способ анализа популяционного состава иммунных клеток слюны с помощью метода проточной цитофлюориметрии

Формула изобретения

Способ анализа популяционного состава иммунных клеток слюны с помощью метода проточной цитофлюориметрии, заключающийся в том, что клетки обрабатывают моноклональными антителами к их мембранным антигенам конъюгированными флюорохромами, обработанные клетки пропускают по капилляру и воздействуют на них лучом лазера, регистрируют генерируемые сигналы и анализируют их, отличающийся тем, что перед проведением анализа иммунные клетки слюны предварительно подготавливают, отфильтровывая клетки от конгломерата пропусканием образца слюны через микропористый фильтр, затем последовательно сортируют и выделяют жизнеспособные лейкоциты с помощью двух маркеров CD45 и 7-AAD, после чего в шести пробирках на один образец слюны проводят анализ клеток определением следующей комбинации маркеров: в 1-й из CD45FITC и 7-AAD; во 2-й - из CD3FITC; CD8PE; CD45PerCP; CD4APC; в 3-й - из CD3FITC; CD16+56PE; CD45PerCP; CD19APC; в 4-й - из CD3FITC; CD13PE; CD45PerCP; CD14APC; в 5-й - негативный изотипический контроль; в 6-й - неокрашенный образец.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может использоваться в диагностике иммунодефицитных состояний.

Существует точный автоматизированный способ оценки популяционного состава иммунных клеток крови, широко используемый в мировой онкогематологической и иммунологической практике. Способ заключается в изучении клеточного состава крови или костного мозга. При изучении клеточного состава крови и костного мозга в испытуемых образцах содержится антикоагулянт. Предварительная подготовка испытуемого образца включает удаление эритроцитов путем гемолиза и последующего отмывания клеток физиологическим буферным раствором либо без отмывания. В последующем соблюдается стандартный алгоритм проведения анализа клеток. Существует способ определения клеточного состава опухолевой ткани, который требует специальной предварительной подготовки испытуемого образца, включающего гомогенизацию ткани опухоли, фильтрование через специальные фильтры с разным размером пор для удаления конгломератов клеток.

В последние 15 лет для оценки секреторного иммунитета, определения специфических антител при ВИЧ-инфекции, при заболеваниях ротовой полости, для лекарственного и гормонального мониторинга часто используют слюну как весьма перспективный материал в связи с неинвазивным способом взятия исследуемого материала. Диагностическое использование слюны является привлекательным не только в связи с неинвазивным способом получения исследуемой жидкости, но также в связи с тем, что она является, по мнению ученых, «зеркалом тела». Слюна объективно отражает уровень содержания в тканевых жидкостях естественных продуктов метаболизма, а также субстанций, введенных извне с лечебной или иной целью, эмоциональный статус человека от беспокойства до депрессии, его гормональный статус, иммунологический статус и ответ на антигены, неврологический статус, метаболизм и влияние питания.

Клеточные элементы слюны, которые создают проблемы при изучении самих секретов, вместе с тем, имеют в ряде случаев самостоятельное диагностическое значение. Форменные элементы слюны, их количество и продукты могут служить маркерами болезней ротовой полости и использоваться для ДНК-анализа. (см. книгу «Секреторный иммунитет» авторов Тепловой С.Н. и Алексеева Д.А., Челябинск, 2002 г., стр.133, 134).

Слюна отличается по своим свойствам от образцов крови меньшим содержанием иммунных клеток, присутствием, кроме иммунных, большого числа клеток покровных тканей, а также сложных белков слизистой консистенции, которые могут нарушать пропускание данной биологической жидкости через микрокапилляры цитофлюориметра и поэтому подлежат обязательному удалению.

По этой причине клеточный состав слюны в лабораториях определяют с помощью визуальной оценки под микроскопом. Недостатком данного способа является субъективность идентификации клеток по их морфологии, а также отсутствие возможности определения точного состава субпопуляций иммунных клеток.

Не существует стандартного способа проточно-цитофлюориметрического исследования клеточного состава слюны.

Известен способ цитофлюориметрического анализа популяционных клеток крови, описанный в книге «Иммунология и аллергология» под ред. Воробьева А.А. и др. Практическая медицина. М., 2006 г., стр.130.

Известный способ заключается в следующем.

