штамм базидиального гриба fomitopsis officinalis, проявляющий антибактериальную активность в отношении бактерий yersinia pseudotuberculosis

Формула изобретения

Штамм базидиального гриба Fomitopsis officinalis ККБГ 24, проявляющий бактерицидную активность в отношении бактерий Yersinia pseudotuberculosis.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, представляет собой штамм базидиального гриба Fomitopsis officinalis, который может быть использован в качестве основы для получения биопрепаратов и лекарственных средств, обладающих антибактериальной активностью в отношении патогенных для человека и животных бактерий Yersinia pseudotuberculosis.

Базидиальный гриб Fomitopsis officinalis активно используется в народной и официальной медицине на протяжении нескольких тысячелетий. Отличается выраженной физиологической активностью, проявляет седативное, кровоостанавливающее действие. Гриб наиболее известен в медицине стран Азиатско-Тихоокеанского региона, особенно в Японии (Кьосьев П.А. Полный справочник лекарственных растений. М., 2002. 992 с.).

В последнее время гриб начали изучать в качестве продуцента биологически активных веществ. Из плодового тела F.officinalis выделены каратиноиды, стерины, ненасыщенные жирные кислоты, агарициновая кислота, биофлаваноиды, витамины группы В, Р, Е, А, эфирные масла. Это позволит расширить ассортимент лекарственно-технического сырья для получения биологически активных компонентов, используемых в качестве основы для производства биопрепаратов, обладающих различной биологической активностью (патент РФ № 2257222, А61К 35/84, опубл. 2005.07.27).

Известно, что разные виды базидиомицетов обладают различной биологической активностью. Так, Trametes versicolor (L.Ex Fr.) Lloyd или трутовик разноцветный обладает противоопухолевой и антибактериальной активностью, Ganoderna applanatum (Pers ex Wallr.) Pat, или плоский трутовик обладает антивирусными, антибактериальными и противодиабетическими свойствами. Fomitopsis officinalis или трутовик лекарственный, известен как гриб, имеющий бактерицидную активность в отношении возбудителя туберкулеза и в парфюмерной промышленности как антиперспирант.

Изучалось антимикробное действие водных экстрактов из мицелия древоразрушающих базидиомицетов, в том числе и Fomitopsis offlcinalis в отношении стафилококковых бактерий разных видов (Staphylococcus aureus, S.caprae, S.warneri, S.cophnii). Однако результаты исследования показали, что биологической активностью в отношении стафилококковых бактерий Fomitopsis officinalis не обладает (Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Перспективы создания новых биотехнологий на основе сибирских штаммов базидиомицетов // Сб. тезисов Российской школы-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология". Москва - Пущино-на-Оке, 2006. С.135-136).

Известны антибактериальные свойства изолятов базидиального гриба Ganoderna spp. против Escherihia coli, Candida albicans u Trichophyton mentagrophytes (Smania Junior A., Smania E.P., Della Monache F., Pizzolatti M.G., Delia Monache G. Derivatization does not influence antimicrobial and antifungal activities of applanoxidic asids and sterols from Ganoderma spp. // Z.Naturforsch [C].2006. 61 (1-2): 31-34).

Известны антибактериальные свойства изолятов из плодовых тел 23 видов базидиомицетов против грамотрицательных бактерий (Escherihia coli, Pseudomonas aeruginosa) и грамположительных бактерий (Staphilociccus aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus flavus). (A1-Fatimi M., Wurster M., Kreisel H., Lindequist U. Antimicrobial Cytotoxic and antioxidant activity of selected basidiomycetes from Yemen. // Die Pharmazie. 2005 Oct; 60 (10): 776-780).

Однако среди этих 23 видов базидиомицетов гриб Fomitopsis officinalis не указывается.

Известна антибактериальная деятельность мицелия базидиального гриба Laetiporus sulphurеus, выращенного глубинно (в жидкой среде), против широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий. (Ершова Е.Ю., Тихонова О.В., Лурье Л.М., Ефременкова О. В., Комзолкина О.В., Дудник Ю.В. Антимикробная активность штаммов Laetiporus sulphurеus в условиях глубинного культивирования //Антибиотики и химиотерапия. М., 2003. Т.48. К 1. С.18-22).

Однако в отношении Yersinia pseudotuberculosis антибактериальная деятельность мицелия Laetiporus sulphureus не определялась.

Известно антимикробное действие мицелия и культуральной жидкости древоразрушающего гриба Coriolus pubescens, а так же его изолятов на Staphylococcus aureus, Escherihia coli, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis (Чхенкели В.А. Биоэкологические аспекты изучения и использования биологически активных веществ древоразрушающего гриба Coriolus pubescens (Shum.: Fr.) Quel. // Автореф. дисс. доктора биол. наук. Иркутск, 2006, 48 с).

