плотная питательная среда для культивирования патогенных микобактерий и нокардиоформных актиномицетов

Формула изобретения

Плотная питательная среда для культивирования патогенных микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, содержащая солевую и яичную основы, отличающаяся тем, что она содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы - сваренный вкрутую желток куриного яйца при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин	4,0 г
калий фосфорнокислый двузамещенный	0,5 г
сернокислый магний	0,5 г
лимонная кислота	2,0 г
лимоннокислое аммиачное железо	0,05 г
пируват натрия	0,5 г
глицерин	40,0 г
агар	15,0 г
гумивит	90,0-95,0 мл
сваренный вкрутую желток куриного яйца	50,0 г
дистиллированная вода	до 1000,0 мл

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологическим исследованиям, касается питательной среды для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов и может быть использовано для характеристики микобактерий по их биологической активности.

Известны плотные питательные среды для выращивания первичных культур микобактерий, состоящие из яичной массы и солевой основы: Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Петраньяни, среды Финн-2 и Мордовского /1/. Приготовленные по прописям яичные среды разливают по пробиркам по 4-5 мл, помещают в аппарат для свертывания или в аппарат Коха в наклонном положении и стерилизуют при 85°С в течение 2 дней по 40 минут или однократно при 90°С в течение 1 часа.

Цель изобретения - плотная питательная среда для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномицетов, простая в получении и использовании.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда, содержащая солевую основу и яичную основу, содержит в качестве солевой основы L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит и дистиллированную воду, а в качестве яичной основы сваренный вкрутую желток куриного яйца при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин	4,0 г
калий фосфорнокислый двузамещенный	0,5 г
сернокислый магний	0,5 г
лимонная кислота	2,0 г
лимоннокислое аммиачное железо	0,05 г
пируват натрия	0,5 г
глицерин	40,0 г
агар	15,0 г
гумивит	90,0-95,0 мл
сваренный желток куриного яйца	250,0 г
дистиллированная вода	до 1000,0 мл

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульво-кислот 121. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /3, 4/. Гумивит - жидкость от темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливали 300,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяли последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,5 г пирувата натрия, 40,0 г глицерина и 90,0 мл гумивита. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводили до 750,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливали pH=7,1-7,2 добавлением 1 н. NaOH или 1 н. HCl. Свежие куриные яйца хорошо промывали в проточной воде, отваривали вкрутую, извлекали желтки. Расчетное количество сваренного вкрутую желтка (250 г) растирали в ступке в полученном солевом растворе до получения однородной массы, в которую добавляли 15 г агара, перемешивали, доводили объем до 1000 мл и нагревали на водяной бане до расплавления агара. Полученную среду автоклавировали в течение 30 минут при 1 атм. Приготовленную питательную среду хранили в холодильнике при температуре +4°С и использовали по мере надобности, для чего ее расплавляли, разливали по пробиркам и сквашивали.

Пример 2. В таблице 1 приведены варианты плотной питательной среды в соответствии с изобретением.

Таблица 1
Состав разных вариантов плотных питательных сред
Состав	Вариант новой среды
1-й	2-й	3-й	4-й
L-аспарагин, г	4,0	4,0	4,0	4,0
Калий фосфорнокислый двузамещенный, г	0,5	0,5	0,5	0,5
Сернокислый магний, г	0,5	0,5	0,5	0,5
Лимонная кислота, г	2,0	2,0	2,0	2,0
Лимоннокислое аммиачное железо, г	0,05	0,05	0,05	0,05
Пируват натрия, г	0,5	0,5	0,5	0,5
Глицерин, г	40,0	40,0	40,0	40,0
Агар, г	15,0	15,0	15,0	15,0
Гумивит, мл	85,0	90,0	95,0	100,0
Сваренный вкрутую желток куриного яйца, г	50,0	250,0	250,0	250,0
Дистиллированная вода, мл	до 1000,0	до 1000,0	до 1000,0	до 1000,0

Пример 3. Для определения эффективности плотной питательной среды для культивирования микобактерий использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт.Vallee и BCG), M.tuberculosis (шт. Academia) и M.avium (шт. ГИСК, 44, 659). Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60КОЕ при посеве на среду Левенштейна-Йенсена, и на все сравниваемые варианты среды в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний, интенсивность роста (± слабый, + средний, ++ обильный) и изучали культурально-морфологические свойства. Контроль - плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена. Полученные результаты (таблицы 2 и 3) показали, что оптимальными являются варианты 2 и 3 плотной питательной среды в соответствии с изобретением, обеспечивавшие более ранние сроки появления первичных колоний и более высокую интенсивность роста относительно варианта 1 и сравнимые с таковыми на среде Левенштейна-Йенсена. Повышение количества гумивита (вариант 4 плотной питательной среды в соответствии с изобретением) не сокращало сроки появления роста и не повышало его интенсивность, поэтому было нецелесообразным. Культурально-морфологические свойства и цвет выросших колоний штаммов не отличались от таковых на исходной среде.

