использование белков теплового шока для повышения эффективности терапий антителами

Формула изобретения

1. Способ лечения рака у индивидуума, включающий стадии:

(a) введения указанному индивидууму количества препарата очищенного белка теплового шока (HSP), где препарат очищенного HSP содержит комплексы очищенный HSP - пептид, содержащие HSP, ковалентно или нековалентно присоединенные к пептиду, и где комплексы HSP - пептид проявляют антигенность указанного рака; и

(b) введения указанному индивидууму количества иммуногенного реагента, где иммунореактивный реагент специфически взаимодействует с антигеном, выбранным из группы, состоящей из VEGF, EGF-R, HER2/NEU, CD25 и CD20, или является анти-СТLА-4 или анти- 41ВВ антителом,

где указанные количества проявляют синергизм при указанном лечении, обеспечивая лечение указанного рака у указанного индивидуума.

2. Способ по п.1, где указанным иммунореактивным реагентом является профилактическое или терапевтическое антитело.

3. Способ по п.1, где указанным иммунореактивным реагентом является моноклональное антитело.

4. Способ по п.1, где указанный препарат очищенного HSP содержит HSP, выбранный из группы, состоящей из hsp60, hsp70, hsp90, gp96, hsp110, grp170 и калретикулина по отдельности или в сочетании друг с другом.

5. Способ по п.1, где указанный препарат очищенного HSP содержит комплексы очищенный HSP-пептид, выбранные из группы, состоящей из комплексов hsp60-пептид, комплексов hsp70-пептид, комплексов hsp90-пептид комплексов gp96-пeптид, комплексов hsp110-пептид, комплексов grp170-пeптид и комплексов калретикулин-пептид по отдельности или в сочетании друг с другом.

6. Способ по п.1, где индивидуумом является человек и препарат очищенного HSP содержит HSP млекопитающего.

7. Способ по п.1, где препарат очищенного HSP вводят перед введением иммунореактивного реагента.

8. Способ по п.1, где препарат очищенного HSP вводят одновременно с введением иммунореактивного реагента.

9. Способ по п.1, где препарат очищенного HSP вводят после введения иммунореактивного реагента.

10. Способ по п.1, где рак выбран из группы, состоящей из карциномы толстой кишки, рака молочной железы, рака яичника, рака простаты, аденокарциномы, бронхогенной карциномы, почечно-клеточного рака, карциномы легких, мелкоклеточной карциномы легких, лейкоза, хронического миелоцитарного лейкоза, меланомы и лимфомы.

11. Способ по п.1, где комплексы очищенный HSP - пептид содержат пептиды с пептидной последовательностью, которая является производной последовательности той же мишени, распознаваемой иммунореактивным реагентом, и где иммунореактивный реагент специфически взаимодействует с антигеном, выбранным из группы, состоящей из VEGF, EGF-R, HER2/NEU, CD25 и CD20.

12. Способ по п.1, где указанные комплексы очищенный HSP - пептид содержат пептиды, полученные из опухоли.

13. Способ по п.1, где указанные комплексы очищенный HSP - пептид содержат пептиды, которые содержат эпитоп опухоль-специфического антигена или антигена, связанного с опухолью.

14. Способ по п.1, где комплексы очищенный HSP - пептид получены у индивидуума, которому вводили эти комплексы.

15. Способ по п.1, где иммунореактивный реагент является очищенным.

16. Способ по п.1, где указанное количество иммунореактивного реагента вводят указанному индивидууму в дозе, которая ниже порога проявления побочных эффектов.

17. Способ по п.1, где указанный индивидуум частично или полностью не отвечает либо на стадию (а), либо на стадию (b).

18. Способ по п.1, где указанные комплексы очищенный HSP - пептид очищены из клеток указанного рака.

19. Способ по п.1, где указанное количество очищенного препарата HSP вводят указанному индивидууму в количестве, не эффективном для индукции иммунного ответа в отсутствие стадии (b).

20. Способ по п.1, где указанное количество иммунореактивного реагента вводят указанному индивиду в количестве, не эффективном для индукции иммунного ответа в отсутствие стадии (а).

21. Способ по п.1, где указанный иммунореактивный реагент специфически взаимодействует с CD25.

22. Способ по п.1, где указанный иммунореактивный реагент представляет собой анти- CTLA-4 антитело.

23. Способ усиления иммунного ответа на первый антиген, вызванного препаратом очищенного HSP у индивидуума, которому вводят препарат очищенного HSP, включающий введение индивидууму иммунореактивного реагента, где иммунореактивный реагент специфически взаимодействует со вторым антигеном, выбранным из группы, состоящей из CD25 и CD20, или является анти-CTLA-4 или анти- 41ВВ антителом, где препарат очищенного HSP содержит комплексы очищенный HSP-пептид, содержащие HSP, ковалентно или нековалентно присоединенные к пептиду, и где комплексы HSP - пептид проявляют антигенность указанного первого антигена, и где указанные количества проявляют синергизм в отношении указанного усиления, усиливая таким образом указанный иммунный ответ.

24. Способ по п.23, где указанный препарат очищенного HSP содержит HSP, выбранный из группы, состоящей из hsp60, hsp70, hsp90, gp96, hsp110, grp170 и калретикулина.

25. Способ по п.24, где HSP представляет собой gp96.

26. Способ по п.24, где HSP представляет собой hsp70.

27. Способ по п.23, где указанным иммунореактивным реагентом является моноклональное антитело.

28. Способ по п.23, где указанный препарат очищенного HSP содержит комплексы очищенный HSP - пептид, выбранные из группы, состоящей из комплексов hsp60-пептид, комплексов hsp70-пептид, комплексов hsp90-пептид, комплексов gp96-пeптид, комплексов hsp110-пептид, комплексов grp170-пептид и комплексов калретикулин-пептид, по отдельности или в сочетании друг с другом.

29. Способ по п.23, где индивидуумом является человек и препарат очищенного HSP содержит HSP млекопитающего.

30. Способ по п.23, где указанный первый антиген представляет собой антиген рака.

31. Способ по п.30, где указанные комплексы очищенный HSP - пептид содержат пептиды, полученные из опухоли указанного рака.

32. Способ по п.30, где указанный первый антиген содержит эпитоп опухоль-специфического антигена или антигена, связанного с опухолью.

33. Способ по п.23 или 30, где указанные комплексы очищенный HSP - пептид получены у индивидуума, которому вводили эти комплексы.

34. Способ по п.23, где указанный иммунореактивный реагент является очищенным.

35. Способ по п.23, где указанный иммунореактивный реагент специфически взаимодействует с CD25.

36. Способ по п.23, где указанный иммунореактивный реагент представляет собой анти-СТLА-4 антитело.

Описание изобретения к патенту

Описание

Данное изобретение заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 60/377483, поданной 2 мая 2002, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей ее полноте.

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и фармацевтическим композициям, полезным для профилактики и лечения любого заболевания, где лечение заболеваний может быть сделано более эффективным путем усиления иммунной реакции, такого как инфекционные заболевания, первичные и метастатические неопластические заболевания (т.е. рак) или нейродегенеративные или амилоидные заболевания. В частности, рассматриваемое изобретение относится к способам, включающим введение белков теплового шока/стресса (HSP) или комплексов HSP, по отдельности или в комбинации друг с другом, в сочетании с введением иммунореактивного реагента. Изобретение предлагает также фармацевтические композиции, содержащие один или несколько HSP или комплексов HSP в комбинации с иммунореактивным реагентом. Кроме того, изобретение предусматривает использование способов и композиций по данному изобретению для повышения эффективности или улучшения пассивной иммунотерапии и функции эффекторных клеток.

2. Предпосылки изобретения

2.1 Иммунные реакции

Иммунная система организма отвечает двумя типами реакций на патогены или другие вредные агенты - гуморальной реакцией и клеточно-опосредованной реакцией (см. Alberts, B. еt al., 1994, Molecular Biology of the Cell. 1195-96). Когда покоящиеся В-клетки активируются антигеном с пролиферацией и созреванием в антителосекретирующие клетки, они продуцируют и секретируют антитела с уникальным антигенсвязывающим сайтом. Эта секретирующая антитела реакция известна как гуморальная реакция. С другой стороны, иные реакции Т-клеток собирательно называют клеточно-опосредованными иммунными реакциями. Имеется два основных класса Т-клеток - цитотоксические Т-клетки и хелперные Т-клетки. Цитотоксические Т-клетки непосредственно убивают клетки, которые инфицируются вирусом или некоторыми другими внутриклеточными микроорганизмами. Хелперные Т-клетки, наоборот, помогают стимулировать реакции других клеток: они помогают, например, активировать макрофаги, дендритные клетки и В-клетки (см. Alberts, B. еt al., 1994, Molecular Biology of the Cell, 1228). Как цитотоксические Т-клетки, так и хелперные Т-клетки распознают антиген в форме пептидных фрагментов, которые генерируются деградацией чужеродных белковых антигенов внутри клетки-мишени, и оба типа клеток, таким образом, зависят от молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС), которые связывают эти пептидные фрагменты, несут их к поверхности клеток и презентируют их здесь Т-клеткам (см. Alberts, B. еt al., 1994, Molecular Biology of the Cell, 1228). Молекулы МНС обычно находятся во множестве на антигенпрезентирующих клетках (АРС).

Помимо приобретенного иммунитета, обсуждаемого выше, врожденный иммунитет также играет роль в иммунной реакции организма. Врожденная иммунная система является первой линией иммунной защиты против заболевания и обеспечивает широкие, но относительно неспецифические иммунные защиты хозяина, которые лишены свойств антигенной специфичности и иммунологической памяти, которые характеризуют приобретенный иммунитет. Эффекторные механизмы врожденного иммунитета включает антимикробные пептиды, гранулоциты и фагоциты, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки и альтернативный комплементный путь, которые взаимодействуют с адаптивными иммунными реакциями и контролируют их. Medzhitov and Janeway, 2000, New England J. Med 343: 338-344; Moretta, 2002, Nature Reviews Immunology 2: 957-964.

2.2 Презентация антигена

Антигенпрезентирующие клетки (АРС), такие как макрофаги и дендритные клетки, являются ключевыми компонентами врожденных и приобретенных иммунных реакций. Антигены обычно презентируются Т-клеткам на поверхности других клеток, APC. APC могут улавливать переносимые в лимфе и крови антигены и после интернализации и деградации презентировать антигенные пептидные фрагменты, связанные с молекулами клеточной поверхности главного комплекса гистосовместимости (МНС), Т-клеткам. АРС могут затем активировать Т-клетки (клеточно-опосредованная реакция) с клональной экспансией, и эти дочерние клетки могут развиваться либо в цитотоксические Т-клетки, либо хелперные Т-клетки, которые, в свою очередь, активируют В-клетки (гуморальная реакция) тем же самым МНС-связанным антигеном с клональной экспансией и продуцированием специфического антитела (см. Alberts, B, et al., 1994, Molecular Biology of Cell. 1238-45).

Обнаружены два типа антигенпроцессирующих механизмов. Первый тип включает поглощение белков посредством эндоцитоза клетками АРС, фрагментацию антигенов в везикулах, ассоциацию с молекулами МНС класса II и экспрессию на клеточной поверхности. Этот комплекс распознается хелперными Т-клетками, экспрессирующими CD4. Другой тип используется для белков, таких как вирусные антигены, которые синтезируются в клетках и, по-видимому, включает фрагментацию белков в цитоплазме. Пептиды, продуцированные таким образом, становятся связанными с молекулами МНС класса I и распознаются цитотоксическими Т-клетками, экспрессирующими CD8 (см. Alberts, B. еt al., 1994, Molecular Biology of the Cell. 1233-34).

Стимуляция Т-клеток включает ряд дополнительных молекул, экспрессирующихся как Т-клетками, так и АРС. Костимуляторными молекулами являются те дополнительные молекулы, которые стимулируют рост и активацию Т-клеток. При стимуляции костимуляторные молекулы индуцируют высвобождение цитокинов, таких как интерлейкин 1 (IL-1) или интерлейкин 2 (IL-2), интерферон и т.д., которые стимулируют рост Т-клеток и экспрессию поверхностных рецепторов (см. Paul, 1989, Fundamental Immunology. 109-10).

APC обычно находятся в состоянии покоя, и для их функционирования требуется активация. Идентичность сигналов, которые активируют АРС, является критическим и неразрешенным вопросом (см. Banchereau, et al., 1998, Nature 392: 245-252; Medzhitov, et al., 1998, Curr. Oрin. Immunol. 10: 12-15).

2.3 Пассивная иммунотерапия

Пассивная иммунотерапия (называемая также пассивной иммунизацией) относится к введению иммунореактивного реагента, например молекулы, содержащей антигенсвязывающий район, направленный против эпитопа на патогене, опухоли или патогенном белке, и домен с Fc-рецепторсвязывающим районом, комплементсвязывающим районом или районом, который опосредует действия эффекторных клеток, таких как антитела, непосредственно пациенту. Иммунореактивный реагент может быть введен профилактически, например для ингибирования инфекции, или терапевтически для снижения или исключения инфекции, для снижения или исключения раковых клеток или для выведения или удаления патогенных белков, например белковых агрегатов или отложений, которые имеют место при нейродегенеративном и/или амилоидогенном заболевании. Пассивная иммунотерапия отличается от активной иммунотерапии, которая включает иммунизацию пациента антигеном для индуцирования in vivo иммунной реакции, например для продуцирования антител или цитотоксических Т-лимфоцитов. Напротив, при пассивной иммунотерапии иммунореактивный реагент, например антитело, вводят пациентам и это приводит к стимуляции эффекторных клеток, например клеток с Fc-рецепторами, способными взаимодействовать с Fc-частью (т.е. областью, связывающей Fc-рецептор) введенного антитела или другого иммунореактивного реагента, что приводит к клеточным иммунным функциям, таким как антителозависимая клеточная цитотоксичность (например, ADCC) или антителоопосредованная опсонизация и/или фагоцитоз, направленный против клетки, патогена или белка, обладающего эпитопом, распознаваемым антителом. Эффективность антителоопосредованной терапии опухоли, которая зависит от функций эффекторных FcR-клеток, может быть модифицирована посредством использования специфических цитокинов; Keller, et al., 2000, J. Immunol. 164:5746-5752. Терапевтические и/или профилактические антитела включают, но не ограничиваются перечисленным, антитела, которые связываются с молекулами клеточной поверхности и противодействуют нормальной функции (например, блокирующие антитела), антитела, которые связываются с молекулами клеточной поверхности и имитируют нормальную функцию (антитела-агонисты), и секвестрирующие антитела.

2.4 CTLA-4

Цитотоксический Т-лимфоцитный антиген-4 (CTLA-4) является гликопротеином, который экспрессируется на поверхности активированных Т-клеток на низких уровнях. CTLA-4 является сходным с CD28 и имеет более высокую аффинность связывания для членов семейства В7 (например, В7-1 и В7-2), чем CD28. Связывание CTLA-4 на Т-лимфоцитах с В7-лигандом опосредует негативный сигнал, ингибирующий секрецию IL-2 и клеточную пролиферацию. В итоге CTLA-4-опосредованное ингибирование активации Т-клеток приводит к «выключению» регулируемых Т-клетками иммунных реакций, особенно ранних событий активации Т-клеток (Brunner, et al., 1999 J. Immunol. 162: 5813-5820).

Недавно было описано, что блокада функции CTLA-4 посредством лечения антителами против CTLA-4 привела к усилению различных иммунных реакций и содействовала индуцированию опухолевого иммунитета (Leach, et al., 1996, Science 271: 1734-1736; публикации РСТ WO 00/322231 и WO 01/14424). У мышей, трансплантированных клетками меланомы В16, обнаруживали регрессию опухоли и повышенные уровни CD8⁺-Т-клеток при комбинационном лечении моноклональными антителами (mAb) против CTLA-4 и вакциной GM-CSF-продуцирующих опухолевых клеток. Было отмечено, что применение этого комбинационного лечения при профилактическом варианте (т.е. перед введением клеток опухоли) приводило к полной защите даже в отсутствие CD8 ⁺-Т-клеток. Данные продемонстрировали, что терапевтические аутореактивные CD8⁺-Т-клетки могут быть индуцированы у имеющих опухоль мышей (Van Elsas, et al., 2001, J. Exp. Med. 194: 481-489). Совместное введение антител против CTLA-4 в комбинации с вакциной опухолевых клеток, продуцирующих GM-CSF, продемонстрировало эффективность против установившихся клеток меланомы В16-BL6, но незначительный эффект был отмечен, когда применяли только одну из терапий (Van Elsas, et al., 1999, J. Exp. Med. 190: 355-366). Кроме того, было также отмечено, что блокада CTLA-4 коррелирует с повышением хелперной функции и индуцированной амплификацией CD4⁺-Т-клеток (Hernandez, et al., 2001, J. Immun. 3908-3914). Было отмечено также, что блокада посредством введения антител против CTLA-4 приводила к повышенной резистентности хозяина к внутриклеточному патогену, повышению числа IFN-g- и IL-4-продуцирующих клеток в печени и селезенке и усиленной, получающейся в результате печеночной гранулематозной реакции (Murphy, et al., 1998, J. Immun. 4153-4160).

2.5 Белки теплового шока

Белки теплового шока (HSP), которые называются в настоящем описании также взаимозаменяемым образом белками стресса, могут быть выбраны среди любых клеточных белков, которые удовлетворяют следующим критериям. Он является белком, внутриклеточная концентрация которого повышается, когда клетка подвергается стрессовому стимулу, он способен связывать другие белки или пептиды и он способен высвобождать связанные белки или пептиды в присутствии аденозинтрифосфата (АТР) или при низком значении рН. Кроме того, HSP включают конститутивно экспрессирующиеся консервативные клеточные гомологи белков, индуцированных стрессом. Обнаружено, что семейства Hsp-60, Hsp-70 и Hsp-90 состоят из белков, относящихся к белкам стресса по аминокислотной последовательности, например, имея больше чем 35% аминокислотную идентичность, но уровни их экспрессии не изменяются под действием стрессовых стимулов. В соответствии с этим предполагается, что определение белка стресса, используемое в настоящем описании, включает другие белки, их мутеины, аналоги и варианты, имеющие, по меньшей мере, 35-55%, предпочтительно 55-75% и наиболее предпочтительно 75-85% аминокислотную идентичность с членами трех семейств, уровни экспрессии которых в клетках увеличиваются в ответ на стрессовые стимулы.

Первыми идентифицированными белками стресса были HSP. Как указывает их название, HSP синтезируются клеткой в ответ на тепловой шок. На сегодняшний день на основе молекулярной массы было идентифицировано три основных семейства HSP. Семейства назвали hsp60, hsp70 и hsp90, где числа отражают приблизительную молекулярную массу белков стресса в килодальтонах. Впоследствии было обнаружено, что многие члены этих семейств индуцируются в ответ на другие стрессовые стимулы, включающие, но не ограничивающиеся перечисленным, недостаток питательных веществ, метаболическое нарушение, кислородные радикалы и инфекцию внутриклеточными патогенами (См. Welch, May 1993, Scientific American 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething, et al., 1992, Nature 355:33-45; and Lindquist, et al., 1988, Annu. Rev. Genetics 22: 631-677), причем описание указанных публикаций включено в настоящее описание посредством ссылки. Предполагается, что hsps/белки стресса, относящиеся ко всем этим трем семействам, могут быть использованы при осуществлении данного изобретения.

HSP являются внутриклеточными молекулами, которые представлены в большом количестве, являются растворимыми и высоко консервативными. В качестве внутриклеточных «сопроводителей» HSP принимают участие во многих биохимических путях созревания белков и функционально активны во время стресса и нормального клеточного гомеостаза. Многие стрессы могут нарушить трехмерную структуру или складчатость белков клеток. Оставшиеся некорректированными, ошибочно сложенные белки образуют агрегаты, которые могут в конце концов привести к гибели клетки. HSP связываются с этими поврежденными белками, помогая им снова сложиться в их правильные конформации. При нормальном (не стрессовом) клеточном гомеостазе HSP требуются для клеточного метаболизма. HSP помогают вновь синтезированным полипептидам складываться и, таким образом, предотвращают преждевременные взаимодействия с другими белками. Кроме того, HSP помогают в переносе белков через различные компартменты клеток.

Основные HSP могут аккумулироваться до очень высоких уровней в подвергнутых стрессу белках, но они встречаются при уровнях от низких до умеренных в клетках, которые не были подвергнуты стрессу. Например, высоко индуцибельный белок hsp70 трудно поддается обнаружению при нормальных температурах, но становится одним из наиболее активно синтезируемых белков в клетке при тепловом шоке (Welch, et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 1198-1211). В противоположность этому белки hsp90 и hsp60 представлены в большом количестве при нормальных температурах в большинстве, но не во всех клетках млекопитающих и дополнительно индуцируются нагревом (Lai, et al., 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 2802-2810; van Bergen en Henegouwen, et al., 1987, Genes Dev. 1: 525-531).

Обнаружено, что HSP обладают иммунологическими и антигенными свойствами. Иммунизация мышей белком gp96 или р84/86, выделенным из определенной опухоли, делает мышей иммунными к этой определенной опухоли, но не к антигенно отличным опухолям (Srivastava, P.K., et al., 1988, Immunogenetics 28:205-207; Strivastava, P.K., et al., 1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167: 109-123). Кроме того, обнаружено, что белок hsp70 индуцирует иммунитет к опухоли, из которой он был выделен, но не к антигенно отличным опухолям. Однако обнаружено, что обедненный пептидами hsp70 теряет свою специфическую иммунологическую активность (Udono, M., and Srivastava, P.K., 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396). Эти наблюдения позволяли предположить, что белки теплового шока не являются антигенными сами по себе, но образуют нековалентные комплексы с антигенными пептидами и комплексы могут индуцировать специфический иммунитет к антигенным пептидам (Strivastava, P.K., 1993, Adv. Cancer Res. 62: 153-177; Undono, H., et al., 1994, J. Immunol. 152: 5398-5403; Suto, R., et al, 1995, Science 269: 1585-1588). Недавно было обнаружено, что hsp60 и hsp70 стимулируют продуцирование провоспалительных цитокинов, таких как TNF и IL-6, моноцитами, макрофагами или цитотоксическими Т-клетками (Breloer et al., 1999, J. Immunol. 162: 3141-3147; Chen et al., 1999, J. Immunol. 162: 3212-3219; Ohashi et al., 2000, J. Immunol. 164: 558-561; Asea et al., 2000, Nature Medicine, 6: 435-442; Todryk et al., 1999, J. Immunol. 163: 1398-1408). Обнаружено также, что hsp70 нацелено действуют на незрелые дендритные клетки и делает их более способными к захвату антигенов (Todryk et al., 1999, J. Immunol. 163: 1398-1408). Постулировано, что высвобождение или индукция экспрессии hsp60 и hsp70, например, вследствие гибели клеток может служить сигналом того, что иммунная реакция должна быть повышена (Chen et al., 1999, J. Immunol. 162: 3212-3219; Ohashi et al., 2000, J. Immunol. 164: 558-561; Todryk et al., 1999, J. Immunol. 163: 1398-1408; Basu et al., 2000, Intl. Immunol. 12: 1539-1546).

Использование нековалентных комплексов HSP и пептида, очищенного из раковых клеток, для лечения и профилактики рака описано в патентах США № № 5750119, 5837251 и 6017540.

Использование комплексов HSP-пептид для сенсибилизации антигенпрезентирующих клеток in vitro для использования в приемлемой иммунотерапии описано в патентах Соединенных Штатов № № 5985270 и 5830464.

Комплексы HPS-пептид могут быть также выделены из инфицированных патогеном клеток и использованы для лечения или профилактики инфекции, вызванной патогеном, таким как вирусы и другие внутриклеточные патогены, включая бактерии, простейшие, грибы и паразиты; см. патенты Соединенных Штатов № № 5961979 и 6048530.

