailey B.A., Apel-Birkhold P.C., Akingbe O.O., Ryan J.L., O'Neil N.R. & Anderson J.D. 2000. Enhancement of biocontrol of opium poppy with Pleospora papaveracea by addition of Nepl, a protein produced by Fusarium oxysporum. Phytopathology, 90, pp.812-818.

5. Bailey B.A., O'Neil N.R. & Anderson J.D. 2004. Influence of adjuvants on disease development by Pleospora papaveracea on opium poppy (Papaver somniferum). Weed Science, 52, 3, pp.424-432.

6. Connick W.J., Daigle D.J., Pepperman A.B., Hebbar K.P., Lumsden R.D., Anderson T.W.& Sands D.C. 1998. Preparation of stable, granular formulations containing Fusarium oxysporum pathogenic to narcotic plants. Biological control, 13, 2, pp.79-84.

7. Dolgovskaya M.Y., Podlipaev S.A., Reznik S.Y., Volkovitch M.G., McCarthy M. & Sands D. 1996. Screening of fungal pathogens for the control of Papaver somniferum in the former Soviet Union. Proc of the IX Intern. Symp. on Biological Control of Weeds (Stellenbosch, South Africa). Ed. by V.C.Moran and J.H.Hoffman, p.543.

8. Farr D.F., O'Neil N.R. & van Berkum P.B. 1999. Morphological and moleculare studies on Dendryphion penicillatum and Pleospora papaveracea, pathogens of Papaver somniferum. Mycologia, 92, pp.145-153.

9. Glukhova L.A., Abdukarimov A.A. Killer-strain of Pleospora papaveracea (de Not.) Sacc. - biological control agent of illegal crops Papaver somniferum L. 2007. Abstr. of XV Congress of European Mycologists, September 16-21, 2007. St. Petersburg, p.248.

10. Horowitz M. 1980. Herbicidal treatments for the control of Papaver somniferum L.Bull. Narcotics XXXII, 1, pp.33-43.

11. O'Donnell K., Kistler H.C, Cigelnik E., Ploetz R.C. 1998. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp.2044-2049.

12. O'Donnell K., Sutton D.A., Rinaldi M.G., Magnon R.C., Сох P.A., Revankar S.G., Sanche S., Geiser D.M., Juba J.Y., Burik J.-A.H., Padhye A., Anaissie E.J., Francesconi A., Walsh T.J., Robinson J.S. 2004. Genetic diversity of human pathogenic members of the Fusarium oxysporum complex inferred from multilocus DNA sequence data and amplified fragment length polymorphism analyses: evidence for the resent dispersion of a geographically widespread clonal lineage and nosocomial origin. Journal of clinical microbiology, Nov., pp.5109-5120.

13. O'Neil N.R., Jennings J.C., Bailey B.A., Farr D.F. 2000. Dendryphion penicillatum and Pleospora papaveracea, destructive seedborne pathogens and potential mycoherbicides for Papaver somniferum. Phytopathology, 90, pp.691-698.

14. Pfirter H., Defago G., 1998. The potential of Stagonospora sp. as a mycoherbicide for field bindweed. Biocontrol Science and technology, pp.93-101.

15. Podlipaev S.A., Reznik S.Y., Dolgovskaya M.Y., Volkovitch M.G. & Sands D. 1996. Fusarium strains isolated from Papaver spp in the former Soviet Union. Abstr. of First Intern. Fusarium Biocontrol Workshop, October 28-31, 1996. College Park, MD, USA, p.11.

16. Reznik S.Y., Volkovitch M.G., Podlipaev S.A., Dolgovskaya M.Y. & Sands D. 1996. Biocontrol of Papaver somniferum and Cannabis sativa in Russia with Fusarium: field evaluation. Abstr. of First Intern. Fusarium Biocontrol Workshop, October 28-31, 1996. College Park, MD, USA, p.45.