Известна биологическая активность углекислотного экстракта плодового тела Fomitopsis officinalis (Шариков A.M., Ооржак У.С., Перьянова О.В., Ушанова В.М., Нешумаев Д.А. Бактерицидная активность метаболитов гриба Fomitopsis officinalis в отношении условно-патогенных бактерий //Грибы в природных и антропогенных системах. Труды международной конференции. Санкт-Петербург, 2005. Т 2. С.304-307). Однако в отношении Yersinia pseudotuberculosis активность углекислотного экстракта плодового тела Fomitopsis officinalis не выявлялась.

Антибактериальная активность культурального мицелия Fomitopsis officinalis в отношении каких-либо бактерий, в том числе в отношении возбудителя дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки (псевдотуберкулез) Yersinia pseudotuberculosis ранее не исследовалась и однозначно предположить, что Fomitopsis officinalis будет обладать такой активностью в отношении Yersinia pseudotuberculosis было невозможно.

На сегодняшний день биологическая активность Fomitopsis officinalis в отношении бактерий Yersinia pseudotuberculosis заявителю не известна.

Задачей изобретения является получение средства, обладающего эффективным антибактериальным действием в отношении Yersinia pseudotuberculosis - возбудителя псевдотуберкулеза человека и животных.

Техническим результатом заявленного изобретения является выделение штамма, обладающего антибактериальным действием в отношении Yersinia pseudotuberculosis, из плодового тела базидиального гриба Fomitopsis officinalis.

Штамм Fomitopsis officinalis выделен тканевым методом из плодового тела базидиального гриба Fomitopsis officinalis (Vill.: Fr.) Bond. et Sing (трутовик лиственничный, лиственничная губка), найденного на лиственнице даурской (Larix dahurica (Rupr.) Rupr.) в заповеднике "Бастак" (Еврейская автономная область).

Штамм хранится в коллекции культур базидиальных грибов Биолого-почвенного института ДВО РАН полномером ККБГ24.

Штамм Fomitopsis officinalis ККБГ 24 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки:

На сусло-агаре и агаризированной глюкозоминеральной среде образует округлые, неправильной формы колонии с волнистым краем, имеющие пушистый мицелий белого цвета. От центра колонии отходят радиальные уплотнения.

В жидкой глюкозоминеральной среде образует округлые, правильной формы, различного диаметра колонии кремового цвета, имеющие плотный центр и звездоподобные выросты по всей поверхности.

Физиолого-биохимические признаки:

Аэроб. Температурный диапазон 20-28°С. Оптимальная температура роста 25-26°С.

Оптимум pH 5,5-5,8.

Штамм усваивает различные источники углерода и азота, однако предпочитает среды, содержащие сусло и/или глюкозу.

Хранится штамм на агаризованной среде или сусло-агаре в пробирках при температуре 5-6°С. Для длительного хранения может быть использована лиофилизация, криоконсервация.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Штамм Fomitopsis officinalis ККБГ 24 выделяют тканевым методом из плодового тела базидиального гриба Fomitopsis officinalis. Мицелий штамма выращивают на чашке Петри путем посева кусочка плодового тела, на агаризованной глюкозоминеральной среде следующего состава: глюкоза - 20,0 г, NH₄NO ₃ - 3,5 г, KСl-0,5 г, K₂PO₄ - 1,0 г, MgSO₄ - 0,5 г, сусло (15° по Баллингу) - 115,0 мл, вода - до 1 л, агар - 20,0 г, pH среды - 5,6.

Культивирование осуществляют при 25°С в затемненном месте в течение 7 суток. Диаметр колонии достигает 15 см.

Пример 2. Штамм Fomitopsis officinalis ККБГ 24 выделяют тканевым методом из плодового тела базидиального гриба Fomitopsis officinalis. Мицелий штамма Fomitopsis officinalis ККБГ 24 выращивают на чашках Петри на агаризованной глюкозоминеральной среде следующего состава: глюкоза - 10,0 г, NH₄NO₃ - 3,5 г, KСl - 0,5 г, K₂PO₄ - 1,0 г, MgSO₄ - 0,5 г, сусло (15° по Баллингу) - 115,0 мл, вода - до 1 л, агар - 20,0 г pH среды -5,5. Культивирование осуществляют при 21°С в затемненном месте в течение 7 суток. Диаметр колонии достигает 10 см.