Иммуногенные комплексы HSP-пептид могут быть также получены образованием комплексов HSP и антигенных пептидов in vitro, использование таких комплексов для лечения и профилактики раковых и инфекционных заболеваний описано в патентах Соединенных Штатов № № 5935576 и 6030618. Использование белка теплового шока в комбинации с определенным антигеном для лечения раковых или инфекционных заболеваний описано в публикации РСТ WO 97/06821, датированной 27 февраля 1997.

Очистка комплексов HSP-пептид из лизата клеток была описана ранее; см., например, патенты Соединенных Штатов № № 5750119 и 5997873.

3. Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, применимым для продуцирования или усиления иммунной реакции, включающим введение препарата белка теплового шока (HSP) с иммунореактивным реагентом. Способы и композиции являются применимыми для улучшения результата лечения субъекта, которому введен только препарат HSP и/или только иммунореактивный реагент. В частности, изобретение предлагает способы и композиции, применимые для продуцирования или усиления иммунной реакции, вызванной иммунореактивным реагентом, и/или для повышения эффективности иммунореактивного реагента, включающие введение препарата HSP. В соответствии с этим способы и композиции включают введение препарата HSP для повышения эффективности пассивной иммунотерапии. В специфических вариантах осуществления такие способы и композиции включают введение препарата HSP и являются применимыми для повышения способности иммунореактивного реагента стимулировать функцию эффекторных клеток. Настоящее изобретение предусматривает также способы и композиции, применимые для усиления иммунной реакции, вызванной препаратом HSP, включающие введение иммунореактивного реагента. Предложенные данным изобретением способы и композиции изобретения являются полезными для профилактики и лечения заболеваний и нарушений, где эффективность лечения или профилактики может быть повышена в результате усиленной иммунной реакции, такими заболеваниями являются инфекционные заболевания, первичные и метастатические неопластические заболевания (т.е. рак), нейродегенеративные или амилоидные заболевания, или белковые отложения или амилоидогенные заболевания. Таким образом, изобретение включает способы и композиции, предназначенные для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, первичных и метастатических неопластических заболеваний (т.е. рака), нейродегенеративных или амилоидных заболеваний или белковых отложений или амилоидогенных заболеваний, включающие введение одного или нескольких иммунореактивных реагентов в комбинации с препаратом HSP.

В одном варианте осуществления изобретение предлагает способ индуцирования или усиления иммунной реакции, вызванной иммунореактивным реагентом, посредством использования препарата HSP, где препарат HSP усиливает иммунную реакцию, вызванную количеством иммунореактивного реагента, которое в противном случае является субоптимальным для индуцирования иммунной реакции, когда его используют отдельно. В некоторых вариантах осуществления, когда препарат HSP не используют в сочетании с иммунореактивным реагентом для индуцирования иммунной реакции, введение только указанного препарата HSP не вызывает или не усиливает указанную иммунную реакцию. В альтернативных вариантах осуществления как препарат HSP, так и иммунореактивный реагент могут вызывать иммунную реакцию при введении по отдельности и/или в комбинации.

В некоторых вариантах осуществления препарат HSP может усилить действия иммунореактивного реагента аддитивным образом. В предпочтительном варианте осуществления препарат HSP усиливает действия иммунореактивного реагента синергическим образом. В другом варианте осуществления иммунореактивный реагент усиливает действие препарата HSP аддитивным образом. Действия предпочтительно усиливаются синергическим образом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение включает способы лечения или профилактики заболевания, которые обеспечивают лучшие терапевтические профили, чем профили при введении только препарата HSP и/или только иммунореактивного реагента. Изобретение включает комбинированные терапии, которые имеют аддитивную активность или аддитивное терапевтическое действие при снижении или исключении нежелательных или неблагоприятных эффектов. Изобретение включает также синергические комбинации, у которых терапевтическая эффективность выше, чем аддитивная, в то время как нежелательные или неблагоприятные эффекты снижаются или исключаются. В некоторых вариантах осуществления способы изобретения делают возможным лечение или профилактику заболеваний и нарушений, где лечение становится более эффективным посредством повышения иммунной реакции с использованием более низких и/или менее часто вводимых доз иммунореактивных реагентов и/или HSP для снижения числа случаев нежелательных или неблагоприятных эффектов, вызванных введением иммунореактивных агентов и/или только HSP, при сохранении или повышении эффективности лечения, предпочтительно повышении восприимчивости пациента, повышении эффективности терапии и/или снижении нежелательных и неблагоприятных эффектов.

Способы и композиции настоящего изобретения являются полезными не только для неподвергнутых лечению пациентов, но являются также полезными при лечении пациентов, частично или полностью толерантных к введению только HSP или введению только иммунореактивных реагентов. В различных вариантах осуществления изобретение предлагает способы и композиции, полезные для лечения заболеваний или нарушений, которые, как было обнаружено, являются или могут быть невосприимчивыми или толератными к терапиям, включающим введение любого из двух или обоих из иммунореактивных реагентов и HSP, причем эффективность лечения повышается посредством повышения иммунной реакции.

Препараты HSP, применимые в способах и композициях настоящего изобретения, могут включать, но не ограничиваются перечисленным, свободные HSP, не связанные ни с какой молекулой, и молекулярные комплексы HSP с другой молекулой, такой как пептид. Комплекс HSP-пептид содержит HSP, ковалентно или нековалентно присоединенный к пептиду. Комплекс HSP-пептид может состоять из HSP, связанных с пептидами, происходящими из представляющего интерес типа опухоли, патогена или клетки и/или белка. В одном варианте осуществления указанный пептид является той мишенью, которая узнается иммунореактивным реагентом, или получен из представляющего интерес типа опухоли, патогена или клетки и/или белка. В альтернативном варианте комплекс HSP-пептид может состоять из HSP, связанных с эндогенным пептидом, но не обязательно пептидом из того же источника, как и мишень иммунореактивного реагента. Некоторые способы изобретения могут не требовать ковалентного или нековалентного присоединения HSP к любым специфическим антигенам или антигенным пептидам перед введением субъекту. Препараты HSP, применимые в способах и композициях настоящего изобретения, включают также слитые белки HSP. Слитые белки HSP могут состоять из HSP, слитых с любой антигенной пептидной последовательностью, где пептидная последовательность получена из представляющего интерес типа опухоли, патогена или клетки и/или белка. В одном варианте осуществления указанная пептидная последовательность является той же самой мишенью, распознаваемой иммунореактивным реагентом, или получена из представляющего интерес типа опухоли, патогена или клетки и/или белка.

Иммунореактивные реагенты, применимые в способах и композициях настоящего изобретения, могут включать, но не ограничиваются перечисленным, антитела, молекулы или белки, сконструированные методом генной инженерии для включения в них антигенсвязывающей части антитела, молекулы или белки, сконструированные методом генной инженерии для включения в них антигенсвязывающего домена, который опосредует антителозависимые иммунные реакции, пептид или домен, который взаимодействует специфически с представляющим интерес антигеном, или молекулу, которая имеет любой антигенсвязывающий домен, который взаимодействует с представляющим интерес антигеном/эпитопом, и домен константной области антитела, который опосредует антителозависимые иммунные реакции, такие как реакции или процессы эффекторных клеток. Связывающий антиген домен распознает специфическую мишень, и домен константной области опосредует антителозависимые иммунные реакции эффекторных клеток.

В предпочтительных вариантах осуществления иммунореактивным реагентом является антитело предпочтительно с терапевтическими или профилактическими использованиями in vivo, и изобретение предлагает способы и композиции, применимые для повышения эффективности таких терапевтических или профилактических антител, включающие введение препарата HSP. В некоторых вариантах осуществления способность антитела стимулировать функцию эффекторных клеток усиливают введением препарата HSP. В определенном варианте осуществления антителозависимую клеточную цитотоксичность и/или фагоцитоз опухолевых клеток или патогенов или патогенных белков и пептидов повышают посредством использования терапевтического антитела в комбинации с препаратом HSP. Терапевтическим антителом предпочтительно является цитотоксическое и/или опсонизирующее антитело. В соответствии с этим изобретение предлагает способы и композиции, в которых препарат HSP используют в комбинации с иммунореактивным реагентом для усиления функции эффекторных клеток (т.е. антителозависимой клеточной цитотоксичности и фагоцитоза) для макрофагов, естественных клеток-киллеров (NK-клеток) и полиморфоядерных клеток. Иммунореактивным реагентом предпочтительно является антитело, более предпочтительно цитотоксическое и/или опсонизирующее антитело. В одном варианте осуществления HSP-опосредованное усиление пассивной иммунотерапии имеет место благодаря стимуляции эффекторных клеток, т.е. индукции и/или активации Fc-рецепторов на таких клетках.

Антитела, используемые в способах настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются перечисленным, моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, мультиспецифические антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, фрагменты Fab, фрагменты F(ab'), связанные дисульфидными связями Fv (sdFv) и антиидиотипические (анти-Id) антитела (в том числе, например, анти-Id-антитела к антителам настоящего изобретения) и эпитопсвязывающие фрагменты любого из перечисленных выше. В частности, антитела, используемые в способах настоящего изобретения, включают молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина, т.е. молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который иммуноспецифическим образом связывается с представляющей интерес мишенью. Молекулы иммуноглобулина настоящего изобретения могут быть молекулой иммуноглобулина любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgА₂) или подкласса.

Без намерения ограничиваться какой-либо теорией считается, что повышенная концентрация HSP может индуцировать продуцирование цитокинов и поверхностную экспрессию антигенпрезентирующих и костимуляторных молекул. В соответствии с этим препарат HSP, введенный субъекту, может повышать эффективность иммунореактивного реагента путем повышения результативности и эффективности презентации антигена.

В других предпочтительных вариантах осуществления иммунореактивный реагент вводят субъекту, получающему препарат HSP, для улучшения результата лечения. В определенном варианте осуществления иммунореактивный реагент усиливает иммунную реакцию, вызванную введением препарата HSP.

В определенном варианте осуществления антителом является антитело против CTLA-4. В другом определенном варианте осуществления антителом является антитело против с-erb-2, предпочтительно rhu 4D5 (герцептин) человека, особенно полезный для лечения или профилактики раковых заболеваний, при которых экспрессируется онкоген Her2/neu. Еще в одном определенном варианте осуществления антителом является антиопухолевое МоAb (MS11G6), антиидиотипическое антитело IgG2a, применяемые в терапиях раковых заболеваний, таких как, но не ограничиваясь указанным заболеванием, резистентная к NK-клеткам лимфома.

В одном варианте осуществления препарат HSP вводят в сочетании с терапией антиопухолевым или антираковым антителом, направленной против рака. В альтернативном варианте осуществления препарат HSP вводят в сочетании с терапией антителом, направленной против патогена. Еще в одном варианте осуществления препарат HSP вводят в сочетании с терапией антителом, направленной против патогенного или нежелательного белка или клетки, пораженной нейродегенеративным или амилоидным заболеванием или нарушением.

В других вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения могут быть использованы для генерации иммунной реакции против эпитопов, связанных с нейродегенеративными или амилоидными заболеваниями, раком или агентом инфекционного заболевания, или любым компонентом, клеткой или молекулой, имеющей эпитоп, связанный с указанными выше заболеваниями, введением индивидууму терапевтического количества иммунореактивного реагента и препарата HSP. Когда нужна иммунная реакция против какого-либо типа рака, используют иммунореактивный реагент, который специфически связывается с антигеном (или «распознает» антиген) именно этого типа рака, например, ассоциированным с опухолью антигеном. В другом варианте осуществления способы и композиции настоящего изобретения включают введение иммунореактивного реагента, который специфически связывается с антигеном определенного типа рака, в комбинации с препаратом HSP для лечения или профилактики этого типа рака. Когда нужно индуцировать иммунную реакцию против агента инфекционного заболевания, вводят иммунореактивный реагент, который специфически связывается с антигеном или патогенным белком (например, токсином) агента инфекционного заболевания. В альтернативных вариантах осуществления способы и композиции изобретения включают введение иммунореактивного реагента, который специфически связывается с агентом инфекционного заболевания в комбинации с препаратом HSP для лечения или профилактики указанного инфекционного заболевания. В следующих других вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения включают введение иммунореактивного агента, который специфически связывается с антигенной молекулой, ассоциированной с нейродегенеративным заболеванием или амилоидным заболеванием, в сочетании с препаратом HSP для лечения или профилактики указанного нейродегенеративного или амилоидного заболевания. Иммунореактивным реагентом предпочтительно является антитело.

Настоящее изобретение включает также способы и композиции, включающие введение препарата HSP в сочетании с иммунореактивным реагентом пациентам, которые ранее получали или в настоящее время получают другие формы лекарственной терапии, в том числе антираковые агенты, антибиотики и антиинфекционные агенты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретение предлагает способ активации антигенпрезентирующих клеток, включающий контактирование АРС с препаратом HSP и введение таких активированных APC в сочетании с введением иммунореактивного реагента. В соответствии с этим настоящее изобретение предлагает способы и композиции для усиления иммунной реакции, вызванной иммунореактивным реагентом, включающие введение активированных APC и/или препарата HSP. Препарат HSP предпочтительно не вызывает эффективно иммунную реакцию в отсутствие введения иммунореактивного реагента. В некоторых вариантах осуществления препарат HSP не проявляет иммуногенность мишени, распознаваемой иммунореактивным реагентом. В альтернативных вариантах осуществления иммуногенность препарата HSP проявляет иммуногенность мишени, распознаваемой иммунореактивным реагентом. Иммуногенность препарата HSP может быть испытана in vitro или in vivo способом, известным в данной области.

В определенных вариантах осуществления способы и композиции изобретения, включающие введение иммунореактивного реагента с введением активированных APC и/или препарата HSP, являются применимыми для лечения любого заболевания или нарушения, где эффективность лечение такого заболевания может быть повышена путем усиления иммунной реакции, в частности антителоопосредованной иммунной реакции, причем такими заболеваниями или нарушениями являются заболевания или нарушения, но они не ограничиваются перечисленным, инфекционные заболевания, рак или нейродегенеративные или амилоидные заболевания или нарушения.

Настоящее изобретение включает также способы доставки одного или нескольких HSP в качестве вспомогательной терапии в комбинации с иммунореактивными реагентами; фармацевтические композиции и препараты для введения, содержащие один или несколько препаратов HSP и один или несколько иммунореактивных реагентов, наборы, содержащие указанные фармацевтические композиции, и способы лечения или профилактики заболевания, которые могут быть улучшены путем повышения иммунной реакции, причем таким заболеванием могут быть инфекционные заболевания, первичные и метастатические неопластические заболевания (т.е. рак), нейродегенеративные или амилоидные заболевания, или отложение белка или амилоидогенные заболевания, с использованием профилактических или терапевтических фармацевтических композиций настоящего изобретения. Такие способы, наборы и композиции могут дополнительно включать введение активированных APC.

4. Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, применимым для индукции или усиления иммунной реакции, включающим введение препарата белка теплового шока (HSP) с иммунореактивным реагентом. Способы и композиции являются применимыми для улучшения результатов лечения субъекта, которому введен только препарат HSP и/или только иммунореактивный реагент. В частности, изобретение предлагает способы и композиции для повышения профилактической или терапевтический эффективности иммунореактивного агента. Изобретение предлагает также способы и композиции, применимые для индуцирования или усиления иммунной реакции, вызванной иммунореактивным реагентом, включающие введение препарата HSP. В соответствии с этим способы и композиции включают введение препарата HSP для повышения эффективности пассивной иммунотерапии. В определенных вариантах осуществления такие способы и композиции включают введение препарата HSP и являются применимыми для повышения способности иммунореактивного реагента стимулировать функцию эффекторных клеток. Настоящее изобретение включает также способы и композиции, применимые для усиления иммунной реакции, вызванной препаратом HSP, включающие введение иммунореактивного реагента. В данном изобретении способы и композиции изобретения являются применимыми для профилактики и лечения заболеваний и нарушений, где эффективность лечения или профилактики может быть повышена путем усиления иммунной реакции, таких как инфекционные заболевания, первичные или метастатические неопластические заболевания (т.е. рак), нейродегенеративные или амилоидные заболевания, или отложение белков или амилоидогенные заболевания. Таким образом, изобретение включает способы и композиции, предназначенные для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, первичных или метастатических неопластических заболеваний (т.е. рака), нейродегенеративных или амилоидных заболеваний или отложения белков или амилоидогенных заболеваний, включающие введение одного или нескольких иммунореактивных реагентов в сочетании с препаратом HSP.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает способ индукции или усиления иммунной реакции, вызванной иммунореактивным реагентом, посредством использования препарата HSP, где препарат HSP способствует индукции иммунной реакции таким количеством иммунореактивного реагента, которое в противном случае является недостаточным для индукции иммунной реакции, когда используют только его. В некоторых вариантах осуществления, когда препарат HSP не используют в сочетании с иммунореактивным реагентом для индукции иммунной реакции, введение только указанного препарата HSP не вызывает или не усиливает указанную иммунную реакцию. В альтернативных вариантах осуществления как препарат HSP, так и иммунореактивный реагент могут вызывать иммунную реакцию по отдельности и/или при введении их в комбинации.

В некоторых вариантах осуществления препарат HSP может усиливать действия иммунореактивного реагента аддитивным образом. В предпочтительном варианте осуществления препарат HSP усиливает действия иммунореактивного реагента синергическим образом. В другом варианте осуществления иммунореактивный реагент усиливает действие препарата HSP аддитивным образом. Действия предпочтительно усиливаются синергическим образом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает способы лечения или профилактики заболевания, которые обеспечивают лучшие терапевтические профили, чем профили при введении только препарата HSP и/или только иммунореактивного реагента. Изобретение включает комбинированные терапии, которые имеют аддитивную активность или аддитивное терапевтическое действие при снижении или исключении нежелательных или неблагоприятных эффектов. Изобретение включает также синергические комбинации, у которых терапевтическая активность выше, чем аддитивная, тогда как нежелательные или неблагоприятные эффекты снижаются или исключаются. В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения делают возможным лечение или профилактику заболеваний и нарушений, где лечение делают более эффективным повышением иммунной реакции, с использованием меньших и/или менее часто вводимых доз иммунореактивных реагентов и/или HSP для снижения числа случаев нежелательных или неблагоприятных эффектов, вызванных введением только иммунореактивных агентов или HSP, при сохранении или повышении эффективности лечения, предпочтительно повышении восприимчивости пациента, повышении эффективности терапии и/или снижении нежелательных или неблагоприятных эффектов.

Способы и композиции настоящего изобретения являются полезными не только для не подвергнутых лечению пациентов, но также являются полезными при лечении пациентов, частично или полностью невосприимчивых к введенному только HSP или введенному только иммунореактивному реагенту. В различных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способы и композиции, полезные для лечения заболеваний или нарушений у пациентов, которые, как было показано, являются или могут быть невосприимчивыми или толератными к терапиям, включающим введение только любого одного из агентов, и где эффективность лечения повышается усилением иммунной реакции.

Препараты HSP, применимые в способах и композициях настоящего изобретения, могут включать, но не ограничиваются перечисленным, свободные HSP, не связанные с какой-либо молекулой, и молекулярные комплексы HSP с другой молекулой, такой как пептид. Комплекс HSP-пептид содержит HSP, ковалентно или нековалентно присоединенный к пептиду. Комплекс HSP-пептид может состоять из HSP, связанных с пептидами, происходящими из представляющего интерес типа опухоли, патогена или клетки и/или белка, предпочтительно указанный пептид является той же самой мишенью, распознаваемой иммунореактивным реагентом. В альтернативном случае комплекс HSP-пептид может состоять из HSP, связанных с эндогенным пептидом, но не обязательно пептидом из того же самого источника, как и мишень иммунореактивного реагента. Некоторые способы настоящего изобретения могут не требовать ковалентного или нековалентного присоединения HSP к любым специфическим антигенам или антигенным пептидам перед введением субъекту. Настоящее изобретение включает использование комплексов HSP-пептид, содержащих HSP в виде ковалентных или нековалентных комплексов с экзогенными пептидами, продуцированными in vitro, а также использование комплексов эндогенный HSP-пептид, выделенных из клеточных источников.

Иммунореактивные реагенты, применимые в способах и композициях настоящего изобретения, могут включать, но не ограничиваются перечисленным, антитела, молекулы или белки, полученные генной инженерией для включения антигенсвязывающей части антитела, молекулы или белки, полученные генной инженерией для включения антигенсвязывающего домена, который опосредует антителозависимые иммунные реакции, пептид или домен, который взаимодействует специфически с представляющим интерес антигеном, или любой антигенсвязывающий домен, который взаимодействует с представляющим интерес антигеном/эпитопом. Антигенсвязывающий домен предпочтительно связывают с доменом константной области антитела, который опосредует антителозависимую иммунную реакцию, иммунные реакции или процессы эффекторных клеток. Иммунореактивный реагент предпочтительно очищают.

В предпочтительных вариантах осуществления иммунореактивным агентом является антитело предпочтительно с терапевтическими или профилактическими использованиями in vivo, и настоящее изобретение предлагает способы и композиции, применимые для повышения эффективности таких терапевтических или профилактических антител, включающие введение препарата HSP. В таких вариантах осуществления способность антитела стимулировать функцию эффекторных клеток повышают введением препарата HSP. В определенном варианте осуществления антителозависимую клеточную цитотоксичность и/или фагоцитоз опухолевых клеток или патогенов или патогенных белков и пептидов повышают посредством использования терапевтического антитела в комбинации с препаратом HSP. Терапевтическим антителом предпочтительно является цитотоксическое и/или опсонизирующее антитело. В соответствии с этим настоящее изобретение предлагает способы и композиции, в которых препарат HSP используют в комбинации с иммунореактивным реагентом для усиления функции эффекторных клеток (т.е. антителозависимой клеточной цитотоксичности и фагоцитоза) для макрофагов, естественных клеток-киллеров (NK-клеток) и полиморфоядерных клеток. Иммунореактивным реагентом предпочтительно является антитело, более предпочтительно цитотоксическое и/или опсонизирующее антитело. В одном варианте HSP-опосредованное повышение эффективности пассивной иммунотерапии имеет место посредством стимуляции эффекторных клеток, т.е. индукции и/или активации Fc-рецепторов на таких клетках.

В других предпочтительных вариантах осуществления иммунореактивный реагент вводят субъекту, получающему препарат HSP, для улучшения результата лечения. В определенном варианте осуществления иммунореактивный реагент усиливает иммунную реакцию, вызванную введением препарата HSP. В других вариантах осуществления иммунореактивный реагент потенцирует активацию Т-клеток, вызванную HSP.

В определенном варианте осуществления антителом является антитело против CTLA-4. В другом определенном варианте осуществления антителом является антитело против с-erb-2, предпочтительно человеческий rhu 4D5 (герцептин), особенно полезный при лечении или профилактике раковых заболеваний, при которых экспрессируется онкоген Her2/neu. В другом определенном варианте осуществления антитело является антиопухолевым MoAb (MS11G6), антиидиотипическим антителом IgG2a, полезным в терапии раковых заболеваний, таких как, но без ограничения указанным, резистентная к NK-клеткам лимфома. В одном варианте осуществления антитело является агонистом Toll-подобного рецептора (TLR), например TLR 2, 7, 8 или 9. В другом варианте осуществления антителом является агонист 41ВВ (см., например, Miller et al., 2002, J. Immunol. 169: 1792-1800), OX40, ICOS или CD40. Еще в одном варианте осуществления антителом является антагонист Fas-лиганда или PDI. В другом варианте осуществления антителом является Mab 6B11, которое связывается с петлей CDR3 Т-клеточного рецептора (TCR) инвариантных NKT-клеток и стимулирует размножение и/или активирует эти клетки. См. заявку на патент США 2002/0164331, опубликованную 7 ноября 2002.