Маркеры искомых клеток крови - CD-антигены - окрашивают флюоресцирующими антителами. Для окрашивания клеток (например CD4+ -, CD8+ -Т-лимфоцитов) применяют моноклональные антитела против их CD-антигенов, меченные флюоресцеинизотиоцианатом, дающим зеленую флюоресценцию, или меченные фикоэритрином, дающим красное свечение, или другими флюорохромами. Обработанные клетки пропускают через капилляр и пропускают через исследуемый образец лазерный луч, возбуждающий свечение флюорохрома. Улавливают фотоумножителем светорассеивание и по нему анализируют размер, гранулярность клетки и регистрируют флюоресценцию, свидетельствующую о количестве меченных антител, связанных с клеткой.

Недостаток известного способа заключается в том, что он является инвазивным, что в наше время распространения ВИЧ-инфекций, гепатита С и т.п. не очень удобно как для пациента, так и для медперсонала. Кроме того, диагностические возможности крови несколько ограничены.

Известен также способ цитофлюориметрического анализа популяционных клеток крови, описанный в книге Ярилина А.А. «Основы иммунологии». М.: «Медицина», 1999 г., стр.543-544, выбранный в качестве прототипа как наиболее близкий по технической сущности к заявляемому.

Известный способ заключается в следующем.

Клетки обрабатывают моноклональными антителами к их мембранным антигенам, конъюгированными флюорохромами. В случае одновременного изучения нескольких маркерных антигенов используют мечение флюорохромами, контрастными по цвету. Клетки, меченные антителами, протекают по капилляру; при воздействии на них луча лазера генерируются различные сигналы (от прямого и бокового светорассеяния и от свечения различных флюорохромов), которые регистрируются и анализируются прибором. Результаты компьютерного анализа выражаются в виде гистограмм, одно- и двухпараметрических, отражающих распределение клеток по интенсивности свечения одного или двух флюорохромов. Результаты выражают в процентах меченых клеток со средней интенсивностью свечения. В случае использования двух флюорохромов учитывают процент клеток, меченных каждым типом флюорохрома и обоими красителями одновременно.

Основной недостаток известного способа также заключается в том, что он является инвазивным, что в наше время распространения ВИЧ-инфекций, гепатита С и т.п. не очень удобно как для пациента, так и для медперсонала. Кроме того, диагностические возможности крови несколько ограничены.

Задачей является повышение удобства использования способа анализа при расширении его диагностических возможностей.

Поставленная задача решается тем, что в способе анализа популяционного состава иммунных клеток слюны с помощью метода проточной цитофлюориметрии, заключающемся в том, что клетки обрабатывают моноклональными антителами к их мембранным антигенам, конъюгированными флюорохромами, обработанные клетки пропускают по капилляру и воздействуют на них лучом лазера, регистрируют генерируемые сигналы и анализируют их, согласно изобретению перед проведением анализа иммунные клетки слюны предварительно подготавливают, отфильтровывая клетки от конгломерата пропусканием образца слюны через микропористый фильтр, затем последовательно сортируют и выделяют жизнеспособные лейкоциты с помощью двух маркеров CD45 и 7-AAD, после чего в шести пробирках на один образец слюны проводят анализ клеток определением следующей комбинации маркеров: в 1-й из CD45FITC и 7-AAD; во 2-й из CD3FITC; CD8PE; CD45PerCP; CD4APC; в 3-й из CD3FITC; CD16+56PE; CD45PerCP; CD19APC; в 4-й из CD3FITC; CD13PE; CD45PerCP; CD14APC; в 5-й - негативный изотипический контроль; в 6-й - неокрашенный образец.

Предварительная подготовка иммунных клеток слюны к проведению анализа путем их отфильтровывания от конгломерата, последующей сортировки, выделения жизнеспособных лейкоцитов с помощью двух маркеров и последующий анализ клеток определением в шести пробирках указанной комбинации ряда маркеров дает возможность неинвазивным способом с удобством для пациента провести более подробный и полный анализ иммунных клеток слюны методом проточной цитофлюориметрии.

Технический результат - возможность провести анализ иммунных клеток слюны методом проточной цитофлюориметрии.

Заявляемый способ обладает новизной в сравнении с прототипом, отличаясь от него такими существенными признаками, как выполнение перед проведением анализа иммунных клеток слюны предварительной их подготовки отфильтровыванием клеток от конгломерата путем пропускания образца слюны через микропористый фильтр, последовательная сортировка, выделение жизнеспособных лейкоцитов с помощью маркеров CD45 и 7-AAD и проведение анализа клеток определением указанной выше комбинации ряда маркеров, обеспечивающих достижение заданного результата.

