способ ускоренного определения количества живых клеток во взвесях дрожжеподобных грибов

Формула изобретения

Способ ускоренного определения количества живых клеток во взвесях дрожжеподобных грибов, предусматривающий приготовление исходной суспензии клеток, растворов красителей, окрашивание и последующий подсчет живых клеток, отличающийся тем, что готовят исходные разведения клеток 1·10⁷-1·10 ⁸ кл/мл по оптическому стандарту мутности в 0,85% растворе хлорида натрия, смешивают взвесь клеток и 1%-ный раствор метиленового синего в соотношении 1:1 и инкубируют 20 мин при комнатной температуре, с последующим подсчетом живых неокрашенных клеток в камере Горяева.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается ускоренного определения количества живых клеток во взвесях дрожжеподобных грибов с использованием общедоступных красителей и приборов, имеющихся в любой микробиологической лаборатории.

Современные стандартизованные методы для решения названного вопроса подразделяются на культуральные, которые заключаются подсчете количества колоний после высева тестируемой взвеси на подходящие питательные среды (Скворцов В.В. и др. Выживаемость и индикация патогенных микробов во внешней среде. - М., 1955, с.178), и методы, связанные с применением красителей - карболового фуксина Циля и метиленового синего для окрашивания нежизнеспособных бактерий и грибов по методу Ожешки (Синай Г.Я. и др. Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях. - Л., 1941, с.54).

Кроме того, для выявления живых и мертвых клеток используются флуорохромные красители в различных сочетаниях. При их использовании учет результатов проводится по измерению интенсивности свечения живых и мертвых клеток или по цвету свечения тех и других клеток (Израйлет Л.И., Мадер В.В. Способ выявления жизнеспособных и нежизнеспособных клеток гриба Beauveria bassiana. Авт.свид. № 632031, опубл. 15.10.76 г., Бюллетень № 38.; Богданов К.М. и др. Способ измерения содержания мертвых клеток в дрожжевой суспензии. Авт. свид. № 795022, опубл. 17.08.79 г.

Наиболее близким аналогом способа определения живых клеток является метод Яновского К.А. (Способ определения содержания жизнеспособных клеток в дрожжевой суспензии. Авт. свид. № 1476902, опубл. в 1979 г.), однако он требует наличия в лаборатории сканирующего микроскопа с фазовотемнопольным контрастом и фотоумножителя, сопровождается трудоемким процессом измерения величины сигнала «условной оптической плотности с последующим построением гистограммы и сложными математическими расчетами».

При изучении биологических свойств микроорганизмов одним из важнейших показателей является оценка вирулентности. Для этого экспериментальных животных заражают взвесью клеток с заранее точно определенным содержанием живых клеток в единице ее объема. Это же требование является основным при изучении антифунгального действия на дрожжеподобные грибы лекарственных препаратов и дезинфицирующих средств, а также при оценки качества приготовленных питательных сред и конструирования новых. Ни один из аналогов не удовлетворяет этому требованию.

Недостатком культурального метода, несмотря на простоту его исполнения, является, применительно к дрожжеподобным грибам, длительность, которая может колебаться, в зависимости от их родовой принадлежности, от 1 до 5 сут, а также несоответствие количества выросших колоний истинному содержанию живых клеток из-за того, что одна колония может вырасти не из одной клетки, а из их конгломерата.

Методы, основанные на окраске нежизнеспособных клеток карболовым фуксином Циля, метиленовым синим и другими красителями, выполняются на мазках, выявляют лишь мертвые клетки, но не живые, и не дают сведений об их количестве. Эти же недостатки присущи методам с применением флуорохромных красителей. К тому же они дорогостоящие и требуют наличия специального оборудования. И, наконец, общим недостатком всех названных выше аналогов является то, что они, в большей или меньшей степени, позволяют получить лишь приблизительный ответ об истинном содержании живых клеток во взвесях.

Целью изобретения является разработка простого ускоренного метода, который позволяет более точно определить количество живых клеток дрожжеподобных грибов в единице объема.

Способ основан на способности живых клеток дрожжеподобных грибов переводить метиленовый синий в лейкоформу, через 20 мин после его добавления к взвеси гриба, в результате чего они остаются неокрашенными, тогда как мертвые клетки окрашиваются в синий цвет.

Для осуществления метода готовят взвесь клеток дрожжеподобного гриба Candida или других грибов, выращенных при 37°С на плотной питательной среде, с общим содержанием живых и мертвых клеток 1·10⁷-1·10⁸ клеток/мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича в зависимости от величины клеток в 0,85% растворе хлорида натрия. Мутность тестируемой взвеси можно варьировать в зависимости от величины клеток гриба и возможности подсчета его в камере Горяева, то есть мутность исследуемой взвеси может быть меньше или больше указанных цифр.

Затем готовят основной 1% раствор красителя в дистиллированной воде при комнатной температуре. Взбалтывают до полного растворения красителя. Смешивают взвеси клеток и метиленового синего в соотношении 1:1 и инкубируют 20 минут при комнатной температуре, после чего взвесью заполняют камеру Горяева и в ней подсчитывают количество живых (не окрашенных) клеток в 5 больших квадратах камеры, расположенных по диагонали. Полученное число умножают на 50.000. Полученное число и составляет количество живых клеток в 1 мл.

Таким образом, благодаря предложенному способу можно с большой точностью в течение 20 мин подсчитать количество живых клеток дрожжеподобных грибов в единице объема.

При необходимости, в зависимости от поставленной цели опыта, можно раздельно сосчитать содержание в единице объема тестируемой взвеси и живых и мертвых клеток и по относительному количеству тех и других судить об эффективности фунгистатического или фунгицидного действия лекарственных или дезинфицирующих препаратов или о динамике накопления биомассы гриба при оценке качества питательных сред.

Пример конкретного выполнения:

Пример 1. Культура дрожжеподобного гриба Candida albicans выращена в течение 36 ч при 37°С на агаре Сабуро. Из нее приготовлена взвесь клеток в 0,85% растворе хлорида натрия с общим содержанием 1·10⁸ кл/мл по оптическому стандарту мутности. Смесь взвеси клеток с раствором метиленового синего в соотношении 1:1 инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. При подсчете в камере Горяева живых (неокрашенных) клеток в 5 больших квадратах, расположенных по диагонали, оказалось 85 клеток, что соответствовало 4,25·10 ⁶ клеток в 1 см³. Это и есть искомое количество живых клеток в 1 мл взвеси (для пересчета применяют формулу, используемую для счета эритроцитов крови).

Концентрация клеток исходной взвеси по оптическому стандарту мутности может варьировать в широком диапазоне и зависит от размера клетки того или иного дрожжеподобного гриба. Для возбудителя кандидоза это 3 мкм, гистоплазмоза - 2-3,5 мкм, бластомикоза -8-15 мкм, паракокцидиоидомикоза - 10-30 мкм. Общее правило таково - их должно быть не больше такого количества, какое можно сосчитать визуально в камере Горяева. При невозможности подсчета следует готовить серийные разведения.

При высеве исходной нативной взвеси на агар Сабуро через 24 ч получен хороший рост колоний гриба, тогда как при высеве убитых прогреванием клеток рост гриба полностью отсутствовал.

Предлагаемый способ ускоренного определения живых клеток дрожжеподобных грибов во взвесях апробирован и показал свою пригодность и для дрожжеподобных грибов, принадлежащих к родам Histoplasma, Blastomyces, Paracoccidioides.