В одном варианте осуществления препарат HSP вводят в комбинации с использующей антитело антиопухолевой терапией, направленной против рака. В альтернативном варианте осуществления препарат HSP вводят в комбинации с использующей антитело терапией, направленной против патогена. Еще в одном варианте осуществления препарат HSP вводят в комбинации с использующей антитело терапией, направленной против клетки, пораженной нейродегенеративным или амилоидным заболеванием или нарушением.

Без намерения ограничиваться какой-либо теорией считается, что повышенная концентрация HSP может индуцировать продуцирование цитокинов и поверхностную экспрессию антигенпрезентирующих и костимулирующих молекул. В соответствии с этим считается, что препарат HSP, введенный субъекту, может повышать эффективность иммунореактивного реагента посредством повышения действенности и эффективности презентации антигена. Считается, что в некоторых вариантах осуществления препарат HSP может усиливать антителоопосредованные реакции, такие как функции эффекторных клеток.

В других вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения могут быть использованы для генерации иммунной реакции против эпитопов, связанных с нейродегенеративными или амилоидными заболеваниями, раком или агентом инфекционного заболевания, или любым компонентом, клеткой или молекулой, несущей эпитоп, связанный с вышеуказанными заболеваниями, введением индивидууму терапевтического количества иммунореактивного реагента и препарата HSP. Когда необходимой является иммунная реакция против типа рака, используют иммунореактивный реагент, который специфически связывается с антигеном (или «распознает» антиген) типа рака, т.е. проявляет иммуногенность рака. Примерами таких антигенов являются ассоциированный с опухолью антиген (т.е. относительно сверхэкспрессированный в опухолевых клетках) или специфический для опухоли антиген (т.е. присутствующий только в опухолевых клетках). В других вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения включают введение иммунореактивного реагента, который специфически связывается с антигеном типа рака, в комбинации с препаратом HSP для лечения или профилактики указанного типа рака. Когда необходимой является индукция иммунной реакции против агента инфекционного заболеваний, вводят иммунореактивный реагент, который специфически связывается с антигеном или патологическим белком (например, токсином) агента инфекционного заболевания. В альтернативных вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения включают введение иммунореактивного реагента, который специфически связывается с агентом инфекционного заболевания, в комбинации с препаратом HSP для лечения или профилактики указанного инфекционного заболевания. В следующих вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения включают введение иммунореактивного реагента, который специфически связывается с антигенной молекулой или белковым эпитопом, ассоциированным с нейродегенеративным заболеванием или амилоидным заболеванием, в комбинации с препаратом HSP для лечения или профилактики указанного нейродегенеративного или амилоидного заболевания. Иммунореактивным реагентом предпочтительно является антитело.

Настоящее изобретение включает также способы и композиции, включающие введение препарата HSP в комбинации с иммунореактивным реагентом пациентам, которые ранее получали или в настоящее время получают другие формы лекарственной терапии, в том числе антираковые агенты, антибиотики и антиинфекционные агенты.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает способ активации антигенпрезентирующих клеток, включающий контактирование АРС с препаратом HSP и введение таких активированных APC в комбинации с введением иммунореактивного реагента. В соответствии с этим настоящее изобретение предлагает способы и композиции для усиления иммунной реакции, вызванной иммунореактивным реагентом, включающие введение активированных APC и/или препарата HSP. Препарат HSP предпочтительно не вызывает эффективно иммунную реакцию в отсутствие введения иммунореактивного реагента. В некоторых вариантах осуществления препарат HSP не проявляет иммуногенность мишени, распознаваемой иммунореактивным реагентом. В альтернативных вариантах осуществления иммуногенность препарата HSP проявляет иммуногенность мишени, распознаваемой иммунореактивным реагентом. Иммуногенность препарата HSP может быть испытана in vitro или in vivo способом, известным в данной области.

В определенных вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения, включающие введение иммунореактивного реагента с введением активированных APC и/или препарата HSP, являются применимыми для лечения любого заболевания или нарушения, где эффективность лечения такого заболевания может быть повышена путем усиления иммунной реакции, причем такими заболеваниями являются, но они не ограничиваются перечисленным, инфекционные заболевания, рак или нейродегенеративные или амилоидные заболевания или нарушения.

Изобретение включает также способы доставки одного или нескольких HSP в качестве вспомогательной терапии в комбинации с иммунореактивными реагентами; фармацевтические композиции и препараты для введения, содержащие один или несколько препаратов HSP и один или несколько иммунореактивных реагентов, наборы, содержащие указанные фармацевтические композиции, и способы лечения или профилактики заболевания, эффективность лечения которого может быть повышена путем усиления иммунной реакции, причем такими заболеваниями являются инфекционные заболевания, первичные и метастатические неопластические заболевания (т.е. рак), нейродегенеративные или амилоидные заболевания или отложение белка или амилоидогенные заболевания, с использованием профилактических или терапевтических фармацевтических композиций настоящего изобретения. Такие способы, наборы и композиции могут дополнительно включать введение активированных APC.

4.1 Профилактические/терапевтические способы

Настоящее изобретение предлагает способы индукции или усиления иммунной реакции, вызванной иммунореактивным реагентом, включающие введение препарата HSP в сочетании с введением иммунореактивного реагента. Настоящее изобретение включает способы лечения или профилактики заболеваний и нарушений, где эффективность лечения или профилактики может быть повышена путем усиления иммунной реакции. В предпочтительных вариантах осуществления усиленная иммунная реакция включает усиление ответных реакций, таких как антителозависимая клеточная цитотоксичность (например, ADCC) или антителоопосредованная опсонизация и/или фагоцитоз, направленный против клетки, патогена или белка, обладающего эпитопом, распознаваемым антителом, и опосредованный комплементом цитолиз клеток в результате действия механизмов эффекторных клеток. В некоторых вариантах осуществления препарат HSP индуцирует активацию Т-клеток и иммунореактивный реагент, например антитело, может усиливать иммунную реакцию потенцированием активации Т-клеток.

В одном варианте осуществления термин «лечение» относится к уменьшению интенсивности симптомов рака, инфекционного заболевания, или нейродегенеративного, или амилоидного заболевания, или, по меньшей мере, одного его явного симптома. В другом варианте осуществления «лечение» относится к улучшению, по меньшей мере, одного измеряемого физического параметра, связанного с раком, инфекционным заболеванием, нейродегенеративным или амилоидным заболеванием, но не обязательно заметному для субъекта. Еще в одном варианте осуществления термин «лечение» относится к ингибированию развития рака, инфекционного заболевания, нейродегенетивного или амилоидного заболевания либо физически, например стабилизации заметного симптома, физиологически, например стабилизации физического параметра, либо к обоим ингибированиям. Еще в одном варианте осуществления «лечение» относится к замедлению начала рака, нейродегенеративного или амилоидного заболевания.

В некоторых вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения являются применимыми в качестве профилактической меры против рака, инфекционного заболевания, нейродегенеративного или амилоидного заболевания. Используемый здесь термин «профилактика» относится к снижению риска приобретения данного ракового заболевания, инфекционного заболевания, нейродегенеративного или амилоидного заболевания. В одном виде варианта осуществления способы и композиции настоящего изобретения включают введение препарата HSP с введением иммунореактивного реагента в качестве профилактической меры для субъекта-человека, имеющего генетическую предрасположенность к раку, инфекционному заболеванию, нейродегенеративному или амилоидному заболеванию. В другом виде варианта осуществления способы и композиции изобретения являются применимыми в качестве профилактической меры для субъекта-человека, имеющего не генетическую предрасположенность к раку, или субъекта, подвергающегося действию агента инфекционного заболевания.

В других вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения являются применимыми для лечения или профилактики клинического проявления или начала рака, инфекционного заболевания, или нейродегенеративного, или амилоидного заболевания.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способы лечения или профилактики инфекционных заболеваний, рака, нейродегенеративных или амилоидных заболеваний или белкового отложения или амилоидных заболеваний, включающие введение препарата HSP в комбинации с одним или несколькими иммунореактивными реагентами. В некоторых вариантах осуществления препарат HSP вводят млекопитающему, предпочтительно человеку, одновременно с одним или несколькими иммунореактивными реагентами.

В одном варианте осуществления препарат HSP и иммунореактивный реагент вводят одновременно. В другом варианте осуществления препарат HSP и иммунореактивный реагент вводят субъекту последовательно и с таким интервалом времени, чтобы препарат HSP мог действовать вместе с иммунореактивным реагентом, чтобы обеспечить повышенную пользу по сравнению с пользой, которая была бы, если бы вводили только один из них. Например, каждый (например, препарат HSP и иммунореактивный реагент) может быть введен в одно и то же время или последовательно в любом порядке в разные точки времени; однако, если их не вводят в одно и то же время, их нужно вводить в достаточно близкое друг от друга время, чтобы обеспечить нужное терапевтическое или профилактическое действие. Каждый может быть введен по отдельности, в любой подходящей форме и любым подходящим путем. В одном варианте осуществления препарат HSP и иммунореактивный реагент вводят одинаковым способом введения. В другом варианте осуществления препарат HSP и иммунореактивный реагент вводят разными путями введения. Введение каждого можно проводить в одно и то же или разные места, например в руку и ногу.

В различных вариантах осуществления профилактические или терапевтические агенты вводят в промежутки времени между ними, меньше чем 1 час, 1 час, от одного часа до 2 часов, от 2 часов до 3 часов, от 3 часов до 4 часов, от 4 часов до 5 часов, от 5 часов до 6 часов, от 6 часов до 7 часов, от 7 часов до 8 часов, от 8 часов до 9 часов, от 9 часов до 10 часов, от 10 часов до 11 часов, от 11 часов до 12 часов, но не больше чем 24 часа или не больше чем 48 часов. В другом варианте осуществления профилактические или терапевтические агенты вводят в промежутки времени между ними 1, 2, 4, 8, 12, 24 или 48 часов. В другом варианте осуществления препарат HSP и иммунореактивный реагент вводят в промежутки времени между ними 2-4 дня, 1 неделя, 1-2 недели, 2-4 недели, один месяц, 1-2 месяца или 2 или больше месяцев. В предпочтительных вариантах осуществления два или более компонентов вводят в один и тот же приход пациента. Препарат HSP и иммунореактивный реагент вводят субъекту предпочтительно в отрезок времени, который позволяет как препарату HSP, так иммунореактивному реагенту или обоим быть активированными в одно и то же время. Специалист в данной области способен определить такой отрезок времени посредством определения периода полувыведения из организма препарата HSP и иммунореактивного реагента.

В определенном варианте осуществления препарат HSP вводят перед введением иммунореактивного реагента. В альтернативном определенном варианте осуществления препарат HSP вводят после введения иммунореактивного реагента.

В некоторых вариантах осуществления препарат HSP и/или иммунореактивный реагент вводят субъекту циклически. Циклическая терапия включает введение препарата HSP в течение некоторого периода времени с последующим введением иммунореактивного реагента и/или любого третьего агента в течение некоторого периода времени и повторением этого последовательного введения. Циклическая терапия снижает развитие резистентности к одной или нескольким терапиям, исключает или снижает побочные действия одной из терапий и/или повышает эффективность лечения. В таких вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает альтернативное введение препарата HSP с последующим введением иммунореактивного реагента через 4-6 дней, предпочтительно через 2-4 дня, более предпочтительно через 1-2 дня, и последующее введение препарата HSP через 4-6 дней, предпочтительно через 2-4 дня, более предпочтительно через 1-2 дня и т.д. Такая цикличность может быть повторена столько раз, сколько нужно.

В других вариантах осуществления препарат HSP вводят субъекту в разумно такое же время, как и иммунореактивный реагент. Два введения предпочтительно проводят в промежутке времени от одного введения до другого, меньшем чем от одной минуты до приблизительно пяти минут, приблизительно от пяти минут до приблизительно 10 минут, приблизительно от 10 минут до приблизительно 30 минут, приблизительно от 30 минут до приблизительно шестидесяти минут, например при одном и том же визите врача.

В другом варианте осуществления иммунореактивный реагент и препарат HSP могут быть введены одновременно. В некоторых вариантах осуществления иммунореактивный реагент и препарат HSP вводят в виде одной фармацевтической композиции. В таких вариантах осуществления фармацевтическую композицию настоящего изобретения вводят один раз в день, два раза в день или три раза в день. В других вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят один раз в неделю, два раза в неделю, один раз каждые две недели, один раз в месяц, один раз каждые шесть месяцев, один раз каждые два месяца, два раза в год или один раз в год. Должно быть также очевидно, что эффективная доза иммунореактивного реагента, используемого для лечения, может быть повышена или снижена на протяжении курса конкретного лечения.

Предложен также другой терапевтический способ. В этом варианте осуществления препарат HSP вводят субъекту, когда нужно, чтобы АРС субъекта были в активированном состоянии. Препарат HSP может вводиться регулярно в течение периода времени, например ежедневно в течение до нескольких недель - 1-2 недель, 2-4 недель, 4-6 недель, вплоть до двух месяцев, которые могут предшествовать, перекрываться и/или следовать за режимом лечения иммунореактивным реагентом. Препарат HSP может улучшать результаты лечения. Без намерения связываться с какой-либо теорией или механизмом считается, что введение препарата HSP субъекту может повысить восприимчивость неспецифических иммунных механизмов субъекта, например, посредством повышения числа естественных клеток-киллеров (NK) и/или ускорением созревания дендритных клеток. В некоторых вариантах осуществления активация АРС препаратом HSP происходит ex vivo и таким образом активированные АРС затем вводят в соответствии со способами и композициями настоящего изобретения. Для активации APC может быть использован препарат HSP, который является таким же или отличается от препарата HSP, который должен быть введен. Каждый препарат HSP может проявлять или может не проявлять иммуногенность антигенной молекулы, распознаваемой иммунореактивным реагентом.

В другом варианте осуществления препарат HSP вводят субъекту в течение промежутка времени от одного часа до двадцати четырех часов после введения иммунореактивного реагента. Промежуток времени может быть удлинен, если используют иммунореактивный реагент медленно или непрерывно высвобождаемого типа. Считается, что указанный способ помогает активировать эффекторные клетки, такие как APC, которые присутствуют у места или около места введения и которые не могут быть еще активированы присутствием иммунореактивного реагента.

Еще в одном варианте осуществления препарат HSP вводят субъекту в промежуток времени от одного до 12 часов, 12-24 часов, 24-48 часов перед введением иммунореактивного реагента. Считается, что этот способ предварительно активирует APC субъекта перед столкновением с иммунореактивным реагентом.

В других вариантах осуществления в ходе лечения введение проводят одновременно, т.е. индивидуальные дозы препарата HSP и иммунореактивного агента(ов) вводят по отдельности, однако в такой интервал времени, чтобы препарат HSP мог действовать вместе с иммунореактивным реагентом(ами). Например, препарат HSP может быть введен один раз в неделю в комбинации с иммунореактивным реагентом(ами), который может вводиться один раз каждые две недели или один раз каждые три недели. Другими словами, схемы приема для препарата HSP и иммунореактивного реагента(ов) предусматривают одновременное введение, даже если их вводят неодновременно или не в одно и то же посещение пациента.

В одном варианте осуществления препарат HSP вводят одновременно с одним или несколькими иммунореактивными реагентами в одной и той же фармацевтической композиции. В другом варианте осуществления препарат HSP вводят одновременно с одним или несколькими иммунореактивными реагентами в разных фармацевтических композициях. Еще в одном варианте осуществления препарат HSP вводят перед введением или после введения одного или нескольких иммунореактивных реагентов. Изобретение предусматривает введение препарата HSP в комбинации с одним или несколькими иммунореактивными реагентами одним и тем же или разными путями введения. В предпочтительном варианте осуществления препарат HSP вводят внутрикожно. В другом предпочтительном варианте осуществления иммунореактивный агент вводят внутривенно. В особенно предпочтительном варианте осуществления препарат HSP вводят внутрикожно и иммунореактивный агент вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления, когда препарат HSP вводят одновременно с иммунореактивным реагентом, который, возможно, вызывает неблагоприятные или нежелательные побочные действия, включающие, но не ограничивающиеся указанным, токсичность, указанный иммунореактивный реагент можно преимущественно вводить в дозе, которая снижается ниже порога, при котором проявляется неблагоприятное побочное действие.

В другом варианте осуществления изобретение предлагает способ индукции иммунной реакции субоптимальным количеством иммунореактивного реагента, где препарат HSP способствует индукции иммунной реакции количеством иммунореактивного реагента, которое в противном случае является недостаточным для индукции иммунной реакции при использовании его одного. В некоторых вариантах осуществления субоптимальным количеством является количество, в противном случае являющееся недостаточным для эффективной индукции иммунной реакции или достижения нужного профилактического или терапевтического действия. В частности, способ включает стадии (а) введения субъекту количества препарата белка теплового шока и (b) введения субъекту иммунореактивного реагента, против которого должна быть индуцирована нужная иммунная реакция, в количестве, которое является субоптимальным в отсутствие стадии (а), посредством чего у субъекта индуцируется иммунная реакция. Препарат HSP может проявлять или может не проявлять иммуногенность антигенной молекулы, распознаваемой иммунореактивным реагентом.

Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает способ индукции иммунной реакции субиммуногенным количеством препарата HSP, где иммунореактивный реагент способствует индукции иммунной реакции количеством препарата HSP, менее достаточным для индуцирования иммунной реакции при использовании его одного. Препарат HSP может проявлять или может не проявлять иммуногенность антигенной молекулы, распознаваемой иммунореактивным реагентом.

Настоящее изобретение предлагает способы лечения, профилактики или уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием, нарушением или инфекцией, введением субъекту фармацевтической композиции, содержащей иммунореактивный реагент и HSP. В предпочтительном аспекте иммунореактивный реагент и HSP являются по существу очищенными (т.е. по существу свободны от веществ, которые ограничивают его действие или вызывают нежелательные побочные действия). В соответствии с настоящим изобретением композицию изобретения, содержащую иммунореактивный реагент и HSP, вводят субъекту-человеку с раковым заболеванием, инфекционным заболеванием или нейродегенеративными или амилоидными заболеваниями в качестве лечения.

Настоящее изобретение относится также к способам использования композиций настоящего изобретения для лечения инфекционных заболеваний, первичных и метастатических неопластических заболеваний (т.е. рака), нейродегенеративных или амилоидных заболеваний, отложения белков/амилоидогенных заболеваний или любого другого лечения заболевания, симптомы которого могут быть улучшены путем повышения иммунной реакции.

4.2 Популяция пациентов

Субъектом, которому вводят препарат HSP и иммунореактивный реагент, предпочтительно является млекопитающее, такое как не являющееся приматом (например, крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кошки, собаки, крысы и т.д.) и примат (например, обезьяна, такая как яванская макака, и человек). В предпочтительном варианте осуществления субъектом является человек.

В других различных вариантах осуществления способы и композиции изобретения используют для лечения или профилактики любого заболевания или нарушения, для которого терапевтический или профилактический иммунореактивный реагент является полезным для лечения или профилактики. Предпочтительно заболевание или нарушение является поддающимся лечению или профилактике путем повышения иммунной реакции, более предпочтительно инфекционным заболеванием, раком или нейродегенеративным или амилоидным нарушением.

Композиции могут быть использованы для профилактики различных видов рака, например, у индивидуумов, которые предрасположены к этому в результате семейного анамнеза, или индивидуумов с повышенным риском рака вследствие факторов окружающей среды, для профилактики инфекционных заболеваний, например, у индивидуумов с повышенными рисками подвергания воздействию агентов инфекционного заболевания, и для профилактики нейродегенеративных или амилоидных заболеваний, например, у индивидуумов с генетическими предрасположенностями к нейродегенеративным или амилоидным заболеваниям.

Способы и композиции настоящего изобретения могут быть использованы для пациентов, которые ранее не получали такое лечение, пациентов, которые ранее получали или в настоящее время получают лечение препаратом HSP, пациентов, которые ранее получали или в настоящее время получают лечение иммунореактивным реагентом, или пациентов, которые ранее получали или в настоящее время получают лечение другими фармацевтическими агентами или комбинациями, включающими, но не ограничивающимися перечисленным, антираковые агенты, антибиотики, антибактериальные агенты, антигрибковые агенты и антивирусные агенты. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения препарат HSP вводят пациенту, который ранее получал или в настоящее время получает лечение иммунотерапевтическими реагентами. В другом варианте осуществления изобретения иммунотерапевтический реагент вводят пациенту, который ранее получал или в настоящее время получает лечение препаратом HSP. Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения препарат HSP вводят пациенту, который ранее получал или в настоящее время получает лечение, которое включает применение, не ограничивающееся перечисленным, антираковых агентов, антибиотиков, антибактериальных агентов, антигрибковых агентов или антивирусных агентов, необязательно с иммунореактивным реагентом. Еще в одном варианте осуществления иммунотерапевтический реагент вводят пациенту, который ранее получал или в настоящее время получает лечение, которое включает применение, не ограничивающееся перечисленным, антираковых агентов, антибиотиков, антибактериальных агентов, антигрибковых агентов или антивирусных агентов, необязательно с препаратом HSP.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическую композицию настоящего изобретения, состоящую из иммунотерапевтического реагента и препарата HSP, вводят пациенту, который ранее получал или в настоящее время получает лечение, которое включает применение, не ограничивающееся перечисленным, антираковых агентов, антибиотиков, антибактериальных агентов, антигрибковых агентов или антивирусных агентов.

Способы и соединения настоящего изобретения могут также быть использованы для лечения пациентов, которые ранее получали лечение препаратом HSP или иммунореактивными реагентами и которых в настоящее время неэффективно лечат только препаратом HSP или иммунореактивным реагентом.

В одном варианте осуществления композицию настоящего изобретения, состоящую из препарата HSP и иммунореактивного реагента, вводят пациенту, недостаточно восприимчивому к лечению одним агентом, только препаратом HSP. В другом варианте осуществления композицию настоящего изобретения, состоящую из препарата HSP и иммунореактивного реагента, вводят пациенту, который является невосприимчивым к лечению одним агентом, только иммунореактивным реагентом. Еще в одном варианте осуществления композицию настоящего изобретения, состоящую из препарата HSP и иммунореактивного реагента, вводят пациенту, который является невосприимчивым к лечению как только препаратом HSP, так и только иммунореактивным реагентом, но не к обоим лечениям. Еще в одном варианте осуществления композицию настоящего изобретения, состоящую из препарата HSP и иммунореактивного реагента, вводят пациенту, который не получает любую форму лекарственного лечения.

4.3 Лечение и профилактика рака

Изобретение включает способы лечения или профилактики рака или метастаза у субъекта, включающие в любой последовательности стадии введения субъекту иммунореактивного реагента, содержащего компонент, который распознает антиген или эпитоп раковой клетки (т.е. иммуногенное количество антигена рака, включающего, но не ограничивающегося перечисленным, специфический для опухоли антиген и ассоциированный с опухолью антиген или молекулу, проявляющую свою антигенность), и введения субъекту количества препарата HSP, эффективного для индукции или усиления иммунной реакции у субъекта против компонента, распознаваемого иммунореактивным реагентом.

В некоторых вариантах осуществления композиции и способы настоящего изобретения могут быть использованы для предотвращения, ингибирования или снижения роста раковых клеток или уменьшения метастаза раковых клеток. В определенном варианте осуществления введение препарата HSP в комбинации с иммунореактивным реагентом ингибирует или снижает рост раковых клеток или уменьшает метастаз раковых опухолей, по меньшей мере, на 99%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 25%, по меньшей мере, на 20% или, по меньшей мере, на 10%, относительно роста клеток или метастаза в отсутствие введения указанного препарата HSP в комбинации с указанным иммунореактивным реагентом.