Пример 3. Штамм Fomitopsis officinalis ККБГ 24 выделяют тканевым методом из плодового тела базидиального гриба. Fomitopsis officinalis. Мицелий штамма Fomitopsis officinalis ККБГ 24 выращивают на чашках Петри на агаризованной глюкозоминеральной среде следующего состава: глюкоза - 30,0 г, NH₄NO₃ - 3,5 г, KСl - 0,5 г, K₂ PO₄ - 1,0 г, MgSO₄ - 0,5 г, сусло (15° по Баллингу) - 115,0 мл, вода - до 1 л, агар - 20,0 г, pH среды - 5,8.

Культивирование осуществляют при 22°С в затемненном месте в течение 7 суток. Диаметр колонии достигает 10 см.

Новый штамм может использоваться для промышленного получения средства, обладающего антибактериальной активностью в отношении Yersinia pseudotuberculosis - возбудителя псевдотуберкулеза человека и животных.

Определение антибактериальной активности штамма Fomitopsis officinalis ККБГ 24 проводили в отношении ряда патогенных и условно-патогенных бактерий.

В качестве тест-организмов использовали по 4 штамма следующих бактерий: Yersinia pseudotuberculosis шт. 282, 512, 907, 3515Н, Escherichia coli, Pseudomonas putida, Ps. fluorescence, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes шт. А, П, K, 10CN, Salmonella typhimurium, полученных из музея Всероссийского центра по иерсиниозам и псевдотуберкулезу (НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г.Владивосток) и из Всероссийского государственного контрольного института ветеринарных препаратов (г.Москва).

Для анализа брали выращенный штамм Fomitopsis officinalis ККБГ 24 в виде агаровых блоков, вырезанных из агаровой среды с растущим мицелием.

Определение антибактериальной активности

На чашке Петри со средой АГВ (стандартная среда для определения чувствительности микробов к антибиотикам) "газоном" засевается культура Yersinia pseudotuberculosis на которую сверху, мицелием вниз, кладется стандартный блок посевного материала Fomitopsis officinalis ККБГ 24 (выращенный по примеру 1) диаметром 5 мм, вырезанный из зоны роста колонии штамма гриба на сусло-агаре. Чашки инкубируют в термостате при 37°С в течение суток. В результате вокруг мицелиальных блоков появляются зоны отсутствия роста бактерий, что указывает на то, что штамм Fomitopsis officinalis ККБГ 24 проявляет бактерицидные (антибактериальные) свойства в отношении бактерий вида Y. pseudotuberculosis.

Эксперимент проводили в четырех повторностях. Результаты бактерицидной активности отражены в таблице 1 и показаны на чертеже.

Одновременно была исследована антибактериальная активность штамма Fomitopsis officinalis ККБГ 24 в отношении бактерий вида Escherichia coli, Pseudomonas putida, Ps.fluorescence, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium.

При этом было установлено, что штамм F.officinalis ККБГ 24 не обладает бактерицидной активностью в отношении бактерий Escherichia coli, Pseudomonas putida, Ps.fluorescence, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, однако достоверно установлено, что в отношении различных штаммов Yersinia Pseudotuberculosis штамм F.officinalis ККБГ 24 обладает бактерицидной активностью.

Таблица 1
Бактерицидная активность штамма Fomitopsis officinalis ККБГ 24 в отношении бактерий Yersinia pseudotuberculosis
Штаммы бактерий	Диаметр зон отсутствия роста бактерий, (мм)
повторности
1	2	3	4
Y. pseudotuberculosis штамм 282	23,0	24,0	17,0	14,0
Y. pseudotuberculosis штамм 907	20,0	20,0	13,0	15,0
Y. pseudotuberculosis штамм 512	20,0	18,0	14,0	14,0
Y. pseudotuberculosis штамм 3515Н	19,0	16,0	12,0	12,0

Полученные результаты сравнимы с действием известных противомикробных препаратов, а в некоторых случаях антибактериальная активность заявленного штамма F. officinalis ККБГ 24 превышает действие таковых.

Таблица 2
Общепринятые значения диаметров зон задержки роста при определении чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (среда АГВ)
Антимикробные препараты	Диаметр зон чувствительности микроорганизмов (мм)
Ампицилин	14
Азлоцилин	16
Цефазолин	19
Цефоперазон	19
Цефтазидим	18
Доксициклин	20
Гентамицин	16
Амикацин	17
Пиперациллин	18

Как видно из таблиц 1 и 2, антибактериальная активность заявленного штамма F.officinalis ККБГ 24 по примеру 1 выше антибактериальной способности самого сильного антимикробного препарата доксициклина.

Таким образом, преимуществом заявленного штамма F.officinalis ККБГ 24 является высокие антибактериальные свойства по сравнению с известными антимикробными препаратами и избирательность действия, выраженная в активном подавлении роста Y.pseudotuberculosis, не влияя при этом на другую микрофлору.