Таблица 2
Сроки появления первичного роста патогенных микобактерий на средах разных вариантов
Штаммы	Сроки появления роста, сут
Среда в соответствии с изобретением	Среда Левенштейна-Йенсена
Вариант 1	Вариант 2	Вариант 3	Вариант 4
M.bovis (шт. Vallee)	15	13	12	12	14
M.bovis (шт. BCG)	15	15	15	15	15
M.tuberculosis (шт. Academia)	15	11	10	10	10
M.avium (шт. ГИСК)	9	7	7	7	7
M.avium (шт. 44)	12	10	9	9	7
M.avium (шт. 659)	11	10	10	10	8

Таблица 3
Массивность роста патогенных микобактерий на средах разных вариантов
Среда	Штаммы микобактерий
M.bovis Vallee	M.bovis BCG	M.tub. H 37Ra	M.tub. Acad.	M.avium ГИСК	M.avium 44	M.avium 659
Массивность роста
3 недели роста
в соответствии с изобретением	Вариант 1	±	±	+	±	±	±	±
Вариант 2	+	+	++	+	+	+	+
Вариант 3	+	+	++	+	++	+	++
Вариант 4	+	+	++	+	++	+	++
Среда Левенштейна-Йенсена	+	+	++	+	++	+	++

Пример 4. Для определения эффективности среды для культивирования нокардиоформных актиномицетов использовали референс-штамм Corynebacterium pseudotuberculosis и четыре штамма родококков, выделенные от свиней и идентифицированные в лабораторных условиях. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур и учет результатов проводили, как в примере 3. Контроль - традиционно применяемая среда Левенштейна-Иенсена. Результаты представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4
Сроки появления первичного роста нокардиоформных актиномицетов на средах разных вариантов
Штаммы	Сроки появления роста, сут
Среда в соответствии с изобретением	Среда Левенштейна-Иенсена
Вариант 1	Вариант 2	Вариант 3	Вариант 4
Rhodococcus equi, шт.12	3	2	2	2	2
Rhodococcus equi, шт.13	4	2	2	2	2
Rhodococcus equi, шт.5	3	2	2	2	2
Rhodococcus equi, шт.6	3	3	2	2	2
Corynebacterium pseudotuberculosis	3	2	2	2	2

Таблица 5:
Массивность роста нокардиоформных актиномицетов на средах разных вариантов
Среда	Штаммы нокардиоформных актиномицетов
Rhodococcu sequi 12	Rhodococcu sequi 13	Rhodococcu sequi 14	Rhodococcus equi 15	Corynebacterium pseudotuberculosis
Массивность роста
в соответствии с изобретением	Вариант 1	±	+	+	+	±
Вариант 2	+	++	++	++	+
Вариант 3	++	++	++	++	+
Вариант 4	++	++	++	++	+
Среда Левенштейна-Йенсена	++	++	++	++	+

Пример 5. Для сравнительного изучения информативности среды в соответствии с изобретением (вариант 2) и сред Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-3Л и Петраньяни использовали референс-штаммы микобактерий M.bovis (шт. Vallee, Ravenal, БЦЖ), М.avium (шт. ГИСК и 659), полевые штаммы, выделенные от положительно реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств с характерными поражениями в органах и лимфатических узлах и клинические штаммы M.tuberculosis, выделенные от больных туберкулезом. Все штаммы хранились на среде Левенштейна-Йенсена в холодильнике при температуре +4°С. Посевы культур производили нанесением одной капли суспензии микобактерий, содержавшей 30-60 КОЕ при посеве на известные среды и на среду в соответствии с изобретением. Посев каждого штамма проводили на 3-5 пробирок. При оценке роста культур учитывали сроки появления первичных колоний и изучали культурально-морфологические свойства. Интенсивность роста изучали при посеве культуры М.bovis (шт.Vallee) на все анализируемые среды. Результаты представлены в таблицах 6 и 7.

Таблица 7
Интенсивность роста М.bovis (шт.Vallee) на плотных питательных средах
Питательная среда	Сутки
7	9	10	11	12	13	14	15	16	24
Левенштейна-Йенсена	-	-	-	-	-	+	+	++	++	+++
Финн-2	-	-	-	-	-	+	+	++	++	+++
Гельберга	-	-	-	-	-	-	++	++	++	+++
ФАСТ-ЗЛ	-	-	-	-	-	-	+	++	+++	+++
Петраньяни	-	-	=	=	-	-	+	++	+++	+++
Заявленная среда	-	-	-	+	++	++	++	+++	+++	++++
Примечание: + - единичные колонии; ++ - 10-20 колоний: +++ - 21-50 колоний; ++++ - сплошной рост

Проведенные исследования подтвердили эффективность плотной питательной среды в соответствии с изобретением для культивирования микобактерий и нокардиоформных актиномецитов (сроки появления первичного роста и интенсивность роста сравнимы с таковыми на традиционно применяемых средах). Обратимость среды позволяет использовать ее в качестве наслаиваемого компонента двухслойной питательной среды при изучении биологических свойств микобактерий.

Заявляемая плотная питательная среда отличается дешевизной и технологичностью приготовления, а ее использование упрощает проведение бактериологических исследований благодаря визуализации начального роста колоний.

Источники информации

1. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. - София, 1971. - С.146-175.

2. Гришин Г.И., Слинина К.Н. Дар природы - гумивит // Практик. - 2004. - № 3-4. - С.80-82.

3. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. - 198 с.

4. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа // Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.