Раковые заболевания, которые можно лечить в соответствии со способами изобретения, включают, но не ограничиваются перечисленным, лейкоз (например, острый лейкоз, такой как острый лимфоцитарный лейкоз и острый миелоцитарный лейкоз), неоплазмы, опухоли (например, не-ходжкинскую лимфому, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, карциному толстой кишки, панкреатический рак, рак молочной железы, рак яичника, рак простаты, плоскоклеточный рак, базально-клеточный рак, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенный рак, рак почки, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному, семиному, эмбриональный рак, опухоль Вильмса, цервикальный рак, тестикулярную опухоль, карциному легких, мелкоклеточную карциному легких, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, глиобластому полиморфную, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, акустическую невриному, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому и гетинобластому), болезнь тяжелых цепей (В-клеточную лимфому), метастазы или любое заболевание или нарушение, характеризующееся нерегулируемым ростом клеток.

Опухолевые антигены или ассоциированные с опухолью антигены включают антигены раковых половых клеток (CG) (MAGE, NY-ESO-1), мутационные антигены (MUM-1, p53, CDK-4), сверхэкспрессированные аутоантигены (р53, HER2/NEU), вирусные антигены (из вируса папилломы, вируса Эпштейн-Барра), опухолевые белки, полученные из мРНК-последовательностей непервичной открытой рамы считывания (NY-ESO1, LAGE1), Melan F, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-1, тирозиназу, gp100, gp75, HER-2/neu, c-erb-B2, CEA, PSA, MUC-1, CA-125, Stn, TAG-72, KSA (17-1A), PSMA, p53 (имеющий точковую мутацию и/или сверхэкспрессированный), RAS (имеющий точковую мутацию), EGF-R, VEGF, GD2, GM2, GD3, анти-Id, CD20, CD19, CD22, CD36, аберрантного класса II, B1, CD25, (IL-2R), (анти-ТАС) или HPV.

В предпочтительном варианте осуществления способ или композицию настоящего изобретения используют для лечения или профилактики рака или метастаза у субъекта введением препарата HSP и иммунореактивного реагента, где иммунореактивный реагент является антителом против CTLA-4 или антителом против 41ВВ. В другом предпочтительном варианте осуществления способ или композицию настоящего изобретения используют для лечения или профилактики рака или метастаза у субъекта введением препарата HSP и иммунореактивного реагента, где иммунореактивный реагент является антиопухолевым моноклональным антителом. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления способ или композицию настоящего изобретения используют для лечения или профилактики рака или метастаза у субъекта введением препарата HSP и иммунореактивного реагента, где иммунореактивный реагент является герцептином.

4.4 Лечение инфекционных заболеваний

Настоящее изобретение включает также способы лечения или профилактики инфекционного заболевания у субъекта, включающие проводимые в любой последовательности стадии введения субъекту иммунореактивного реагента и введения субъекту количества препарата белка теплового шока, эффективного в комбинации с иммунореактивным реагентом для индукции или усиления иммунной реакции против компонента у субъекта.

Инфекционные заболевания, которые можно лечить или предотвратить посредством использования иммунореактивного реагента в сочетании со способами настоящего изобретения, вызываются инфекционными агентами, включающими, но не ограничивающимися перечисленным, вирусы, бактерии, грибковые простейшие и паразиты. Некоторые из обычно используемых иммунореактивных реагентов против инфекционных заболеваний и их подходящие дозы и применения известны в данной области и описаны в литературе, такой как Physician's Desk Reference (56^th ed., 2002).

Инфекционные агенты, с которыми можно бороться в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются перечисленным, вирусы, бактерии, грибы и агенты протозойных заболеваний.

Вирусные заболевания, которые можно лечить или предотвратить посредством использования иммунореактивного реагента в сочетании со способами настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются перечисленным, заболевания, вызванные возбудителем гепатита типа А, гепатита типа В, гепатита типа С, вирусом гриппа, ветряной оспы, аденовирусом, возбудителем простого герпеса типа I (HSV-I), простого герпеса типа II (HSV-II), риндерпестом, риновирусом, эховирусом, ротавирусом, респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом папилломы, паповавирусом, цитомегаловирусом, эхиновирусом, арбовирусом, хунтавирусом, вирусом Коксаки, вирусом паратита, вирусом кори, вирусом коревой краснухи, полиовирусом, вирусом натуральной оспы, вирусом Эпштейн-Барра, вирусом иммунодефицита человека типа I (ВИЧ-I), вирусом иммунодефицита человека типа II (ВИЧ-II) и агентами вирусных заболеваний, таких как вирусный менингит, энцефалит, лихорадка Денге или натуральная оспа.

Бактериальные заболевания, которые можно лечить или предотвратить посредством использования иммунореактивного реагента в сочетании со способами настоящего изобретения, вызваны бактериями, включающими, но не ограничивающимися перечисленным, микобактерии, риккетсии, микоплазмы, нейссерии, S. pneumonia, Borellia burgdorferi (возбудитель заболевания Лайма), Bacillus аnthracis (возбудитель сибирской язвы), возбудитель столбняка, стрептококк, стафилококк, микобактерия, возбудитель столбняка, возбудитель коклюша, возбудитель холеры, возбудитель образования бляшек, возбудитель дифтерии, хламидии, S. aureus и легионелла.

Протозойные заболевания и/или паразитарные заболевания, которые можно лечить или предотвратить посредством использования иммунореактивного реагента в сочетании со способами настоящего изобретения, вызываются простейшими и/или паразитами, включающими в себя, но не ограничивающимися перечисленным, лейшмании, кокцидии, трипанхомы, возбудитель малярии, хламидии, риккетсия, возбудитель болезни Шагаса, филярии, возбудитель токсоплазмоза, возбудитель шистосомоза и ленточные черви, являющиеся возбудителями заболеваний.

4.5 Лечение нейродегенеративных заболеваний

Могут быть также использованы иммунореактивные реагенты, специфически связывающие антигенную молекулу в клетке или на клетке или структуре, например внеклеточных осаждениях или бляшках, содержащих пептидные и/или белковые фибриллы, которые являются отличительными признаками нейродегенеративного или амилоидного заболевания. Когда нужно лечить или предупредить нейродегенеративное или амилоидное заболевание, предпочтительно используют иммунореактивные реагенты, которые специфически связываются с молекулами, содержащими эпитопы антигенных молекул, связанных с нейродегенеративными заболеваниями, или эпитопами антигенных молекул, связанных с амилодными заболеваниями, включающими, но не ограничивающимися перечисленным, пептиды или белки фибриллов. Такими связанными с нейроденеративным заболеванием антигенными молекулами могут быть молекулы, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, связанной с возрастом потерей познавательной функции, синильной деменцией, болезнью Паркинсона, боковым амиотрофическим склерозом, болезнью Вильсона, корковым параличом, прогрессивным надъядерным параличом, болезнью Гуама, деменции, ассоциированной с болезнью телец Леви, заболеваниями, вызванными прионом, губчатыми энцефалопатиями, болезнью Крейтцфельда-Якоба, полиглутаминовыми заболеваниями, болезнью Хантингтона, миотонической дистрофией, наследственной атаксией Фридрейха, атаксией, синдромом Жилль де ла Туретта, эпилептическими нарушениями, эпилепсией, хроническим эпилептическим нарушением, ударом, травмой головного мозга, травмой позвоночника, деменцией, связанной со СПИДом, алкоголизмом, аутизмом, ретинальной ишемией, глаукомой, вегетативным функциональным нарушением, гипертензией, невропсихиатрическим нарушением, шизофренией или шизоаффективным нарушением.

Примеры таких антигенных молекул описаны в WO 01/52890, опубликованной 26 июля 2001, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей ее полноте, и включают, но не ограничиваются перечисленным, -амилоид или его фрагмент, олигомерный А -комплекс или его фрагмент, комплекс АроЕ4-А , тау-белок или его фрагмент, белок - предшественник амилоида или его фрагмент, белок - предшественник мутантного амилоида или его фрагмент, презениллин или его фрагмент, мутант презениллина или его фрагмент, -синуклеин или его фрагмент или белок прион или его фрагмент и антигенные производные любого из вышеуказанных белков или их фрагментов. Связанные с амилоидным заболеванием антигенные молекулы могут быть молекулами, связанными с заболеваниями, характеризующимися внеклеточным отложением белковых и/или пептидных фибрилл, которые образуют амилоидные отложения или бляшки, и включающими, но не ограничивающимися перечисленным, диабет типа II и амилоидоз, связанный с хроническим воспалением или инфекционными заболеваниями и злокачественными новообразованиями, например миеломой. Некоторые амилоидные заболевания, такие как, но без ограничения перечисленным, болезнь Альцгеймера и заболевания, вызванные прионами, например болезнь Крейтцфельдта-Якоба, также являются нейродегенеративными заболеваниями.

4.6 Препараты HSP

Любой HSP или препарат HSP, известный в данной области, может быть использован в композициях и способах настоящего изобретения. Для целей данного изобретения препараты HSP могут включать, не ограничиваясь перечисленным, свободный HSP, не связанный с какой-либо молекулой, молекулярные комплексы HSP с другой молекулой, такой как пептид, и слитые белки HSP. Комплекс HSP-пептид содержит HSP, ковалентно или нековалентно присоединенный к пептиду. Комплекс HSP-пептид может состоять из HSP, связанных с пептидами, полученными из представляющего интерес опухолевого, патогенного или клеточного типа и/или белка (например, такой же мишени, которая распознается антителом). В альтернативном варианте комплекс HSP-пептид может состоять из HSP, связанных с эндогенным пептидом, но необязательно с пептидом из того же самого источника, как и мишень терапевтического антитела. Способы настоящего изобретения не требуют ковалентного или нековалентного присоединения к каким-нибудь специфическим антигенам или антигенным пептидам перед введением субъекту. Препарат HSP может быть или может не быть получен из субъекта, которому вводят препарат. HSP, комплекс HSP-пептид или слитый белок HSP предпочтительно очищают. Препарат HSP может включать неочищенный клеточный лизат, содержащий HSP, причем количество лизата соответствует 100-10⁸ эквивалентам клеток. Когда пептид присоединяют к HSP, пептидом может быть любой пептид, который может быть нековалентно, ковалентно связан или слит с HSP. HSP могут быть общепринятым способом очищены из большинства клеточных источников, поскольку популяция комплексов различных пептидов нековалентно связана с HSP. HSP могут быть отделены от нековалентно связанных пептидов обработкой средой с низким значением рН и/или аденозинтрифосфатом или другими методами, известными в данной области. Препарат HSP обычно вводят отдельно от иммунореактивного реагента. Пептид(ы) может быть не относящимся к рассматриваемому иммунореактивному реагенту или инфекционному заболеванию или нарушению. Для удобства и комфорта реципиента препарат HSP может быть смешан с иммунореактивным реагентом непосредственно перед введением.

В различных вариантах осуществления источником HSP предпочтительно является эукариот, более предпочтительно млекопитающее и наиболее предпочтительно человек. В соответствии с этим препарат HSP, используемый способами изобретения, включает эукариотные HSP, HSP млекопитающего и HSP человека. Эукариотный источник, из которого получают препарат HSP, и субъект, получающий препарат HSP, предпочтительно относятся в одному и тому же виду.

В различных вариантах осуществления препарат HSP может содержать HSP, включающие, но не ограничивающиеся перечисленным, hsp60, hsp70, hsp90, hsp110, gp96, grp170 или калретикулин, по отдельности или в комбинации друг с другом. HSP предпочтительно представляет собой hsp60, hsp70, hsp90, hsp110, gp96, grp170 или калретикулин. Настоящее изобретение включает также комплексы HSP-пептид, такие как комплексы hsp60-пептид, комплексы hsp70-пептид, комплексы hsp90-пептид, комплексы hsp110-пептид, комплексы gp96-пептид, комплексы grp170-пептид или комплексы калретикулин-пептид. Настоящее изобретение включает также слитые белки HSP, такие как слитые белки hsp60, слитые белки hsp70, слитые белки hsp90, слитые белки hsp110, слитые белки gp96, слитые белки grp170 или слитые белки калретикулина.

В предпочтительном варианте осуществления препарат HSP содержит одиночный (свободный) HSP, комплекс HSP или слитый белок HSP. В другом варианте осуществления настоящего изобретения препарат HSP содержит смеси HSP, комплексы HSP или слитые белки HSP. Предпочтительно смесь HSP, комплексов HSP и/или слитых белков HSP содержит два или больше по существу чистых HSP, комплексов HSP и/или слитых белков HSP. Используемый здесь термин «по существу чистый» означает по существу свободный от соединений, обычно связанных с HSP или комплексом HSP в его природном состоянии, и проявляющий постоянную и воспроизводимую хроматографическую характеристику, профили элюирования и биологическую активность. По существу чистые комплексы HSP не выделяют пептиды, которые образуют с HSP комплекс ковалентным или нековалентным образом, или пептиды, которые образуют эндогенный комплекс с HSP. Термин «по существу чистый» не означает, что он не включает в себя искусственные или синтетические смеси HSP, комплекса HSP или слитых белков HSP с другими соединениями. Большое число неограничивающих примеров HSP, комплексов HSP и слитых белков HSP и способов их получения представлено ниже.

В одном варианте осуществления, когда препарат HSP используют не в сочетании с иммунореактивным реагентом для индукции специфической иммунной реакции, введение только препарата HSP не индуцирует антигенспецифическую иммунную реакцию, которая могла бы быть индуцирована иммунореактивным реагентом. В другом варианте осуществления препарат HSP действительно индуцирует антигенспецифическую иммунную реакцию, которая могла бы быть индуцирована иммунореактивным реагентом.

Подразумевается, что все HSP, относящиеся к семействам hsp60, hsp70 и hsp90, в том числе фрагменты таких HSP, могут быть использованы на практике настоящего изобретения.

В настоящем изобретении используют очищенные несвязанные HSP, HSP, ковалентно или нековалентно связанные со специфическими пептидами или неспецифическими пептидами (сообща называемые в настоящем описании комплексами HSP-пептид), слитые белки HSP и их комбинации. Очистка HSP в форме комплексов или в свободной форме описывается в следующих подразделах. Кроме того, специалист в данной области может синтезировать HSP и слитые белки HSP рекомбинантной экспрессией или пептидным синтезом, которые также описаны ниже.

В другом варианте осуществления подразумевается, что белками HSP могут быть другие белки, мутеины, аналоги и их варианты, имеющие, по меньшей мере, 35-55%, предпочтительно 55-75% и наиболее предпочтительно 75-85% аминокислотную идентичность с членами трех основных семейств белков стресса, уровни экспрессии которых в клетке повышаются в ответ на стрессовый стимул. Получение, выделение и очистка белков стресса, принадлежащих к классу HSP, известны в данной области и описаны в литературе. Например, получение и очистка калретикулина описана в публикации Basu and Srivastava, 1999 J. Expt. Med. 189: 797-802, включенной здесь в качестве ссылки во всей ее полноте. Изобретение включает также способы получения и очистки HSP и комплексов HSP-пептид, они описаны ниже и представлены путем примера, но не путем ограничения.

4.6.1 Получение и очистка Hsp70 или комплексов Hsp70-пептид

Очистка комплексов hsp70-пептид была описана ранее, см., например, Udono et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 1391-1396. Процедура, которая может быть использована и представлена посредством примера, но без ограничения, является следующей.

Сначала клетки человека или млекопитающего суспендируют в 3 объемах буфера для лизиса 1X, состоящего из буфера, 5 мМ фосфата натрия (рН 7), 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂ и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Затем осадок подвергают действию ультразвука при охлаждении льдом до тех пор, пока >99% клеток не будет лизировано, причем % лизиса определяют микроскопическим исследованием. В качестве альтернативы обработки ультразвуком клетки могут быть лизированы механическим фрагментированием и при таком подходе клетки обычно ресуспендируют в 30 мМ бикарбонате натрия (рН 7,5), 1 мМ PMSF, инкубируют на льду в течение 20 минут и затем гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса до тех пор, пока не будет лизировано >95% клеток.

Затем лизат центрифугируют при 1000 × g в течение 10 минут для удаления неразрушенных клеток, ядер и другого клеточного дебриса. Образовавшийся супернатант снова центрифугируют при 100000 × g в течение 90 минут, супернатант собирают и затем смешивают с сефарозой ^ТМ Con А, уравновешенной забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), содержащим 2 мМ Са²⁺ и 2 мМ Mg ²⁺. Когда клетки лизируют механическим фрагментированием, супернатант разводят равным объемом буфера для лизиса 2Х перед смешиванием с сефарозой^ТМ Con А. Супернатант затем выдерживают для связывания с сефарозой^ТМ Con А в течение 2-3 часов при 4°С. Материал, который не связался, собирают и диализуют в течение 36 часов (три раза, 100 объемов каждый раз) против 10 мМ Трис-ацетата (рН 7,5), 0,1 мМ EDTA, 10 мМ NaCl, 1 мМ PMSF. Затем диализат центрифугируют при 17000 об/мин (Sorvall SS34 rotor) в течение 20 минут. Затем образовавшийся супернатант собирают и вводят в ионообменную хроматографическую колонку Mono Q FPLC^TM (Pharmacia), уравновешенную 20 мМ Трис-ацетатом (рН 7,5), 20 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA и 15 мМ 2-меркаптоэтанолом. К колонке затем применяют градиент 20 - 500 мМ NaCl и затем элюированные фракции фракционируют гель-электрофорезом в системе додецилсульфат натрия-полиакриламидный гель (SDS-PAGE) и характеризуют иммуноблоттингом с использованием подходящего антитела против hsp70 (например, из клона N27F3-4, из StressGen).

Фракции, сильно иммунореагирующие с антителом против hsp70, объединяют и комплексы hsp70-пептид осаждают сульфатом аммония; особенно 50-70% сульфатом аммония. Образовавшийся осадок затем собирают центрифугированием при 17000 об/мин (SS34 Sorvall rotor) и промывают 70% сульфатом аммония. Промытый осадок затем солюбилизируют и любой остаточный сульфат аммония удаляют гель-фильтрацией на колонке с сефадексом ^R G25 (Pharmacia). Если необходимо, таким образом, полученный препарат hsp70 может быть снова очищен пропусканием через ионообменную хроматографическую колонку Mono Q FPLC^TM (Pharmacia), как описано выше.

С использованием этого способа комплекс hsp70-пептид может быть очищен до очевидной гомогенности. Обычно 1 мг комплекса hsp70-пептид можно очистить из 1 г клеток/ткани.

Улучшенный способ очистки комплексов hsp70-пептид включает контактирование клеточных белков с АДФ или негидролизуемым аналогом АТФ, связанным с твердым субстратом, так чтобы hsp70 в лизате мог связываться с АДФ или негидролизуемым аналогом АТФ, и элюирование связанного hsp70. В предпочтительном способе используют колоночную хроматографию с АДФ, связанным с твердым субстратом (например, АДФ-агарозу). Образовавшиеся препараты hsp70 являются очень чистыми и не содержат загрязняющие белки, которые не являются эндогенно связанными пептидами, связанными с HSP в комплексе HSP-пептид. Выходы комплекса hsp70 также значительно повышаются, приблизительно больше чем в 10 раз. В альтернативном варианте для очистки комплексов hsp70-пептид может быть использована хроматография с негидролизуемыми аналогами АТФ вместо АДФ. В качестве примера, но без ограничения изобретения, очистку комплексов hsp70-пептид хроматографией на АДФ-агарозе можно проводить следующим образом.

Клетки саркомы Meth F (500 миллионов клеток) гомогенизируют в гипотоническом буфере и лизат центрифугируют при 100000 × g в течение 90 минут при 4°С. Супернатант вводят в колонку АДФ-агароза. Колонку промывают буфером и элюируют 5 объемами колонки 3 мМ АДФ. Комплексы hsp70-пептид элюируются во фракциях 2-10 из полученных при элюировании всего 15 фракций. Элюированные фракции анализируют с помощью SDS-PAGE. С использованием этой процедуры комплексы hsp70-пептид могут быть очищены до явной гомогенности.

Выделение HSP из комплекса hsp70-пептид может быть проведено в присутствии АТФ или низком значении рН. Для элюирования пептида из комплекса hsp70-пептид могут быть использованы два этих способа. Первый подход включает инкубацию препарата комплекса hsp70-пептид в присутствии АТФ. Второй подход включает инкубацию препарата комплекса hsp70-пептид в буфере с низким значением рН. Эти способы и любые другие способы, известные в данной области, могут быть использованы для выделения HSP и пептида из комплекса hsp-пептид.

4.6.2 Получение и очистка Hsp90 или комплексов Hsp90-пептид

Процедура, которая может быть использована и которая представлена посредством примера и без ограничения, является следующей.

Сначала клетки человека или млекопитающего суспендируют в 3 объемах буфера для лизиса 1Х, состоящего из буфера, 5 мМ фосфата натрия (рН 7), 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂ и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Затем осадок подвергают действию ультразвука при охлаждении льдом до тех пор, пока >99% клеток не будет лизировано, причем % лизирования определяют микроскопическим исследованием. В качестве альтернативы обработки ультразвуком клетки могут быть лизированы механическим фрагментированием, и при таком подходе клетки обычно снова суспендируют в 30 мМ бикарбонате натрия (рН 7,5), 1 мМ PMSF, инкубируют на льду в течение 20 минут и затем гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса до тех пор, пока не будет лизировано >95% клеток.

Затем лизат центрифугируют при 1000 × g в течение 10 минут для удаления неразрушенных клеток, ядер и другого клеточного дебриса. Образовавшийся супернатант снова центрифугируют при 100000 × g в течение 90 минут, супернатант собирают и затем смешивают с сефарозой^ТМ Con А, уравновешенной PBS, содержащим 2 мМ Са²⁺ и 2 мМ Mg²⁺. Когда клетки лизируют механическим фрагментированием, супернатант разводят равным объемом буфера для лизиса 2Х перед смешиванием с сефарозой^ТМ Con А. Супернатант затем выдерживают для связывания с сефарозой^ТМ Con А в течение 2-3 часов при 4°С. Материал, который не связывается, собирают и диализуют в течение 36 часов (три раза, 100 объемов каждый раз) против 10 мМ Трис-ацетата (рН 7,5), 0,1 мМ EDTA, 10 мМ NaCl, 1 мМ PMSF. Затем диализат центрифугируют при 17000 об/мин (Sorvall SS34 rotor) в течение 20 минут. Затем образовавшийся супернатант собирают и вводят в ионообменную хроматографическую колонку Mono Q FPLC^TM (Pharmacia), уравновешенную буфером для лизиса. Белки затем элюируют градиентом соли от 200 до 600 мМ NaCl.

Элюированные фракции фракционируют с помощью SDS-PAGE и фракции, содержащие комплексы hsp00-пептид, идентифицируют иммуноблоттингом с использованием антитела против hsp90, такого как 3G3 (Affinity Bioreagents). С использованием этой процедуры комплексы hsp90-пептид могут быть очищены до явной гомогенности. Обычно 150-200 мкг комплекса hsp90-пептид может быть очищено из 1 г клеток/ткани.

Выделение HSP из комплекса hsp90-пептид может быть проведено в присутствии АТФ или при низком значении рН. Для элюирования пептида из комплекса hsp90-пептид могут быть использованы два этих способа. Первый подход включает инкубацию препарата комплекса hsp90-пептид в присутствии АТФ. Второй подход включает инкубацию препарата комплекса hsp90-пептид в буфере с низким значением рН. Эти способы и любые другие способы, известные в данной области, могут быть использованы для выделения HSP и пептида из комплекса hsp-пептид.

4.6.3 Получение и очистка Gp96 и комплексов Gp96-пептид

Процедура, которая может быть использована и которая представлена посредством примера и без ограничения, является следующей.