Заявителю не известны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата, поэтому он считает, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень». Заявляемый способ может найти широкое применение в медицинской практике, а именно в иммунологии, а потому соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемый способ анализа популяционного состава иммунных клеток слюны с помощью метода проточной цитофлюориметрии заключается в следующем.

Перед проведением анализа иммунные клетки слюны предварительно подготавливают, отфильтровывая клетки от конгломерата путем пропускания образца слюны через микропористый фильтр. Затем последовательно сортируют и выделяют из образца слюны жизнеспособные лейкоциты с помощью двух маркеров CD45 и 7-AAD. Далее клетки обрабатывают моноклональными антителами к их мембранным антигенам, конъюгированными флюорохромами. Обработанные клетки пропускают по капилляру и воздействуют на них лучом лазера, регистрируют генерируемые сигналы и анализируют их.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Забор слюны проводят утром натощак после полоскания ротовой полости водой в сухие стеклянные флаконы без стимуляции слюноотделения. Транспортировка - в термостабильном контейнере. Проведение пробоподготовки образца для исследования - не позднее двух часов после забора.

Перед исследованием слюну подвергают последовательному фильтрованию через пористые фильтры фирмы Becton Dickinson с диаметром пор 70 и 35 мкм (Cat. № 340607; 340590) методом самотека.

В фильтрате определяют концентрацию лейкоцитов методом подсчета в счетной камере Горяева без разведения в 100 больших квадратах. Число лейкоцитов в 1 микролитре жидкости подсчитывают по формуле Х=а*4000/1600, где Х - число лейкоцитов в 1 мкл слюны, а - число лейкоцитов в 100 больших квадратах счетной камеры.

Анализ популяционного состава иммунных клеток слюны проводят с помощью наборов моноклональных антител (МКАТ), прямоокрашенных флуоресцентными красителями 4-х видов: Fluorescein izotyocyanat (FITC); Phycoerytrin (PE); Perpidin chlorophyll protein (PerCP); Allophycocyanin (АРС) фирмы Becton Dickinson серии MultiTest, а также витального красителя 7-AAD, негативного изотипического контроля и оптимизированного буферного раствора для обработки клеток CellWash той же фирмы. При проведении исследования используют полистироловые пробирки, размером 12*75 мм (BD Catalog № 352058), проточный цитофлюориметр BD FACSCanto II. Для контроля работы прибора, настройки напряжения и компенсации флюоресценции применяют набор «BD FACS 7-color setup beads» (Cat. № 335775).

Пробу подготавливают следующим образом.

50 мкл профильтрованной слюны смешивают с 20 мкл смеси МКАТ, встряхивают.

Используют шесть пробирок на один образец слюны.

В 1-й пробирке смесь МКАТ состоит из CD45FITC и 7-AAD;

во 2-й - из CD3FITC; CD8PE; CD45PerCP; CD4APC;

в 3-й - из CD3FITC; CD16+56PE; CD45PerCP; CD19APC;

в 4-й - из CD3FITC; CD13PE; CD45PerCP; CD14APC;

в 5-й - негативный изотипический контроль;

в 6-й - неокрашенный образец.

Инкубацию проводят в течение 15 минут при комнатной температуре (20-25°C) в темноте, затем добавляют 450 мкл CellWash и немедленно анализируют на проточном цитофлюориметре. Программное обеспечение «BD Facs Diva», протокол для 4-х красителей. К жизнеспособным лейкоцитам относят все клетки, отрицательные по 7-AAD и положительные по CD45. Относительное содержание клеток, несущих остальные маркеры, определяют дважды: в гейте С045-позитивных событий и в гейте лимфоцитов. Учитывают В-лимфоциты (CD19), Т-лимфоциты (CD3), хелперы/индукторы (CD3+CD4+), супрессоры/цитотоксические (CD3+CD8+), натуральные киллеры (CD3-CD16+56+), клетки, позитивные по CD14 (преимущественно моноциты и макрофаги), по CD13 (нейтрофилы, макрофаги, моноциты).

В сравнении с прототипом заявляемый способ, будучи неинвазивным, является более удобным в использовании и имеет более широкие диагностические возможности.