Осадок клеток человека или млекопитающего ресуспендируют в 3 объемах буфера, содержащего буфер из 30 мМ бикарбоната натрия (рН 7,5) и 1 мМ PMSF, и клеткам дают возможность набухать 20 минут на льду. Осадок клеток затем гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса (подходящий клиренс гомогенизатора будет варьировать в соответствии с каждым типом клеток) при охлаждении льдом до лизирования >95% клеток.

Лизат центрифугируют при 1000 × g в течение 10 минут для удаления неразрушенных клеток, ядер и другого дебриса. Супернатант из этой стадии центрифугирования затем снова центрифугируют при 100000 × g в течение 90 минут. Комплекс gp96-пептид может быть очищен либо из осадка в пробирке, либо из супернатанта после центрифугирования при 100000 × g.

При очистке из супернатанта супернатант разводят равным объемом буфера для лизиса 2Х и супернатант перемешивают в течение 2-3 часов при 4°С с сефарозой^ТМ Сon A, уравновешенной PBS, содержащим 2 мМ Са²⁺ и 2 мМ Mg²⁺. Затем суспензию вводят в колонку и промывают буфером для лизиса 1Х до тех пор, пока OD₂₈₀ не опустится до базовой линии. Затем колонку промывают 10% -метилманнозидом ( -ММ), растворенным в PBS, содержащем 2 мМ Са²⁺ и 2 мМ Mg²⁺, применяемом к количестве 1/3 объема слоя колонки, колонку герметизируют кусочком парафина и инкубируют при 37°С в течение 15 минут. Затем колонку охлаждают до комнатной температуры и парафин удаляют со дна колонки. В колонку вводят пять объемов колонки -ММ-буфера и элюат анализируют с помощью SDS-PAGE. Образовавшийся материал обычно имеет чистоту приблизительно 60-95%, однако она зависит от типа клеток и используемого отношения ткани к буферу для лизиса. Затем образец вводят в ионообменную хроматографическую колонку Моno Q FPLC^TM (Pharmacia), уравновешенную буфером, содержащим 5 мМ фосфат натрия (рН 7). Белки затем элюируют из колонки градиентом 0-1М NaCl и фракцию gp96 элюируют между 400 мМ и 550 мМ NaCl.

Данная процедура, однако, может быть модифицирована двумя дополнительными стадиями, используемыми по отдельности или в комбинации, чтобы постоянно получать явно гомогенный комплекс gp96-пептид. Одна необязательная стадия включает осаждение сульфатом аммония перед стадией очистки на Con A, и другая необязательная стадия включает очистку на DEAE-сефарозе ^ТМ после стадии очистки на Con A, но перед стадией очистки на Mono Q FPLC.

В первой необязательной стадии, описанной посредством примера, как указано ниже, супернатант, образовавшийся после стадии центрифугирования при 100000 × g, доводят до конечной концентрации 50% сульфата аммония добавлением сульфата аммония. Сульфат аммония добавляют медленно при осторожном перемешивании раствора в химическом стакане, помещенном в поддон с ледяной водой. Раствор перемешивают в течение приблизительно от 1/2 до 12 часов при 4°С и образовавшийся раствор центрифугируют при 6000 об/мин (Sorvall SS34 rotor). Супернатант, образовавшийся на этой стадии, удаляют, насыщают до 70% сульфата аммония добавлением раствора сульфата аммония и центрифугируют при 6000 об/мин (Sorvall SS34 rotor). Образовавшийся в пробирке осадок этой стадии собирают и суспендируют в PBS, содержащем 70% сульфата аммония, чтобы промыть осадок. Эту смесь центрифугируют при 6000 об/мин (Sorvall SS34 rotor) и осадок в пробирке растворяют в PBS, содержащем 2 мМ Са²⁺ и Mg²⁺. Нерастворенный материал удаляют недолгим центрифугированием при 15000 об/мин (Sorvall SS34 rotor). Затем раствор смешивают с сефарозой^ТМ Con А и обрабатывают по процедуре, которую применяли до этого.

Во второй необязательной стадии, описанной посредством примера, как указано ниже, содержащие gp96 фракции, элюированные с колонки с Con A, объединяют и проводят замену буфера на буфер 5 мМ фосфат натрия (рН 7), 300 мМ NaCl диализом или, что предпочтительно, буферной заменой на колонке с сефадексом G25. После замены буфера раствор смешивают с DEAE-сефарозой^ТМ, предварительно уравновешенной буфером 5 мМ фосфата натрия (рН 7), 300 мМ NaCl. Раствор белка и шарики осторожно перемешивают в течение 1 часа и выливают в колонку. Затем колонку промывают буфером 5 мМ раствора фосфата натрия (рН 7), 300 мМ NaCl до тех пор, пока поглощение при 280 нм не понизится до базовой линии. Затем связанный белок элюируют с колонки пятью объемами буфера 5 мМ фосфата натрия (рН 7), 700 мМ NaCl. Содержащие белок фракции объединяют и разводят буфером 5 мМ фосфата натрия (рН 7) для снижения концентрации соли до 175 мМ. Образовавшийся материал затем вводят в ионообменную хроматографическую колонку Mono Q FPLC^TM (Pharmacia), уравновешенную буфером 5 мМ фосфата натрия (рН 7), и белок, который связывается с ионообменной хроматографической колонкой Mono Q FPLC^TM (Pharmacia), элюируют, как описано выше.

Однако очевидно, что специалист в данной области может оценить обычным экспериментированием преимущество включения второй необязательной стадии в протокол очистки. Кроме того, очевидно также, что польза от добавления каждой из необязательных стадий будет зависеть от источника исходного материала.

Когда фракцию gp96 выделяют из осадка в пробирке после центрифугирования при 100000 × g, осадок суспендируют в 5 объемах PBS, содержащего либо 1% деоксихолата натрия, либо 1% окстилглюкопиранозида (но без Mg²⁺ и Са²⁺), и суспензию инкубируют на льду в течение 1 часа. Суспензию центрифугируют при 20000 × g в течение 30 минут и образовавшийся супернатант диализуют против нескольких замен PBS (также без Mg²⁺ и Са ²⁺) для удаления детергента. Диализат центрифугируют при 100000 × g в течение 90 минут, супернатант собирают и к супернатанту добавляют кальций и магний до получения конечных концентраций 2 мМ соответственно. Затем образец очищают либо немодифицированным, либо модифицированным способом для выделения комплекса gP96-пептид из супернатанта центрифугирования при 100000 × g, см. выше.

С использованием данной процедуры комплекс gр96-пептид может быть очищен до явной гомогенности. Приблизительно 10-20 мкг gp96 может быть выделено из 1 г клеток/ткани.

Выделение HSP из комплекса gp96-пептид может быть проведено в присутствии АТФ или при низком значении рН. Для элюирования пептида из комплекса gp96-пептид могут быть использованы два этих способа. Первый подход включает инкубацию препарата комплекса gp96-пептид в присутствии АТФ. Второй подход включает инкубацию препарата комплекса gp96-пептид в буфере с низким значением рН. Эти способы и любые другие способы, известные в данной области, могут быть использованы для выделения HSP и пептида из комплекса gp96-пептид.

4.6.4 Получение и очистка комплексов Hsp110-пептид

Процедура, которая описана Wang et al., 2001, J. Immunol. 166(1): 490-7, может быть использована и представлена посредством примера без ограничения, является следующей.

Осадок (40-60 мл) клеток или ткани, например ткани опухолевых клеток, гомогенизируют в 5 объемах гипотонического буфера (30 мн бикарбонат натрия, рН 7,2, и ингибиторы протеазы) с помощью гомогенизатора Даунса. Лизат центрифугируют при 4500 × g и затем 100000 × g в течение 2 часов. Если клетки или ткани имеют печеночное происхождение, образовавшийся супернатант сначала вводят в колонку голубой сефарозы (Pharmacia) для удаления альбумина. В противном случае образовавшийся супернатант вводят в колонку с сефарозой Con-A (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), предварительно уравновешенной буфером для связывания (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 100 мМ NaCl; 1 мМ MgCl₂; 1 мМ СаCl₂; 1 мМ MnCl₂ и 15 мМ 2-МЕ). Связанные белки элюируют буфером для связывания, содержащим 15% -D-о-метилманнозида (Sigma, St. Louis, MO).

Несвязанный с сефарозой Con-A материал сначала диализуют против раствора 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 100 мМ NaCl и 15 мМ 2-МЕ и затем вводят в колонку DEAE-сефароза и элюируют градиентом соли от 100 до 500 мМ NaCl. Фракции, содержащие hsp110, собирают, диализуют и загружают в колонку Mono Q (Pharmacia) 10/10, уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 200 мМ NaCl и 15 мМ 2-МЕ. Связанные белки элюируют градиентом 200-500 мМ NaCl. Фракции анализируют с помощью SDS-PAGE с последующим иммуноблоттингом с Ab для hsp110, как описано Wang et al., 1999, J. Immunol. 162: 3378. Объединенные фракции, содержащие hsp110, концентрируют прибором Centriplus (Amicon, Beverly, MA) и вводят в колонку суперозы 12 (Pharmacia). Белки элюируют 40 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 150 мМ NaCl и 15 мМ 2-МЕ при скорости потока 0,2 мл/мин.

4.6.5 Получение и очистка продуцированных комплексов Grp170-пептид

Процедура, которая описана Wang et al., 2001, J. Immunol. 166(1): 490-7, может быть использована и представлена посредством примера без ограничения, является следующей.

Осадок (40-60 мл) клеток или ткани, например ткани опухолевых клеток, гомогенизируют в 5 объемах гипотонического буфера (30 мн бикарбонат натрия, рН 7,2, и ингибиторы протеазы) с помощью гомогенизатора Даунса. Лизат центрифугируют при 4500 × g и затем 100000 × g в течение 2 часов. Если клетки или ткани имеют печеночное происхождение, образовавшийся супернатант сначала вводят в колонку голубой сефарозы (Pharmacia) для удаления альбумина. В противном случае образовавшийся супернатант вводят в колонку с сефарозой Con-A (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ0, предварительно уравновешенной буфером для связывания (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 100 мМ NaCl; 1 мМ MgCl₂; 1 мМ СаCl₂; 1 мМ MnCl₂ и 15 мМ 2-МЕ). Связанные белки элюируют буфером для связывания, содержащим 15% -D-о-метилманнозида (Sigma, St. Louis, MO).

Связанный с сефарозой Con-A материал сначала диализуют против раствора 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, и 150 мМ NaCl и затем вводят в колонку Mono Q и элюируют градиентом соли 150-400 мМ NaCl. Объединенные фракции концентрируют и вводят в колонку суперозы 12 (Pharmacia). Собирают фракции, содержащие гомогенный grp170.

4.6.6. Рекомбинантная экспрессия HSP

Способы, известные в данной области, могут быть использованы для рекомбинантного продуцирования HSP. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая HSP, может быть вставлена в вектор экспрессии для размножения и экспрессии в клетках хозяина.

Используемая здесь экспрессионная конструкция относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей HSP, функционально связанной с одним или несколькими регуляторными областями, которые делают возможной экспрессию HSP в подходящей клетке-хозяине. «Функционально связанная» относится к связыванию, в котором регуляторные области и HSP-последовательность, которая должна быть экспрессирована, соединяются и располагаются таким образом, чтобы сделать возможной транскрипцию и, в конечном счете, трансляцию.

Регуляторные области, необходимые для транскрипции HSP, могут быть обеспечены экспрессирующим вектором. Может быть также обеспечен кодон инициации трансляции (ATG), если должна быть экспрессирована последовательность гена HSP, лишенная своего собственного инициирующего кодона. В совместимой системе конструкция-хозяин клеточные факторы транскрипции, такие как РНК-полимераза, будут связываться с регуляторными областями на экспрессионной конструкции для осуществления транскрипции модифицированной последовательности HSP в организме-хозяине. Точная природа регуляторных областей, необходимых для экспрессии гена, может варьировать от одной клетки-хозяина к другой клетке-хозяину. Обычно требуется промотор, который способен связывать РНК-полимеразу и запускать транскрипцию функционально связанной последовательности нуклеиновой кислоты. Такие регуляторные области могут включать 5'-некодирующие последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, такие как ТАТА-бокс, кэпирующая последовательность, СААТ-последовательность и тому подобное. Некодирующий район 3' (справа) относительно кодирующей последовательности может содержать регуляторные последовательности терминации транскрипции, такие как терминаторы и сайты полиаденилирования.

Для присоединения ДНК-последовательностей с регуляторными функциями, таких как промоторы, к последовательности гена HSP, или встраивания последовательности гена HSP в клонирующий сайт вектора, линкеры или адапторы, обеспечивающие подходящие совместимые сайты рестрикции, могут быть лигированы к концам кДНК способами, хорошо известными в данной области (Wu et al., 1987, Methods in Enzymol. 152: 343-349). За расщеплением ферментом рестрикции может следовать модификация для создания тупых концов обратным отщеплением или достраиванием одноцепочечной ДНК перед лигированием. В альтернативном варианте нужный сайт рестрикции фермента может быть введен во фрагмент ДНК амплификацией этой ДНК посредством использования ПЦР с праймерами, содержащими нужный сайт рестрикции фермента.

Экспрессионная конструкция, содержащая HSP-последовательность, функционально связанную с регуляторными областями, может быть непосредственно введена в подходящие клетки-хозяева для экспрессии и продуцирования комплексов HSP-пептид без дополнительного клонирования. См., например, патент США № 5580859. Экспрессионная конструкция может содержать также ДНК-последовательности, которые способствуют интеграции HSP-последовательности в геном клетки-хозяина, например, посредством гомологичной рекомбинации. В этом случае нет необходимости использовать экспрессирующий вектор, содержащий ориджин репликации, подходящий для соответствующих клеток-хозяев с целью размножения и экспрессии HSP в клетках-хозяевах.

Могут быть использованы различные векторы экспрессии, включающие, но не ограничивающиеся перечисленным, плазмиды, космиды, фаг, фагмиды или модифицированные вирусы. Обычно такие экспрессирующие векторы содержат функциональный ориджин репликации для размножения вектора в подходящей клетке-хозяине, один или несколько сайтов рестрикционных эндонуклеаз для встраивания последовательностей гена HSP и один или несколько селектируемых маркеров. Экспрессионный вектор должен быть использован с совместимой клеткой-хозяином, которая может быть получена из прокариотного или эукариотного организма, включающего, но не ограничивающегося перечисленным, бактерии, дрожжи, насекомых, млекопитающих и людей.

Для длительного продуцирования с высоким выходом должным образом процессированного HSP или комплексов HSP-пептид предпочтительной является стабильная экспрессия в клетках млекопитающего. Клеточные линии, которые стабильно экспрессируют HSP или комплексы HSP-пептид, могут быть сконструированы с использования вектора, который содержит селектируемый маркер. Посредством примера, но без ограничения, после введения экспрессионных конструкций сконструированным клеткам может быть предоставлена возможность для роста в течение 1-2 дней в обогащенной среде и затем их переносят в селективную среду. Селектируемый маркер в экспрессионной конструкции придает устойчивость к отбору и оптимально позволяет клеткам стабильно интегрировать экспрессионную конструкцию в их хромосомы и расти в культуре и размножаться в клеточные линии. Такие клетки можно культивировать в течение длительного периода времени при непрерывной экспрессии HSP.

Рекомбинантные клетки можно культивировать в стандартных условиях температуры, времени инкубации, оптической области и состава среды. Однако условия для роста рекомбинантных клеток могут быть отличными от условий экспрессии HSP и антигенных белков. Для повышения продуцирования HSP могут также быть использованы модифицированные условия культивирования и среды. Например, рекомбинантные клетки, содержащие HSP со своими собственными промоторами, могут быть подвергнуты тепловому или другому стрессу окружающей среды или химическому стрессу. Любые способы, известные в данной области, могут быть использованы для создания оптимальных условий для продуцирования HSP или комплексов HSP-пептид.

4.6.6.1. Рекомбинантная экспрессия слитых белков HSP

Способы, известные в данной области, могут быть использованы для продуцирования рекомбинантным образом слитых белков, состоящих из последовательности белка теплового шока и последовательности антигенного пептида. Для продуцирования таких рекомбинантных слитых белков экспрессирующий вектор конструируют с использованием последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белок теплового шока, слитых с последовательностями, кодирующими антигенный пептид, с использованием рекомбинантных способов, известных в данной области, таких как способы, описанные в указанном выше разделе 4.6.6. Слитые белки HSP-антигенный пептид затем экспрессируют и выделяют. Такие слитые белки могут быть использованы для индукции иммунной реакции; Suzue et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 13146-51. Посредством специфического конструирования антигенной пептидной части молекулы такие слитые белки могут быть использованы для индукции иммунной реакции и в иммунотерапии против подлежащих лечению заболеваний или нарушений.

4.6.7 Синтез пептидов

Альтернативой получению HSP рекомбинантными способами является синтез пептидов. Например, целый HSP или пептид, соответствующий части HSP, может быть синтезирован с использованием синтезатора пептидов. Может быть использован общепринятый синтез пептидов или другие синтетические протоколы, хорошо известные в данной области.

Пептиды, имеющие аминокислотную последовательность HSP или его части, могут быть синтезированы твердофазным синтезом пептидов с использованием процедур, сходных с процедурами, описанными Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149. Во время синтеза N- -защищенные аминокислоты, имеющие защищенные боковые цепи, присоединяют шаг за шагом к растущей полипептидной цепи, связанной своей С-концевой частью с нерастворимым полимерным носителем, т.е. гранулами полистирола. Пептиды синтезируют связыванием аминогруппы N- -незащищенной аминокислоты с -карбоксильной группой N- -защищенной аминокислоты, которая была активирована взаимодействием ее с таким реагентом, как дициклогексилкарбодиимид. Присоединение свободной аминогруппы к активированному карбоксилу приводит к образованию пептидной связи. Наиболее обычно используемые N- -защитные группы включают Вос, который является нестабильным при действии кислоты, и Fmoc, который является нестабильным при действии основания. Детали подходящих химических анализов, смол, защитных групп, защищенных аминокислот и реагентов хорошо известны в данной области и поэтому подробно в данном описании не обсуждаются (см. Atherton, et al., 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, and Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2^nd ed., Springer-Verlag).

Очистку образовавшегося HSP выполняют с использованием общепринятых процедур, таких как препаративная ВЭЖХ, гель-проникающая, распределительная и/или ионообменная хроматография. Выбор подходящих матриц и буферов является хорошо известным в данной области и поэтому в данном описании не описывается подробно.

4.7 Активированные антигенпрезентирующие клетки (АРС)

В различных вариантах осуществления, как описано выше, вместо препарата HSP субъекту для достижения сходного результата могут быть введены активированные APC. Настоящее изобретение включает способ активации антиген-презентирующих клеток, включающий контактирование APC с препаратом HSP. Перед обработкой препаратом HSP для активации APC клетки могут быть необязательно обогащены или очищены и/или размножены ex vivo способами, хорошо известными в данной области. APC могут быть получены из организма субъекта, предпочтительно того же самого субъекта, которому снова вводят обработанные APC (т.е. используют аутогенные APC), могут быть также использованы неаутогенные АРС. Неаутогенные APC могут быть сингенными (т.е. взятыми из идентичного близнеца индивидуума, которому будут введены активированные APC) или аллогенными (т.е. взятыми у индивидуума, который имеет, по меньшей мере, один общий аллель МНС с индивидуумом, которому активированные APC будут введены).

Мониторинг активации АРС может быть проведен способами, хорошо известными в данной области, такими как способы, описанные в разделе 6 для тестирования CD11b ⁺-клеток, но не ограничивающиеся такими способами. В определенном варианте осуществления активированные АРС могут быть использованы in vivo для индуцирования или усиления иммунной реакции, вызванной иммунореактивным реагентом, который вводят субъекту в разумно то же самое время. Активированные АРС могут быть альтернативно введены в различные интервалы времени, как описано выше, но эти интервалы не ограничиваются указанными интервалами, от одного до двенадцати часов до или после введения иммунореактивного реагента, или периодически в течение нескольких дней или больше после использования иммунореактивного реагента медленно или непрерывно высвобождающего типа. Обработанные АРС предпочтительно вводят в место у или около места введения иммунореактивного реагента. Введение активированных АРС может быть проведено любыми способами, известными в данной области.

4.8 Иммунореактивные реагенты

Иммунореактивные реагенты включают антитела, молекулы или белки, в которые методом генной инженерии включена антигенсвязывающая часть антитела, молекулы или белков, антитела, молекулы или белки, в которые методом генной инженерии включен антигенсвязывающий домен, который распознает представляющий интерес антиген-мишень, и домен константной области, который опосредует антителозависимые иммунные реакции, пептид или домен, который взаимодействует специфически с представляющим интерес антигеном, или любой антигенсвязывающий домен, который взаимодействует с представляющим интерес антигеном/эпитопом, и домен константной области антитела, который опосредует антителозависимые иммунные реакции или процессы эффекторных клеток. Примеры таких доменов или областей в константной области Ab, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают домены и области, описанные в публикациях Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164(4): 1925-33; Coloma et al., 1997, Nat. Biotechnol. 15(2): 159-63; Carayannopoulos et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91(18): 8348-52; Morrison, 1992, Annu. Recombinant Expression Vector Immunol. 10:239-65; Traunecker et al., 1992, Int. J. Cancer Suppl. 7: 51-2; Gillies et al., 1990, Hum. Antibodies Hybridomas 1(1): 47-54; каждая из которых включена в данное описание в качестве ссылки во всей ее полноте.

Иммунореактивные реагенты настоящего изобретения предпочтительно содержат 1) антигенсвязывающую область и 2) область, которая опосредует один или несколько антителозависимых иммунологических процессов. Антигенсвязывающая область может содержать или состоять из антигенсвязывающей области антитела. Антигенсвязывающая область может содержать любой пептид или домен, который специфически взаимодействует с представляющим интерес антигеном. Например, антигенсвязывающей областью может быть лиганд или другой специфический связывающий партнер представляющего интерес антигена, или может быть фрагмент такого лиганда или связывающего партнера, или может быть получен из такого лиганда или связывающего партнера.

Область, которая опосредует один или несколько антителозависимых иммунологических процессов, может содержать или состоять из области, которая способна связывать Fc-рецептор, например часть антитела, которая связывает Fc-рецептор, или область, которая связывает комплемент, например комплементсвязывающая область антитела. Этой областью может быть антигенсвязывающий домен антитела, который связывается с Fc-рецепторами или комплементом.

Такие антителозависимые процессы включают, но не ограничиваются перечисленным, антителозависимую клеточную цитотоксичность, активацию комплемента, опсонизацию и фагоцитоз. Эффекторные клетки, которые опосредуют некоторые антителозависимые процессы, включают моноциты, макрофаги, естественные клетки-киллеры и полиморфоядерные клетки. Без связи с определенным механизмом считают, что HSP способны увеличивать число рецепторов на эффекторных клетках, ответственных за опосредование антителозависимой реакции. Эти рецепторы включают Fc-альфа- и Fc-гамма-рецепторы, их изоформы или любую их комбинацию. Таким образом, в определенном варианте осуществления область иммунореактивного реагента, которая опосредует один или несколько антителозависимых иммунологических процессов, содержит или состоит из области, которая является лигандом для Fc-рецепторов, предпочтительно Fc- -рецептора или Fc-гамма-рецептора или для обоих. В другом варианте осуществления область иммунореактивного реагента, которая опосредует один или несколько антителозависимых иммунологических процессов, содержит или состоит из области, которая стимулирует функцию иммунных эффекторных клеток, предпочтительно моноцитов, макрофагов, естественных клеток-киллеров, полиморфоядерных клеток или любую комбинацию двух или более типов таких клеток, так чтобы достигалось профилактическое и/или терапевтическое действие. В некоторых вариантах осуществления, когда препарат HSP индуцирует иммунную реакцию, такую как высвобождение цитокина и/или активацию Т-клеток, иммунореактивный реагент потенцирует или костимулирует такие иммунные реакции.

В предпочтительном варианте осуществления иммунореактивным реагентом является антитело или композиция, содержащая антитело или антитела, такие как сыворотка. В определенном варианте осуществления иммунореактивный реагент представляет собой антитело IgA, IgG или IgM или содержит его фрагмент. В особенно предпочтительном варианте осуществления иммунореактивным реагентом является моноклональное антитело, или он включает фрагменты моноклонального антитела. Иммунореактивный реагент может содержать также или состоять из иммуноглобулина человека для лечения гепатита В; респигама для лечения RSV; сандоглобулина или иммуноглобулина IV (IGIV). В другом варианте осуществления иммунореактивный реагент не направляется к какому-либо одному эпитопу, а вместо этого представляет собой смесь одной или нескольких молекул, которая связывается с популяцией эпитопов. Примером такого иммунореактивного реагента является сыворотка или антитела, концентрированные из сыворотки или плазмы. Такая сыворотка или плазма может быть взята у субъекта, иммунизированного против определенного антигена, или у субъекта, который не был иммунизирован.

Антитела, которые могут быть использованы в способах настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются перечисленным, моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, полиспецифические антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab')-фрагменты, связанные дисульфидными связями Fv (sdFv), и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела к антителам настоящего изобретения) и эпитопсвязывающие фрагменты любого из указанных выше. В частности, антитела, используемые в способах настоящего изобретения, включают молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина, т.е. молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который иммуноспецифическим образом связывается с представляющей интерес мишенью. Молекулы иммуноглобулина настоящего изобретения могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄ , IgA₁ и IgА₂) или подкласса молекулы иммуноглобулина.

В другом варианте осуществления иммунореактивный реагент является биспецифической молекулой, имеющей две антигенсвязывающие области разной специфичности, т.е. одна распознающая эпитоп на клетке-мишени или белке, и другая, распознающая эпитоп эффекторной клетки, например эпитоп FcR. В другом варианте осуществления иммунореактивный реагент является биспецифической молекулой, имеющей два антигенсвязывающих домена для разных эпитопов на являющейся мишенью клетке/белке и домен, который опосредует антителозависимые иммунные реакции. Такие биспецифические молекулы, которые «нацелены» на раковые клетки или патогены, и их терапевтические действия были исследованы как in vivo, так и in vitro (например, в публикациях Wallace et al., 2001, J. Immunol. Methods 248(1-2): 167-82; Sundarapandiyan et al., 2001, J. Immunol. Methods 248(1-2): 113-23; Honeychurch et al., 2000, Blood 96(10): 3544-52; Negri et al., 1995, Br J Cancer 72(4):928-33; Wang et al., 1994, Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 16(2): 83-7, Chinese) (каждая из публикаций включена в данное описание в качестве ссылки во всей ее полноте).

В предпочтительном варианте осуществления иммунореактивный реагент очищают. Термин «очищенный», используемый здесь для описания некоторых пептидов, антител, молекул, белков, антигенов, HSP, комплексов HSP-пептид и тому подобное, относится к состоянию вне состояния, в котором молекулы, белки, антигены и тому подобное отделяют от более чем 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% белков, полисахаридов и/или липидов, с которыми пептиды, антитела, молекулы, белки, антигены, HSP, комплексы HSP-пептид и тому подобное обычно связаны в природе. Если выделенные молекулы, белки, антигены, HSP, комплексы HSP-пептид и тому подобное синтезированы, они загрязнены менее чем на 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или 0,1% химическими предшественниками или реагентами синтеза, используемыми в синтезе молекул, белков, антигенов, HSP, комплексов HSP-пептид и тому подобное. В предпочтительных вариантах осуществления пептиды, антитела, молекулы, белки антигены, HSP, комплексы HSP-пептид и тому подобное имеют, по меньшей мере, 1% чистоту, 5% чистоту, 10% чистоту, 20% чистоту, 30% чистоту, 40% чистоту, 50% чистоту, 60% чистоту, 70% чистоту, 80% чистоту, 90% чистоту, 95% чистоту, 99% чистоту или 100% чистоту. Используемый в настоящем описании термин «% чистоты» указывает массовый процент общей композиции, который делает молекулу «интересной». Так, композиция с массой 100 граммов, содержащая 50 граммов представляющей интерес молекулы, имеет 50% чистоту в отношении представляющей интерес молекулы.

Моноклональные антитела могут быть получены с применением большого разнообразия способов, известных в данной области, включая использование технологий гибридомы, рекомбинанта и фагового представления (дисплея) или их комбинации. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием способов гибридомы, хорошо известных в данной области, они описываются, например, в публикациях Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (обе публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей их полноте). Используемый здесь термин «моноклональное антитело» не ограничивается антителами, продуцированными посредством технологии гидридомы. Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, которое получено из одного клона, включая любой эукариотный, прокариотный или фаговый клон, а не к способу, которым оно получено.

4.8.1 Получение иммунореактивных реагентов

Иммунореактивные реагенты настоящего изобретения могут быть получены любым способом, известным в области синтеза антител, особенно химическим синтезом или, что предпочтительно, способами рекомбинантной экспрессии. Такие способы описаны ниже со ссылкой на иммунореактивный реагент, являющийся антителом, но они являются легко подходящими для получения других иммунореактивных реагентов.

Способы продуцирования и скрининга специфических антител с использованием технологии гидридомы, являются обычными и хорошо известны в данной области. В неограничивающем примере мыши могут быть иммунизированы представляющим интерес антигеном или клеткой, экспрессирующей такой антиген. После детекции иммунной реакции, например, антитела, специфические для такого антигена, обнаруживают в мышиной сыворотке, селезенку мыши отделяют и выделяют спленоциты. Спленоциты затем подвергают слиянию хорошо известными способами с любыми подходящими миеломными клетками. Гибридомы отбирают и клонируют посредством лимитирующего разведения. Клоны гибридомы затем анализируют способами, известными в данной области, на присутствие клеток, которые секретируют антитела, способные связывать антиген. Асцитная жидкость, которая обычно содержит высокие уровни антител, может быть генерирована инокуляцией мышей внутрибрюшинно позитивными гибридобными клонами.

Фрагменты антитела, которые распознают специфические эпитопы, могут быть генерированы известными способами. Например, фрагменты Fab и F(ab')₂ могут быть получены протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулина с использованием ферментов, таких как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')₂-фрагментов. F(ab')₂ -фрагменты содержат полную легкую цепь и вариабельную область, область СН1 и шарнирную область тяжелой цепи.

Антитела можно также генерировать, например, с использованием различных способов фагового представления, известных в данной области. В способах фагового представления домены функциональных антител расположены на поверхности фаговых частиц, которые несут кодирующие их полинуклеотидные последовательности. В конкретном варианте осуществления такой фаг может быть использован для представления антигенсвязывающих доменов, таких как Fab и Fv или стабилизированный дисульфидной связью Fv, экспрессированных из набора или библиотеки химерных антител (например, человеческих или мышиных). Фаг, экспрессирующий антигенсвязывающий домен, который связывает представляющий интерес домен, может быть выбран или идентифицирован с помощью антигена, например с использованием меченого антигена или антигена, связанного с твердой поверхностью или гранулой или захваченного такой поверхностью или гранулой. Фаг, используемый в этих способах, обычно является нитчатым фагом, включающим fd и М13. Антигенсвязывающие домены экспрессируют в виде рекомбинантным образом слитого белка с белком либо гена III, либо гена VIII фага. Примеры способов фагового представления, которые могут быть использованы для получения иммуноглобулина или его фрагментов настоящего изобретения, включают способы, описанные в публикациях Brinkman et al., 1995, J. Immunol Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al, 1994, Advances in Immunology 57:191-280; заявка PCT № PCT/GB91/01134; публикация PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401 и патентах США № № 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108; причем каждая из публикаций, заявок и патентов включена в данное описание в качестве ссылки во всей ее полноте.

Как описано в вышеуказанных ссылках, после отбора фага кодирующие антитело области фага могут быть выделены и использованы для генерирования целых антител, в том числе человеческих антител, или любых других нужных фрагментов и экспрессированы в любом нужном хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, растительные клетки, дрожжи и бактерии, например, как описано подробно ниже. Например, можно также использовать способы для рекомбинантного получения фрагментов Fab, Fab' и F(ab') ₂ с использованием методов, известных в данной области, таких как методы, описанные в публикации PCT WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; and Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; and Better et al., 1988, Science 240:1041-1043 (каждая из этих публикаций включена в качестве ссылки во всей ее полноте). Примеры способов, которые могут быть использованы для получения одноцепочечных FV и антител, включают способы, описанные в патентах США № № 4946778 и 5258498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al., 1993, PNAS 90:7995-7999; and Skerra et al., 1988, Science 240:1038-1040.

Для некоторых применений, включая применение антител in vivo в организме людей, могут быть предпочтительно использованы химерные, гуманизированные антитела или человеческие антитела. Химерным антителом является молекула, в которой разные части антитела получают из разных видов животных, такие как антитела, имеющие вариабельную область, полученную из мышиного моноклонального антитела, и константную область, полученную из человеческого иммуноглобулина. Способы получения химерных антител являются известными в литературе. См., например, публикации Mоrrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; патенты США № № 5807715; 4816567 и 4816397, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей их полноте. Гуманизированными антителами являются молекулы антител из вида, не являющегося человеком, которые связываются с нужным антигеном, имеют одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) из вида, не являющегося человеком, и каркасные области из молекулы иммуноглобулина человека. Часто каркасные остатки в каркасных областях человека могут быть заменены соответствующим остатком CDR-донорного антитела для изменения, предпочтительно усиления связывания антигена. Эти каркасные замены идентифицируют способами, хорошо известными в данной области, например моделированием взаимодействий CDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания антигена, и сравнивания последовательностей для идентификации необычных каркасных остатков в определенных положениях. См., например, Queen et al., патент США № 5585089; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323, которые включены в данное описание в качестве ссылки во всей их полноте. Антитела могут быть гуманизированы с использованием различных способов, известных в данной области, включая, например, CDR-перенос (EP 239400; публикация PCТ WO 91/09967; патенты США № № 5225539; 5530101 и 5585089), «облицовывание» (обволакивание) или образование другой поверхности (EP 592106; EP 519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al, 1994, Proc Natl Acad. Sci. USA, 91:969-973), и перестановку цепей (патент США № 5565332), причем все из этих публикаций и патентов включены в данное описание в качестве ссылки во всей их полноте).

Продолжительное использование терапевтических и/или профилактических антител может быть ограничено иммуногенностью антитела, которое вызывает иммунные реакции у хозяина, которые ограничивают их функциональную эффективность и применение. Были разработаны стратегии, включающие технологию TolerMab^TM (TolerRx, Cambridge, MA), для модификации моноклональных антител, чтобы снизить иммуногенность антитела и тем самым дать возможность проводить пролонгированное и/или периодическое введение антител для терапии и в то же самое время избежать нейтрализацию иммунной системой хозяина. В соответствии с этим, «толеризованное» моноклональное тело, которому была придана способность индуцирования толерантности к самому себе при сохранении способности иметь мишенью антиген и осуществлять свою функцию in vivо, может быть нужным для терапевтического или профилактического лечения пациентов в соответствии с настоящим изобретением. Gilliland et al., 1999, J. Immunol. 162:3663-71.

Полностью гуманизированные антитела являются особенно нужными для терапевтического или профилактического лечения пациентов-людей. Антитела человека могут быть получены различными способами, известными в данной области, включая описанные выше способы фагового представления с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулина человека. См. патенты США № № 4444887 и 4716111 и публикации РСТ WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735 и WO 91/10741, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей ее полноте.

Антитела человека могут быть также получены с использованием трансгенных мышей, которые являются неспособными экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать человеческие гены иммуноглобулина. Обзор этой технологии для получения антител человека см. в Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol 13:65-93. Подробное обсуждение этой технологии для получения антител человека и моноклональных антител человека и протоколы получения таких антител см., например, в публикациях PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Европейском патенте № 0598877; патентах США № № 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771 и 5939598, причем все публикации и патенты включены в данное описание в качестве ссылок во всей их полноте. Кроме того, для обеспечения антителами человека, направленными против выбранного антигена, могут быть указаны компании, такие как Abgenix®, Inc.. (Freemont, CA), Medarex® (NJ) и Genpharm® (San Jose, CA), использующие технологию, сходную с технологией, описанной выше.

Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, могут быть генерированы с использованием способа, называемого «управляемой селекцией». В этом подходе отобранное нечеловеческое моноклональное антитело, например мышиное антитело, используют для управления селекцией полностью человеческого антитела, распознающего тот же самый эпитоп (Jespers et al., 1988, Bio/technology 12:899-903).

В предпочтительном варианте осуществления антитела имеют in vivo терапевтические и/или профилактические применения. Примеры терапевтических и профилактических антител включают, но не ограничиваются перечисленным, MDX-010 (Medarex®, NJ), который является гуманизированным антителом против CTLA-4, используемым в настоящее время в клинике для лечения рака простаты; cинагис® (MedImmune®, MD), который является гуманизированным моноклональным антителом против респираторно-синтициального вируса (RSV), применяемым для лечения пациентов с инфекцией RSV; герцептин® (Trastuzumab) (Genentech®, CA), который является гуманизированным моноклональным антителом против HER2, применяемым для лечения пациентов с метастатическим раком грудной железы; ремикад® (infliximab) (Centocor®, PA), который является химерным моноклональным антителом против TNF , применяемым для лечения пациентов с болезнью Крона; реопро® (abciximab) (Centocor®), который является антителом против гликопротеинового (IIb/IIIa) рецептора на тромбоцитах, применяемый для предотвращения образования сгустка; зенапакс® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals®, Switzerland), который является иммуносупрессивным, гуманизированным моноклональным антителом против CD25, применяемым для профилактики острого отторжения почечного аллотрансплантата. Другими примерами являются гуманизированный F(ab')₂ против CD18 (Genentech®); CDP860, который является гуманизированным F(ab')₂ против СD18 (Celltech®, UK); PRO542, который является антителом против gp 120 ВИЧ, слитым с CD4 (Progenics®/Genzyme Transgenics®); оставир, который является антителом против вируса гепатита В человека (Protein Design Lab®/Novartis®); противир , который является гуманизированным антителом IgGl против CMV (Protein Design Lab®/Novartis®); МАК-195 (зекард®), который является мышиным F(ab')₂ против TNF- (Knoll Pharma®/BASF®); IC14, который является антителом против СD14 (ICOS Pharm®); гуманизированное антитело IgG1 против VEGF (Genentech®); оварекс , который является мышиным антителом против СА 125 (Altarex®); панорекс , который является мышиным антителом IgG2a против антигена клеточной поверхности 17-IA (Glaxo Wellcome®/Centocor®); BEC2, который является мышиным антиидиотипическим антителом IgG (эпитоп GD3) (ImClone System®); IMC-C225, который является химерным антителом IgG против EGFR (ImClone System®); витаксин , который является гуманизированным антителом против V 3-интегрина (Applied Molecular Evolution®/MedImmune®); кампат 1H/LDP-03, который является гуманизированным антителом IgGl против CD52 (лейкозит®); смарт Ml95, который является гуманизированным антителом IgG против CD33 (Protein Design Lab®/Kanebo®); ритуксан , который является химерным антителом IgGl против CD20 (IDЕС Pharm®/Genentech®, Roche®/Zettyaku®); лимфоцид , который является гуманизированным IgG против CD22 (Immunomedics®); смарт ID10, который является гуманизированным антителом против HLA (Protein Design Lab®); онколим (Lym-1), который является меченным радиоактивным изотопом мышиным антителом против HLA, применяемым в качестве диагностического реагента (Techniclone®); ABX-IL8 является человеческим антителом против IL8 (Abgenix®); анти-CDl1a, который является гуманизированным антителом IgGl против CD11 (Genentech®/Xoma®); ICM3, который является гуманизированным антителом против ICAM3 (IСOS Pharm®); идек-114, который является приматизированным антителом против CD80 (IDЕС Pharm®/Mitsubishi®); зевалин , который является меченным радиоактивным изотопом мышиным антителом против CD20 (IDEC®/Schering AG®); идек-131, который является гуманизированным антителом против CD40L (IDEC®/Eisai®); идек-151, который является приматизированным антителом против CD4 (IDЕС); идек-152, который является приматизированным антителом против CD23 (IDEC®/Seikagaku®); смарт анти-CD3, который является гуманизированным антителом IgG против CD3 (Protein Design Lab®); 5G1.1, который является гуманизированным антителом против комплементарного фактора 5 (С5) (Alexion Pharm®); D2E7, который является гуманизированным антителом против TNF- (CAT®/BASF®); CDP870, который является гуманизированным Fab-фрагментом против TNF- (Celltech®); идек-151, который является приматизированным антителом IgGl против CD4 (IDЕС Pharm®/SmithKline Beecham®); MDX-CD4, который является антителом человека IgG против CD4 (Medarex®/Eisai®/Genmab®); CDP571, который является гуманизированным антителом IgG4 против TNF- (Celltech®); LDP-02, который является гуманизированным антителом против 4 7 (LeukoSite®/Genentech®); ортоклон OKT4A, который является гуманизированным антителом IgG против CD4 (Ortho Biotech®); антова , который является гуманизированным антителом IgG против CD40L (Biogen®); антегрен , который является гуманизированным антителом IgG против VLA-4 (Elan®); MDX-33, который является антителом (Fc R) человека против CD64 (Medarex®/Centeon®); SCH55700, который является гуманизированным антителом IgG4 против IL-5 (Celltech®/Schering®); SB-240563 и SB-240683, которые являются гуманизированными антителами против IL-5 и IL-4 соответственно (SmithKline Beecham®); rhuMab-E25, который является гуманизированным антителом IgGl против IgE (Genentech®/Norvartis®/Tanox Biosystems®); ABX-CBL, который является мышиным антителом IgM против CD-147 (Abgenix®); BTI-322, который является крысиным антителом IgG против CD2 (Medimmune®/Bio Transplant®); ортоклон/ОКТЗ, который является мышиным антителом IgG2a против CD3 (ortho Biotech®); симулект , который является химерным антителом IgGl против CD25 (Novartis Pharm®); LDP-01, который является гуманизированным антителом IgG против ₂-интегрина (LeukoSite); анти-LFA-1, который является мышиным F(ab')₂ против CD18 (Pasteur-Merieux®/Immunotech®); CAT-152, который является антителом человека против TGF- ₂ (Cambridge Ab Tech®), и корсевин M, который является химерным антителом против фактора VII (Centocor®). Перечисленные выше иммунореактивные реагенты, а также любые другие иммунореактивные реагенты могут быть введены в соответствии с любой схемой приема лекарственного средства, известной специалистам в данной области, в том числе схемами, рекомендованными лицами, прописывающими иммунореактивные реагенты.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело или другой иммунореактивный реагент, может быть получена из любой информации, доступной специалисту в данной области (т.е. из Genbank, литературы или обычным клонированием). Если клон, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей определенное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, или другой иммунореактивный реагент, является недоступным, но последовательность молекулы антитела или его эпитопсвязывающего фрагмента или другого иммунореактивного реагента является известной, нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуноглобулин или другой иммунореактивный реагент, можно химически синтезировать или получить из подходящего источника (например, библиотеки кДНК антител или библиотеки кДНК, генерированной из любой ткани или клеток, экспрессирующих антитело, таких как гибридомные клетки, выбранные для экспрессии антитела, или нуклеиновой кислоты, предпочтительно поли-А⁺-РНК, выделенной из любой ткани или клеток, экспрессирующих антитело, таких как гибридомные клетки, выбранные для экспрессии антитела) при помощи ПЦР-амплификации с использованием синтетических праймеров, гибридизируемых с 3'- и 5'-концами этой последовательности или посредством клонирования с использованием олигонуклеотидного зонда, специфического для последовательности конкретного гена, для идентификации, например, клона кДНК из библиотеки кДНК, который кодирует это антитело. Затем амплифицированные нуклеиновые кислоты, генерированные при помощи ПЦР, могут быть клонированы в реплицируемые клонирующие векторы с использованием любого способа, хорошо известного в данной области. В случае иммунореактивных реагентов, которые не существуют в природе, нуклеиновые кислоты, кодирующие разные районы иммунореактивного реагента, могут быть получены из уже существующих библиотек или известных генов или могут быть синтезированы.

После определения нуклеотидной последовательности антитела или другого иммунореактивного реагента манипулирование с нуклеотидной последовательностью антитела или другого иммунореактивного реагента может быть осуществлено с использованием способов, хорошо известных в данной области для манипулирования с нуклеотидными последовательностями, например способов рекомбинантных ДНК, сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и т.д. (см., например, способы, описанные в публикациях Sambrook et al., 1990, Moleсular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; и Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, обе из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей их полноте), для генерирования антител или другого иммунореактивного реагента, имеющего другую аминокислотную последовательность, например, введением аминокислотных замен, делеций и/или инсерций в области эпитопсвязывающего домена антител или другого иммунореактивного реагента или в константные (Fc) области антител или другого иммунореактивного реагента, которые принимают участие во взаимодействии с иммунными эффекторными клетками.

Для рекомбинантной экспрессии антитела или другого иммунореактивного реагента требуется конструкция экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело или другой иммунореактивный реагент. После того как получена нуклеотидная последовательность, кодирующая молекулу антитела или тяжелую или легкую цепь антитела или ее часть (предпочтительно, но не обязательно, содержащую вариабельную область тяжелой или легкой цепи), или другой иммунореактивный реагент, вектор для продуцирования молекулы антитела или другого иммунореактивного реагента можно получить технологией рекомбинантной ДНК с использованием способов, хорошо известных в данной области. Так, здесь описываются способы получения белка путем экспрессии полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или другой иммунореактивный реагент. Для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие антитело или другой иммунореактивный реагент и подходящие сигналы регуляции транскрипции и трансляции, могут быть использованы способы, которые хорошо известны специалисту в данной области. Эти способы включают, например, способы рекомбинантных ДНК in vitro, синтетические способы и генетическую рекомбинацию in vivo. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную или константную область тяжелой цепи, вариабельную или константную область легкой цепи, вариабельные области как тяжелой цепи, так и легкой цепи, эпитопсвязывающий фрагмент вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи или одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) антитела или другого иммунореактивного реагента, могут быть клонированы в такой вектор для экспрессии. Экспрессирующий вектор переносят в клетку-хозяина общепринятыми способами и трансфицированные клетки затем культивируют общепринятыми способами.

Для экспрессии молекул антитела или другого иммунореактивного реагента настоящего изобретения могут быть использованы различные системы хозяин-экспрессирующий вектор. Такие системы хозяин-экспрессирующий вектор представляют собой носители, посредством которых могут быть получены и затем очищены представляющие интерес кодирующие последовательности, но представляют собой также клетки, которые могут при трансформации или трансфицировании подходящими нуклеотидными кодирующими последовательностями экспрессировать молекулу антитела или другого иммунореактивного реагента настоящего изобретения in situ. Они включают, но не ограничиваются перечисленным, микроорганизмы, такие как бактерии (например, E. сoli и B. subtilis), трансформированные рекомбинантными экспрессирующими векторами ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими последовательности, кодирующие антитело или другой иммунореактивный реагент; дрожжи (например, Saccharomyces и Pichia), трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессирующими векторами, содержащими последовательности, кодирующие антитело или другой иммунореактивный реагент; системы клеток насекомых, инфицированные рекомбинантными экспрессирующими векторами вируса (например, бакуловируса), содержащими последовательности, кодирующие антитело или другой иммунореактивный реагент; системы клеток растений, инфицированные рекомбинантными экспрессирующими векторами вируса (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV; и вирусом мозаики табака, TMV) или трансформированные рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, плазмиды Ti), содержащими последовательности, кодирующие антитело или другой иммунореактивный реагент; и системы клеток млекопитающих (например, клеток COS, CНО, BHK, 293, 3T3 и NSO), несущие рекомбинантные экспрессионные конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающего (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор 7,5К вируса коровьей оспы). Для экспрессии молекулы рекомбинантного антитела или другого иммунореактивного реагента предпочтительно используют бактериальные клетки, такие как Escherichia coli, более предпочтительно эукариотные клетки, особенно для экспрессии целой молекулы рекомбинантного антитела или другого иммунореактивного реагента. Например, клетки млекопитающего, такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО), в сочетании с вектором, таким как элемент активатора основного промежуточного раннего гена из цитомегаловируса человека, является системой эффективной экспрессии для антител (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101 and Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).

В бактериальной системе ряд экспрессирующих векторов может быть преимущественно выбран в зависимости от предполагаемого применения экспрессируемой молекулы антитела или другого иммунореактивного реагента. Например, когда должно быть получено большое количество такого белка для получения фармацевтических композиций молекулы антитела, могут быть нужны векторы, которые направлены на экспрессию высоких уровней продуктов в виде слитого белка, которые легко очищаются. Такие векторы включают, но не ограничиваются перечисленным, экспрессирующий вектор pUR278 E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), в котором последовательность, кодирующая молекулу антитела или другого иммунореактивного реагента, может быть лигирована индивидуально в вектор в рамке с lacZ-кодирующей областью, так что продуцируется слитый белок, и векторы pIN (Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 and Van Heeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509).

В системе насекомого в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов используют вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Последовательность, кодирующая антитело или другой иммунореактивный реагент, можно клонировать индивидуально в несущественные области (например, полиэдриновый ген) вируса и поместить под контроль промотора AcNPV (например, полиэдринового промотора).

В клетках-хозяевах млекопитающего может быть использован ряд систем экспрессии на вирусной основе для экспрессии молекулы антитела или другого иммунореактивного реагента настоящего изобретения. В случаях, когда в качестве вектора экспрессии используют аденовирус, представляющая интерес последовательность, кодирующая антитело или другой иммунореактивный реагент, может быть лигирована с аденовирусным регуляторным комплексом транскрипции/трансляции, например, поздним промотором и состоящей из трех частей лидерной последовательностью. Этот химерный ген можно затем вставить в геном аденовируса рекомбинацией in vitro или in vivo. Вставка в несущественной области вирусного генома (например, области El или Е3) может привести к образованию рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способен экспрессировать молекулу антитела или другого иммунореактивного реагента в инфицированных хозяевах (например, см. Logan and Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359). Для эффективной трансляции вставленных последовательностей, кодирующих антитело или другой иммунореактивный реагент, могут также быть нужны специфические сигналы инициации. Эти сигналы включают кодон инициации ATG и соседние последовательности. Кроме того, кодон инициации должен быть в фазе с рамкой считывания нужной кодирующей последовательности для гарантии трансляции целой вставки. Эти экзогенные регуляторные сигналы трансляции и кодоны инициации могут иметь различное происхождение, как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии может быть повышена включением подходящих элементов энхансера транскрипции, терминаторов транскрипции и т.д. (см., например, Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).

Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, который модулирует экспрессию последовательностей антитела или другого иммунореактивного реагента или модифицирует и процессирует антитело или другой иммунореактивный реагент нужным специфическим образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными для функции антитела или другого иммунореактивного реагента. Разные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Для обеспечения правильной модификации и процессинга экспрессированного антитела или другого иммунореактивного реагента могут быть выбраны подходящие клеточные линии или системы-хозяева. С этой целью могут быть использованы эукариотные клетки-хозяева, которые обладают клеточным механизмом для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающего включают, но не ограничиваются перечисленным, СНО, VERY, BНK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138 и особенно миеломные клетки, такие как клетки NS0 и относящиеся к ним клеточные линии, см., например, Morrison et al., патент США № 5807715, который включен, таким образом, в качестве ссылки во всей его полноте.

Для продолжительного продуцирования с высоким выходом рекомбинантных антител или другого иммунореактивного реагента предпочтительной является стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела или другие иммунореактивные реагенты, могут быть получены генной инженерией.

Вместо того чтобы использовать экспрессирующие векторы, которые содержат начало репликации вирусного происхождения, клетки-хозяева могут быть трансформированы ДНК, контролируемой подходящими элементами регуляции экспрессии (например, промотором, энхансером, последовательностями, терминаторами транскрипции, сайтами полиаденилирования и т.д.) и контролируемым маркером. После введения чужеродной ДНК полученным генной инженерией клеткам может быть предоставлена возможность роста в течение 1-2 дней в обогащенной среде с последующим ростом в выбранной среде. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к селекции и позволяет клеткам стабильно интегировать плазмиду в их хромосомы и расти с образованием фокуса, который, в свою очередь, может быть клонирован и размножен в клеточные линии. Этот способ может быть благоприятным образом использован для полученных генной инженерией клеточных линий, которые экспрессируют молекулу антитела или другой иммунореактивный реагент. Такие полученные генной инженерией клеточные линии могут быть особенно применимыми при скрининге и оценке композиций, которые взаимодействуют непосредственно или косвенно с молекулой антитела или другим иммунореактивным реагентом.

Может быть использован ряд систем селекции, включающий, но не ограничивающийся перечисленным, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (Szybalska and Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al, 1980, Cell 22:8-17), которые могут быть использованы в клетках tk^-, hgprt^- или aort^- соответственно. Кроме того, резистентность к антиметаболиту может быть использована на основе селекции для следующих генов: dhfr, который придает резистентность к метотрексату (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357, and O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, который придает резистентность к микофеноловой кислоте (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, который придает резистентность к аминогликозиду G-418 (Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; and May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215); и hygro, который придает резистентность к гигромицину (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Способы, обычно известные в области технологии рекомбинантных ДНК, можно обычным способом применять для отбора нужного рекомбинантного клона, и такие способы описаны, например, в публикациях Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al (eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wilew and Sons, NY; and Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1, которые включены в данное описание в качестве ссылки во всей их полноте.

Уровни экспрессии молекулы антитела или другого иммунореактивного реагента могут быть повышены амплификацией вектора (для обзора см. Bebbington and Hentschel, 1987, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNА cloning, Vol. 3. Academic Press, New York). Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело или другой иммунореактивный реагент, является амплифицируемым, повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клетки-хозяина, будет повышать число копий маркерного гена. Поскольку амплифицированная область связана с геном антитела или другого иммунореактивного реагента, продуцирование антитела или другого иммунореактивного реагента также будет повышаться (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

Клетка-хозяин может быть котрансфицирована двумя экспрессирующими векторами настоящего изобретения, первым вектором, кодирующим полипептид, полученный из тяжелой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид, полученный из легкой цепи. Два вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, которые способны к равной экспрессии полипептидов тяжелой и легкой цепей, или разные селектируемые маркеры для гарантии поддержания обеих плазмид. В альтернативном варианте может быть использован один вектор, который кодирует и способен экспрессировать полипептиды тяжелой и легкой цепей. В таких случаях легкая цепь должна быть размещена перед тяжелой цепью, чтобы избежать избытка токсичной свободной тяжелой цепи (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; and Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). Кодирующие последовательности для тяжелой и легкой цепей могут содержать кДНК или геномную ДНК.

После того как молекула антитела или другого иммунореактивного реагента настоящего изобретения получена рекомбинантной экспрессией, ее можно очистить любым способом, известным в области очистки молекулы иммуноглобулина или другого иммунореактивного реагента, например хроматографией (например, ионообменной, аффинной, особенно аффинной хроматографией для специфического антигена после очистки белка А и колоночной хроматографией для разделения по размеру молекул), центрифугированием, на основе различной растворимости или любыми другими стандартными способами для очистки белков. Кроме того, антитела или другие иммунореактивные реагенты настоящего изобретения или их фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными здесь или же известными в данной области, для облегчения очистки.

Настоящее изобретение включает также использование антител или их фрагментов, рекомбинатным способом слитых или химически конъюгированных (включая как ковалентную, так и нековалентную конъюгацию) с гетерологичным полипептидом (или его частью, предпочтительно с полипептидом, содержащим, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 40, по меньшей мере, 50, по меньшей мере, 60, по меньшей мере, 70, по меньшей мере, 80, по меньшей мере, 90 или, по меньшей мере, 100 аминокислот) для генерации слитых белков. Слияние не обязательно необходимо проводить непосредственно, его можно проводить через линкерные последовательности. Например, антитела могут быть использованы для «нацеливания» гетерологичных полипептидов на определенные типы клеток, либо in vitro, либо in vivo, слиянием или конъюгацией антител с антителами, специфичными для определенных рецепторов клеточной поверхности. Антитела, слитые или конъюгированные с гетерологичными полипептидами, могут быть также использованы в иммунологических анализах in vitro и способах очистки с использованием способов, известных в данной области. См., например, публикацию РСТ WO 93/21232; ЕР 439095; Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99 (1994); патент США 5474981; Gillies et al., PNAS 89:1428-1432 (1992); and Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452 (1991), причем все указанные публикации и патенты включены в качестве ссылки во всей их полноте.

Настоящее изобретение далее включает композиции, содержащие гетерологичные полипептиды, слитые или конъюгированные с фрагментами антитела. Например, гетерологичные полипептиды могут быть слиты или конъюгированы с фрагментом Fab, фрагментом Fc, фрагментом Fv, фрагментом F(ab)₂ или его частью. Способы слияния или конъюгации полипептидов с частями антитела известны в данной области. См., например, патенты США № № 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851 и 5112946; ЕР 307434; ЕР 367166; публикацию РСТ WO 96/043388 и WO 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acаd. Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Zheng et al., J. Immunol. 154: 5590-5600 (1995) and Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341 (1992) (указанные публикации и патенты включены в качестве ссылки во всей их полноте).

Настоящее изобретение далее включает использования антител или их фрагментов, конъюгированных с терапевтическим агентом.

Антитело или его фрагмент может быть конъюгирован с терапевтической частью, такой как цитотоксин, например цитостатический или цитоцидный агент, терапевтический агент или ион радиоактивного металла, например, альфа-излучателями. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является вредным для клеток. Примеры его включают паклитаксел, цитохалазин В, грамицидин D, этидий бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты включают, но не ограничиваются перечисленным, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурафил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлоретамин, тиоепа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BCNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусулфан, дибромоманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цисдихлордиаминплатин(II) (DDP)цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее называемый дауномицином) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее называемый актиномицином), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин).

Кроме того, антитело или его фрагмент может быть конъюгирован с частью терапевтического агента или лекарственного средства, которая модифицирует данную биологическую реакцию. Части терапевтических агентов или лекарственных средств не должны истолковываться как ограниченные классическими химическими терапевтическими агентами. Например, частью лекарственного средства может быть белок или полипептид, обладающий нужной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, такой как абрин, рицин А, экзотоксин Рseudomonas, токсин холеры, дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли, -интерферон, -интерферон, фактор роста нервов, фактор роста, полученный из тромбоцитов, активатор тканевого плазминогена, апоптотические агенты, например TNF- , TNF- , AIM I (см. Публикацию международной патентной заявки WO97/33899), AIM II (см. Публикацию международной патентной заявки WO 97/34911), лиганд Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574) и VEGI (см. Публикацию международной патентной заявки WO 99/23105), тромботический агент или антиангиогенный агент, например ангиостатин или эндостатин, или модификатор биологической реакции, такой как, например, лимфокин (например, интерлейкин-1 ( IL-1 ), интерлейкин-2 ( IL-2 ), интерлейкин-6 ( IL-6 ), фактор, стимулирующий гранулоцитарно-макрофагальные колонии ( GM-CSF ), и фактор, стимулирующий гранулоцитарные колонии ( G-CSF )), или фактор роста (например, гормон роста ( GH )).

Кроме того, антитело может быть конъюгировано с терапевтическими частями, такими как ион радиоактивного металла, такими как альфа-излучатели, такими как ²¹³Bi или макроциклические хелатообразователи, применимые для конъюгирования с полипептидами ионов радиоактивных металлов, включающих, но не ограничивающихся перечисленным, ¹³¹In, ¹³¹ Lu, ¹³¹Y, ¹³¹Ho, ¹³¹Sm. В некоторых вариантах осуществления макроциклическим хелатообразователем является 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусная кислота (DOTA), которая может быть присоединена к антителу через линкерную молекулу. Такие линкерные молекулы являются обычно известными в данной области и описаны в публикациях Denardo et al., 1998, Clin. Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; and Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50, каждая из которых включена в качестве ссылки во всей ее полноте.

Способы конъюгации терапевтических частей с антителами являются хорошо известными, см., например, Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al (eds.), pp. 243-56 (Alan R, Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd ed.), Robinson et al (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al, 1982, Immimol Rev. 62:119-58.

В альтернативном варианте антитело может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата антитела, как описано Segal в патенте США № 4676980, который включен в данное описание в качестве ссылки во всей его полноте.

4.9 Терапевтическое/профилактическое использование

Определение иммуногенности иммунореактивных агентов после лечения HSP

В необязательной процедуре индуцирование или усиление иммуногенности иммунореактивного реагента, который используют с препаратом HSP настоящего изобретения, может быть анализировано с использованием различных способов, хорошо известных в данной области и приведенных в качестве примеров в разделе 5.

В других способах для идентификации антигенспецифических Т-клеток может быть использован анализ «окрашивание тетрамера» (Altman et al., 1996, Science 274:94-96). Например, в одном варианте осуществления молекулу МНС, содержащую специфический пептидный антиген, такой как специфический для опухоли антиген, мультимеризуют для получения растворимых пептидных тетрамеров и метят, например, комплексообразованием со стрептавидином. Комплекс МНС-пептидный антиген затем смешивают с популяцией Т-клеток, полученных из организма пациента, которого лечили иммунореактивным реагентом и препаратом HSP. Затем используют биотин для окрашивания Т-клеток, которые экспрессируют представляющий интерес специфичный для опухоли антиген.

Кроме того, с использованием анализа смешанной лимфоцитной культуры-мишени цитотоксичность Т-клеток может быть испытана 4-часовым анализом с ⁵¹Cr-высвобождением (см. Palladino et al., 1987, Cancer Res. 47:5074-5079). В этом анализе смешанную лимфоцитную культуру добавляют к суспензии клеток-мишеней с получением различных отношений эффектор:мишень (Е:Т) (обычно 1:1 - 40:1). Клетки-мишени предварительно метят инкубированием 1×10⁶ клеток-мишеней в культуральной среде, содержащей 500 мкКи ⁵¹Cr на мл, в течение одного часа при 37°С. Клетки промывают три раза после мечения. Каждую точку анализа (отношение Е:Т) получают в трех повторностях и подходящие контроли включают для измерения спонтанного высвобождения ⁵¹Cr (для анализа не добавляют лимфоциты) и 100% высвобождения (клетки лизируют детергентом). После инкубации смесей клеток в течение 4 часов клетки осаждают в пробирке центрифугированием при 200 × g в течение 5 минут. Количество ⁵¹Cr, высвобожденного в супернатант, измеряют гамма-счетчиком. Процент цитотоксичности измеряют как число импульсов в минуту в испытуемом образце минус спонтанно высвобожденное число импульсов в минуту, деленное на общее число импульсов в минуту после обработки детергентом минус спонтанно высвобожденное число импульсов в минуту. Для блокирования каскада МНС класса I сконцентрированный супернатант гибридомы, полученный из клеток гибридомы К-44 (анти-МНС-гибридомы класса I), добавляют к испытуемым образцам до конечной концентрации 12,5%.

В альтернативном случае анализ ELISPOT может быть использован для измерения высвобождения цитокина in vitro цитотоксическими Т-клетками после стимуляции иммунореактивным реагентом и препаратом HSP. Высвобождение цитокина определяют посредством антител, которые являются специфическими для конкретного цитокина, такого как интерлейкин-2, фактор некроза опухоли или интерферон- (см., например, Scheibenbogen et al., 1997, Int. J. Cancer 71:932-936). Анализ проводят в титровальных микропланшетах, которые были предварительно покрыты антителами, специфическими для представляющего интерес цитокина, которые захватывают цитокин, секретированный Т-клетками. После инкубации Т-клеток в течение 24-48 часов в покрытых лунках цитотоксические Т-клетки удаляют и заменяют вторым меченым антителом, которое распознает другой эпитоп на цитокине. После экстенсивного промывания продукта для удаления несвязанного антитела к планшету добавляют ферментный субстрат, который образует окрашенный продукт реакции. Число продуцирующих цитокин клеток подсчитывают под микроскопом. Данный способ имеет преимущества в коротком времени анализа и чувствительности без необходимости большого числа цитотоксических Т-клеток.

4.10 Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение предлагает также фармацевтические композиции. Такие профилактически или терапевтически эффективные композиции содержат иммунореактивный реагент и HSP и фармацевтически приемлемый носитель. В определенном варианте осуществления термин «фармацевтически приемлемый» означает термин, одобренный Regulatory agence федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или других обычно признанных фармакопеях для использования при лечении животных и, более конкретно, людей. Термин «носитель» относится к разбавителю, наполнителю или носителю, с которым вводят терапевтическое средство. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода является предпочтительным носителем, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В качестве жидких носителей, особенно для инъецируемых растворов, могут быть также использованы физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, мальт, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, высушенное снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиции, если нужно, могут содержать также небольшие количества смачивающих или эмульгирующих агентов или буферных агентов для установления рН. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов с продолжительным высвобождением и тому подобное. Пероральный препарат может включать стандартные носители, такие как фармацевтического сорта маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натриевая соль сахарина, целлюлоза, карбонат магния и тому подобное. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin. Такие композиции будут содержать профилактически или терапевтически эффективное количество иммунореактивного реагента и HSP предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя, чтобы обеспечить форму для подходящего введения пациенту. Препарат должен соответствовать способу введения.

Иммунореактивные реагенты и HSP данного изобретения могут также быть преимущественно использованы в комбинации с одним или несколькими лекарственными средствами, используемыми для лечения заболевания, нарушения или инфекции, такими как, например, антираковые агенты, противовоспалительные агенты или антибактериальные/грибковые или антивирусные агенты. Примеры противораковых агентов включают, но не ограничиваются перечисленным, цисплатин, карбоплатин, циклофосфамид, доксорубицин, этопозид, ифосфамид, паклитаксел, таксаны, СРТ-11, топотекан, гемцитабин, онковин, винорелбин, оксалиплатин, 5-фторурацил (5-FU), лейковорин, левамизол, BCNU, винорелбин, темодар, винкристин и таксол.

Различные системы доставки являются известными и могут быть использованы для введения терапевтических и профилактических агентов, охватываемых настоящим изобретением, т.е. иммунореактивных реагентов и HSP, например капсулирование в липосомах, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать иммунореактивный реагент, препарат HSP, антитело или фрагмент антитела, рецепторопосредованный эндоцитоз (см., например, Wu and Wu, 1997, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструкция нуклеиновой кислоты как часть ретровирусного или другого вектора и тому подобное. Способы введения иммунореактивного реагента или препарата HSP или фармацевтических композиций, содержащих то же самое, включают, но не ограничиваются перечисленным, парентеральное введение (например, интрадермальное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и через слизистую оболочку (например, интраназальные и пероральные пути). В определенном варианте осуществления иммунореактивные реагенты, например антитела, вводят внутримышечным, внутривенным или подкожным путем. Введение может быть системным или локальным. Кроме того, может быть также использовано легочное введение, например, посредством использования ингалятора или распылителя и препарата с аэрозолизирующим агентом. См., например, патенты США № № 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540 и 4880078 и публикации РСТ WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346 и WO 99/66903, причем каждый патент и публикация включена в данное описание в качестве ссылки во всей ее полноте. В одном варианте осуществления терапевтический или профилактический агент вводят с использованием технологии доставки легочного лекарственного средства Alkermes AIR^TM (Alkermes, Inc., Cambridge, MA).

Растворимость и место введения являются факторами, которые должны быть рассмотрены при выборе пути введения. Способ введения может изменяться и включает, но не ограничивается перечисленным, подкожный, внутривенный, внутрибрюшинный, внутримышечный, внутрикожный пути или путь через слизистую оболочку. Пути введения через слизистую оболочку могут далее включать форму перорального, ректального и назального введения. С учетом вышеуказанных факторов предпочтительным является введение первого терапевтического или профилактического агента в место, которое является тем же самым или проксимальным к месту введения второго агента. В способе лечения опухоли препарат HSP вводят поблизости от места опухоли, наиболее предпочтительно внутрь опухоли инъекцией.

В одном варианте осуществления препараты HSP и иммунореактивные реагенты вводят с использованием любого нужного пути введения. Преимущества внутрикожного введения включают использование более низких доз и быструю абсорбцию соответственно. Преимущества подкожного или внутримышечного введения включают пригодность его для некоторых нерастворимых суспензий или масляных суспензий соответственно. Пути введения через слизистую оболочку включают, но не ограничиваются перечисленным, пероральное, ректальное и назальное введение. Препараты для введения через слизистую оболочку являются подходящими в различных готовых формах, как описано ниже.

В другом варианте осуществления терапевтические или профилактические агенты настоящего изобретения вводят внутримышечным, внутривенным или подкожным путем. Композиции могут быть введены любым подходящим путем, например инфузией или инъекций болюса, абсорбцией через эпителиальные или кожно-слизистые выстилки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и тому подобное), и могут быть введены вместе с другими биологически активными агентами.

В определенном варианте осуществления может быть желательно ввести фармацевтические композиции настоящего изобретения локально в участок, нуждающийся в лечении или предотвращении заболевания. В одном варианте осуществления лечение или профилактика может быть достигнута, например, но не посредством ограничения пути, локальной инфузией, инъекцией или при помощи имплантата, причем указанный имплантат является пористым, непористым или желатиновым материалом, включающим мембраны, такие как сиаластичные мембраны, или волокна. Предпочтительным является использование материалов, на которых агент не абсорбируется.

В другом варианте осуществления композиция может быть доставлена в везикуле, особенно липосоме (см. Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in Thepapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; см. в целом ibid.).

Еще в одном варианте осуществления композиция может быть доставлена в системе с регулируемым высвобождением или длительным высвобождением. Любой способ, известный специалисту в данной области, может быть использован для получения препаратов с продолжительным высвобождением, содержащих одно или несколько антител или один или несколько слитых белков. См., например, патент США № 4526938; публикацию РСТ WO 91/05548; публикацию РСТ WO 96/20698; Ning et al, 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel, "Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song et al, 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al, 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l Symp. Control Rel. Bioact Mater. 24:759-760, 1997, причем каждая из публикаций включена в данное описание в качестве ссылки во всей ее полноте. В одном варианте осуществления в системе регулируемого высвобождения может быть использован насос (см. Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; and Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). В другом варианте осуществления для достижения регулируемого высвобождения иммунореактивных реагентов или препаратов HSP могут быть использованы полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol Sci. Rev. Macromol Chem. 23:61; см. также Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 71:105); патент США № 5679377; патент США № 5916597; патент США № 5912015; патент США № 5989463; патент № 5128326; публикация PCT WO 99/15154 и публикация PCT WO 99/20253). Еще в одном варианте осуществления система регулируемого высвобождения может быть помещена около терапевтической мишени (например, легких), чтобы, таким образом, нужна была только часть системной дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

Другие системы с регулируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

В одном предпочтительном варианте осуществления препарат HSP вводят совместно с введением иммунореактивного реагента. Совместное введение препарата HSP и иммунореактивного реагента означает, что HSP или комплекс HSP-пептид вводят совместно в виде смеси с иммунореактивным реагентом или вводят раздельно, но в достаточно близкое время, что и иммунореактивный реагент. Этот способ предусматривает, что два введения проводят в пределах диапазона времени от менее чем одна минута до приблизительно пяти минут или вплоть до приблизительно шестидесяти минут друг от друга, например, при одном и том же приходе доктора.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает способ введения препарата HSP, включающего, но не ограничивающегося перечисленным, hsp60, hsp70, hsp90, hsp110, gp96, grp170 или калретикулин, по отдельности или в комбинации друг с другом, субъекту совместно с введением иммунореактивного реагента в то же самое место или в непосредственной близости от этого места.

Если рассматриваемый терапевтический или профилактический агент является водорастворимым, то он может быть приготовлен в подходящем буфере, например забуференном фосфатом физиологическом растворе или других физиологически совместимых растворах, предпочтительно стерильных. В альтернативном варианте если образовавшийся комплекс имеет низкую растворимость в водных растворах, то его можно изготовить с неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как твин или полиэтиленгликоль. Таким образом, соединения и их физиологически приемлемые сольваты могут быть изготовлены для ингаляции или инсуффляции (либо через полость рта или нос) или перорального, трансбуккального, парентерального или ректального введения, или, в случае опухолей, их непосредственно инъецируют в солидную опухоль.

Для перорального введения фармацевтический препарат может быть в жидкой форме, например в форме растворов, сиропов или суспензий, или может быть представлен в виде лекарственного продукта для пересоздания водой или другим подходящим наполнителем перед использованием. Такой жидкий препарат может быть получен общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сироп сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгирующие агенты (например, лецитин или аравийская камедь); неводные наполнители (например, миндальное масло, маслянистые сложные эфиры или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Фармацевтический препарат может быть в форме, например, таблеток или капсул, полученных общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как связующие агенты (например, предварительно клейстеризованный маисовый крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); дезинтеграторы (например, картофельный крахмал или натриевая соль гликолята крахмала) или смачивающие агенты (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты способами, хорошо известными в данной области.

Композиция для перорального введения может быть подходящим образом изготовлена для обеспечения регулируемого высвобождения активного соединения.

Для трансбуккального введения композиция может быть в форме таблеток или лепешек, изготовленных общепринятым способом.

Агенты могут быть изготовлены для парентерального введения инъекцией, например инъекцией болюса или непрерывной инфузией. Препараты для инъекции могут быть представлены в единичной дозированной форме, например в ампулах или контейнерах для многих доз, с добавленным консервантом. Препараты могут быть в таких формах, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных наполнителях, и могут содержать образующие форму агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В альтернативном варианте активный ингредиент может быть в форме порошка для составления препарата с подходящим наполнителем, например стерильной, апирогенной водой, перед использованием.

Композиции могут быть также изготовлены в виде ректального препарата, такого как суппозиторий или удерживающая клизма, например, содержащего общепринятые для суппозитория основы, такие как какао-масло или другие глицериды.

Кроме препаратов, описанных ранее, агенты настоящего изобретения могут быть также изготовлены в виде препарата-депо. Такие препараты длительного действия могут быть введены имплантацией (например, подкожной или внутримышечной) или внутримышечной инъекцией. Так, например, препарат может быть изготовлен с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами или в виде слаборастворимых производных, например в виде слаборастворимой соли. Липосомы и эмульсии являются хорошо известными примерами наполнителей или носителей для доставки гидрофильных лекарственных средств.

Для введения ингаляцией препараты для использования в соответствии с настоящим изобретением пригодным образом доставляют в форме аэрозольного спрея для находящихся под давлением упаковок или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае находящегося под давлением аэрозоля единичная доза может быть обеспечена клапаном для доставки измеренного количества. Могут быть изготовлены капсулы и картриджи, например желатиновые, для использования в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошкообразную смесь соединения и подходящей порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

Готовые препаративные формы фармацевтических композиций, содержащих HSP, и процедуры для их изготовления можно найти в литературе и в патентах США, включенных в качестве ссылки в данный документ.

Изобретение также предусматривает, что иммунореактивный реагент, например антитело, или препарат HSP упакован в герметично изолированный контейнер, такой как ампула или саше, на котором указано количество иммунореактивного реагента. В одном варианте осуществления иммунореактивный реагент и HSP поставляют вместе или раздельно в виде сухих стерилизованных лиофилизованных порошков или концентратов без воды в одном или нескольких герметично изолированных контейнерах, они могут быть пересозданы, например, водой или солевым раствором до подходящей концентрации для введения субъекту. Эффективная доза каждого иммунореактивного реагента может быть сначала оценена из данных анализа in vitro. Она зависит также от природы антигена-мишени, плотности антигена в опухолях, типа опухоли, способа введения, который может быть оптимизирован специалистом в данной области без излишнего экспериментирования. Обычные эффективные дозы для инъекции составляют приблизительно от 0,1 до 5 мг/кг/день, предпочтительно приблизительно от 1 до 4 мг/кг/день и более предпочтительно до 2 до 4 мг/кг/неделю. Иммунореактивный реагент предпочтительно поставляют в виде сухого стерильного лиофилизованного порошка в герметично изолированном контейнере при единичной дозе, по меньшей мере, 5 мг, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 мг, по меньшей мере, 15 мг, по меньшей мере, 25 мг, по меньшей мере, 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере, 50 мг или, по меньшей мере, 75 мг.

В определенном варианте осуществления иммунореактивные реагенты, вводимые животному, имеют происхождение вида или реактивность вида, который является таким же видом, как вид животного. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления антитела человека или гуманизированные антитела вводят пациенту-человеку для терапии или профилактики.

В зависимости от пути введения и типа HSP в препарате HSP количество HSP в препарате HSP может составлять, например, от 0,1 до 1000 мкг на введение. Предпочтительные количества gp96 или hsp70 находятся в диапазоне от 10 до 600 мкг на введение и 0,1-50 мкг, предпочтительно 10-25 мкг, если препарат HSP вводят внутрикожно. Для hsp90 предпочтительные количества составляют приблизительно 50-1000 мкг на введение и приблизительно 5-50 мкг для внутрикожного введения.

В других вариантах осуществления белком теплового шока является hsp60, hsp70, hsp90, gp96 или калретикулин. Доза вводимого препарата HSP зависит в большей степени от состояния и размера подвергаемого лечению пациента, а также количества вводимого иммунореактивного реагента, частоты лечения и пути введения. Режимы непрерывной терапии, включающие место, дозу и частоту введения, могут определяться начальной реакцией и клинической оценкой.

Оптимальное количество определенного HSP для использования с определенной композицией изобретения может варьировать. Оптимизация определенного количества HSP для данной композиции является такой, как демонстрируется процитированными выше примерами, вполне в пределах компетенции специалиста в данной области.

Вследствие введения препарата HSP меньшее количество иммунореактивного реагента может требоваться для индукции иммунной реакции у субъекта. Количество иммунореактивного реагента, который используют с препаратом HSP, включая количества в субоптимальном диапазоне, может быть определено доза-зависимыми экспериментами, проводимыми на животных моделях способами, известными в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления белком теплового шока является hsp70. Количество hsp70 в фармацевтических композициях предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 600 мкг на введение и 0,1-50 мкг, предпочтительно 10-25 мкг, если препарат HSP вводят внутрикожно.

В особенно предпочтительном варианте осуществления белком теплового шока является gp96. Количество hsp96 в фармацевтических композициях предпочтительно находится диапазоне от 10 до 600 мкг на введение и 0,1-50 мкг, предпочтительно 10-25 мкг, если препарат HSP вводят внутрикожно.

В альтернативном варианте осуществления иммунореактивный реагент и HSP поставляют в жидкой форме в герметично упакованном контейнере, на котором указывается количество и концентрация HSP и иммунореактивного реагента. Жидкую форму иммунореактивного реагента предпочтительно поставляют в герметично упакованном контейнере, содержащем, по меньшей мере, 1 мг/мл, более предпочтительно по меньшей мере, 2,5 мг/мл, по меньшей мере, 5 мг/мл, по меньшей мере, 8 мг/мл, по меньшей мере, 10 мг/мл, по меньшей мере, 15 мг/мл или, по меньшей мере, 25 мг/мл. Жидкую форму HSP предпочтительно поставляют в герметично упакованном контейнере, содержащем, по меньшей мере, 0,1 мг/мл, более предпочтительно, по меньшей мере, 1,0 мг/мл, по меньшей мере, 5 мг/мл, по меньшей мере, 10 мг/мл, по меньшей мере, 25 мг/мл, по меньшей мере, 50 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл или, по меньшей мере, 250 мг/мл.

В предпочтительном варианте осуществления композицию изготовляют в соответствии с обычными процедурами в виде фармацевтической композиции, приспособленной для внутривенного введения людям. Композиции для внутривенного введения обычно являются растворами в стерильном изотоническом водном буфере. Когда необходимо, композиция может включать также солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции.

Ингредиенты композиций настоящего изобретения обычно поставляют в виде набора либо по отдельности, либо смешанными вместе в дозированной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизованного порошка или не содержащего воду концентрата в герметично упакованном контейнере, таком как ампула или саше, указывающем количество активного агента. Когда композиция должна быть введена инфузией, она может быть дозирована сосудом для инфузии, содержащим стерильную воду фармацевтической чистоты или физиологический раствор. Когда композицию вводят инъекцией, может быть обеспечена ампула стерильной воды для инъекции или физиологического раствора, так чтобы ингредиенты могли быть смешаны перед введением. В другом варианте осуществления набор настоящего изобретения дополнительно содержит иглу или шприц, предпочтительно упакованный в стерильной форме, для инъекции композиции, и/или упакованную спиртовую подушечку. Необязательно включают инструкции для введения композиций изобретения клиницистом или пациентом.

Композиции настоящего изобретения могут быть приготовлены в виде свободной формы или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные анионами, такими как анионы, образованные из хлористоводородной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот, и соли, образованные катионами, такими как катионы, полученные из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа(III), изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.

Количество композиции настоящего изобретения, которое может быть эффективным при лечении, профилактике или ослаблении одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, нарушением или инфекцией, может быть определено стандартными клиническими способами. Точная доза, которую нужно применять в препарате, будет зависеть от пути введения, возраста субъекта и тяжести заболевания, нарушения или инфекции и должна определяться в соответствии с мнением практикующего врача и всех обстоятельств, относящихся к пациенту. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых зависимости доза-реакция, полученных in vitro или на применяемой в качестве системы испытания модели-животного (например, хлопковом хомяке или яванской макаке). Модели и способы оценки действия HSP и антител или другие иммунореактивные реагенты являются известными в данной области (публикация Wooldridge et al., 1997, Blood 89(8):2994-2998, включенная в данное описание в качестве ссылки во всей ее полноте).

Для антител терапевтически или профилактически эффективная доза, вводимая субъекту, обычно составляет 0,1 - 200 мг/кг веса тела субъекта. Доза, вводимая субъекту, предпочтительно находится между 0,1 мг/кг и 20 мг/кг веса тела субъекта, и более предпочтительно доза, вводимая субъекту, находится между 1 мг/кг и 10 мг/кг веса тела субъекта. Доза будет, однако, зависеть от степени, до которой повысился период полувыведения молекулы из сыворотки. Антитела человека обычно имеют более продолжительный период полувыведения из организма человека, чем антитела из других видов вследствие иммунной реакции против чужеродных полипептидов. Таким образом, часто являются возможными более низкие дозы антител человека и менее частые их введения. Кроме того, доза и частота введения иммунореактивных реагентов могут быть также снижены посредством повышения поглощения и пенетрации ткани (например, в легкое) для иммунореактивных реагентов, таких как, например, липидатион. Информация об определенной дозе антитела может быть найдена также во вкладыше упаковки изготовителя для указанного антитела или Physician's Desk Reference (56^th el., 2002).

Лечение субъекта терапевтически или профилактически эффективным количеством иммунореактивного реагента и HSP может включать однократное лечение или, что предпочтительно, может включать серию лечений. В предпочтительном примере субъекта лечат иммунореактивным реагентом в диапазоне между приблизительно 0,1 и 30 мг/кг веса тела один раз в неделю в течение приблизительно 1-10 недель, предпочтительно 2-8 недель, более предпочтительно приблизительно 3-7 недель и еще более предпочтительно в течение приблизительно 4, 5 или 6 недель. Иммунореактивные реагенты и их дозы, пути введения и рекомендованное применение являются известными в данной области и были обсуждены в такой литературе, как Physician's Desk Reference (56^th ed., 2002). В предпочтительном примере субъекта лечат HSP в диапазоне между приблизительно от 0,1 до 1000 мг, более предпочтительно 1-500 мг, наиболее предпочтительно 2-250 мг один раз в неделю в течение приблизительно 1-10 недель, предпочтительно 2-8 недель, более предпочтительно приблизительно 3-7 недель и еще более предпочтительно в течение 4, 5 или 6 недель. Специалисту в данной области должна быть очевидна зависимость подходящей дозы HSP от состояния субъекта, подвергаемого лечению, вводимого иммунореактивного реагента, а также от субъекта.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции изобретения содержат HSP в комбинации с наполнителями. Белком теплового шока предпочтительно является hsp60, hsp70, hsp90, gp96 или калретикулин, и наполнители выбраны из неионогенных поверхностно-активных веществ, поливинилпирролидона, альбумина сыворотки человека и различных немодифицированных и дериватизированных циклодекстринов. Более предпочтительно в этих вариантах осуществления неионогенные поверхностно-активные вещества выбраны из полисорбата-20, полисорбата-40, полисорбата-60 и полисорбата-80. Поливинилпирролидоном может быть предпочтительно плаздон С15, поливинилпирролидон фармацевтического сорта. Предпочтительными циклодекстринами являются гидроксипропил- -циклодекстрин, гидроксипропил- -циклодекстрин и метил- -циклодекстрин. Циклодекстринами предпочтительно являются -циклодекстрины. Композиции настоящего изобретения предпочтительно содержат профилактически или терапевтически эффективное количество препарата HSP или иммунореактивного реагента и фармацевтически приемлемый носитель.

В определенном варианте осуществления термин «фармацевтически приемлемый» означает разрешенный Regulatory agency федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или других обычно признанных фармакопеях для использования при лечения животных и, более конкретно, при лечении людей. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному или неполному), наполнителю или носителю, с которым вводят терапевтическое средство. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Предпочтительным носителем является вода, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В качестве жидких носителей могут также быть использованы физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, особенно для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, мальт, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, высушенное снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное. При необходимости композиция может также содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих агентов или буферных агентов для регулирования рН. Эти композиции могут быть в форме растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов с длительным высвобождением и тому подобное.

Препарат может быть, если необходимо, представлен в упаковке или дозирующем устройстве, которое может содержать одну или несколько единичных дозированных форм, содержащих препарат HSP. Упаковка может представлять собой, например, металлическую фольгу или пластиковую пленку и может быть «пузырчатой» упаковкой. Упаковка или дозирующее устройство может сопровождаться инструкциями для введения.

Композиции настоящего изобретения могут быть введены животному, предпочтительно млекопитающему и наиболее предпочтительно человеку для лечения, профилактики или ослабления одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, нарушением или инфекцией. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция находится на наружной части тела. Установлено, что иммунореактивный реагент предпочтительно имеет некоторое терапевтическое преимущество в отсутствие белка теплового шока и распознает эпитоп на клетке или молекуле, связанной с причиной или симптомами заболевания, нарушения или инфекции.

Композиции содержат иммунореактивный реагент (т.е. антигенсвязывающий белок, содержащий антигенсвязывающую область и область, которая опосредует один или несколько антителозависимых иммунологических процессов, например Fc-рецептор-связывающую область) и HSP.

Каждая композиция настоящего изобретения должна содержать, по меньшей мере, один иммунореактивный реагент (как определено здесь, например, антитело) и HSP, и композиции настоящего изобретения могут также быть использованы в сочетании с другими формами терапии для определенного заболевания. Один или несколько иммунореактивных реагентов, которые иммуноспецифическим образом связываются с одним или несколькими антигенами-мишенями, могут быть использованы местно или системно в организме в качестве профилактического или терапевтического агента.

4.11 Наборы

Предложены также наборы для осуществления способов настоящего изобретения. В определенном варианте осуществления набор содержит первый контейнер, содержащий препарат белка теплового шока в количестве, эффективном для усиления иммунной реакции, вызванной иммунореактивным реагентом против мишени иммунореактивного реагента, против которой требуется иммунная реакция, и второй контейнер, содержащий иммунореактивный реагент в количестве, которое при введении до, одновременно или после введения препарата белка теплового шока первого контейнера, является эффективным в индукции иммунной реакции против мишени.

Предложены наборы настоящего изобретения, которые содержат в контейнере иммунореактивный реагент в количестве, эффективном для лечения или профилактики заболевания или нарушения, и в другом контейнере препарат белка теплового шока в количестве, эффективном для усиления или поддержания иммунной реакции, вызванной иммунореактивным реагентом. В варианте осуществления количество иммунореактивного реагента, присутствующего в контейнере, является субоптимальным для индукции иммунной реакции у субъекта при введении независимо от препарата белка теплового шока в другом контейнере. Набор может, необязательно, сопровождаться инструкциями.

Настоящее изобретение представляет также наборы, содержащие один или несколько контейнеров с одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций настоящего изобретения. К такому набору(ам) может необязательно прилагаться уведомление в форме, предписанной государственным учреждением, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, причем это уведомление отражает одобрение этим учреждением производства, применения и продажи композиций контейнера для введения человеку. В одном варианте осуществления наборы могут необязательно дополнительно содержать предварительно определенное количество иммунореактивного реагента (т.е. антигенсвязывающего белка, содержащего антигенсвязывающий район и район, который опосредует один или несколько антителозависимых иммунологических процессов, например Fc-рецепторсвязывающий район) и HSP. В предпочтительном варианте осуществления набор содержит иммунореактивный реагент и HSP в разных контейнерах.

5. ПРИМЕРЫ

5.1 Усиление опосредованного антителом лизиса in vitro

Мышиные спленоциты (эффекторные клетки) получают из селезенок подвергнутых обработке 6-8 недельных мышей. Эти эффекторые клетки инкубируют с подходящим количеством препарата HSP и подходящим количеством моноклонального антитела в течение 24-72 часов. В конце периода инкубации клетки-мишени (E.G7-OVA или М04;) нагружают ⁵¹Cr. Эффекторные клетки и меченые клетки-мишени инкубируют при определенных отношениях эффектор:мишень в присутствии или в отсутствие антитела против SIINFEKL/класс I МНС (1-10 мкг/мл) при 4°С в течение 30-60 минут. Лизис в присутствии HSP и антитела сравнивают с контролями без HSP, без антитела или без обоих.

5.2 Повышение защиты в модели, инокулированной опухолью

Мышей С57В1/6 инокулируют подкожным (SC) путем с боковой стороны опухолью М04 (1×10⁵) или опухолью EG7-OVA. Через 24-48 часов после инокуляции мышей инъецируют внутрибрюшинным (IP) путем подходящим количеством иммунореактивного реагента (например, антитела) к SIINFEKL/МНС класса I или местным SC путем в присутствии или в отсутствие подходящего количества препарата HSP. Антиопухолевое действие комбинированной терапии сравнивают с действием только антитела мониторингом роста опухолей на протяжении периода 30-60 дней (измерение штангенциркулями). Определяют выживание, и влияние времени на гибель мышей анализируют регрессивным анализом Сох. Мышей обследуют также ежедневно на сигналы токсичности, включающие уровень активности, неровный налет на языке, диарею и общий внешний вид. Модели и способы оценки действий антител или других иммунореактивных реагентов являются известными в данной области (публикация Wooldridge et al., 1997, Blood 89(8):2994-2998, включенная в данное описание в качестве ссылки во всей ее полноте).

5.3 Повышенная опсонизация бактерий

Повышенную опсонизацию бактерий добавлением препарата HSP для терапевтического лечения антителом демонстрируют in vitro инкубацией эффекторных клеток для анализа опсонофагоцитоза (HL-60) с препаратом HSP. Клетки оценивают на то, являются ли они более эффективными при опсонизации S. pneumonia или S. aureus при данном титре антитела (например, образца сыворотки человека с опсонизирующей активностью, специфичной для S. pneumonia или S. aureus соответственно).

5.4 Позитивная регуляция Fc-рецепторов

Моноциты, натуральные клетки-киллеры или полиморфоядерные клетки инкубируют в присутствии или в отсутствие подходящего количества препарата HSP. Трипсинизированные клетки инкубируют при 4°С в течение 60 мин с моноклональными антителами, специфичными для Fc R, Fc гамма R1, Fc гамма RII или Fc гамма RIII. Клетки затем инкубируют с FITC-зондом к антимышиному IgG, промывают, фиксируют в параформальдегиде и анализируют FACScan. Проводят мониторинг позитивной регуляции Fc-рецепторов на этих клетках.

Кроме того, проводят также мониторинг позитивной регуляции TNF-альфа, IL-6 и MIP-1-альфа препаратом HSP в клетах-макрофагах.

Экспериментальные примеры

Эксперименты проводили на мышиной модели. Осуществляли введение комплекса очищенный gp96-пептид и анти-СТLА-4 антитело и комплекса очищенный gp96-пептид и анти-СD25 антитело. Сравнивали противоопухолевую активность в случае комплексного введения или отдельного введения. На 0 день мышам вводили опухолевые клетки SM1, а в указанные на фиг.1 и 2 дни вводили антитела или препарат очищенного gp96. На фиг.2 показан средний размер опухоли (для комбинации с анти-СD25 антителом), на фиг.1 - средний диаметр опухоли (для комбинации с анти-СТLА-4 антителом) в период после введения опухолевых клеток.

Комбинация очищенного gp96 и анти-СТLА-4 антитела обеспечивала 86% подавление опухоли у мышей. При введении только антитела отмечали 14% подавление, а при введении только очищенного gр96 - 17% подавление опухоли. Комбинация препарата очищенного gр96 и анти-СD25 антитела давала уменьшение размера опухли на 89% по сравнению с группой, получавшей буфер, при этом уменьшение не отмечали у мышей, получавших только препарат очищенного gр96, и у мышей, получавших только анти-СD25 антитело, отмечали уменьшение размера на 72%.

Комбинация очищенного gр96 и анти-СТLА-4 антитела обеспечивает 86% подавление опухоли у мышей, при этом у мышей, получавших одни антитела, отмечали 14% подавление, а у мышей, получавших один препарат очищенного gр96, отмечали 17% подавление опухоли. Количество 86% выше суммарного на 31% и является синергетическим.

Комбинация препарата очищенного gр96 и анти-СD25 антитела обеспечивает уменьшение размера опухоли на 89% по сравнению с группой, получавшей буфер, при этом не было отмечено уменьшения опухоли у мышей, получавших один препарат очищенного gр96, а у мышей, получавших одно анти-СD25 антител, опухоль уменьшалась на 72%. Таким образом, уменьшение опухоли на 89% не является суммарным, превышает 72% и является синергетическим.

Все процитированные в данном описании ссылки включены в него в качестве ссылки в их полном виде и для всех целей в той же самой степени, как если бы каждая отдельная публикация, или патент, или заявка на патент была особо и отдельно указана, как включенная в качестве ссылки в ее полном виде для всех целей.

Может быть сделано много модификаций и вариантов данного изобретения, не выходящих за пределы объема и сущности изобретения, как должно быть очевидно для специалиста в данной области. Конкретные варианты осуществления, описанные здесь, представлены только в качестве примеров, и изобретение должно ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения вместе с полным объемом эквивалентов, которые входят в эту формулу изобретения.