способ получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-abortus

Формула изобретения

Способ получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-abortus, включающий иммунизацию кроликов вакцинным штаммом бруцелл вида В. abortus разовой дозой внутривенно, обескровливание животных, инактивацию сыворотки, перекрестную абсорбцию сыворотки бактериальной массой гетерологичного вида бруцелл с последующей ее инкубацией при 37°С в течение 2 ч, концентрирование сыворотки путем центрифугирования и добавление фенола в качестве консерванта, отличающийся тем, что для иммунизации кроликов используют смесь (1:1) взвеси вакцинного штамма В. abortus 19 ВА концентрацией 3,0-5,0×10⁹ м.к./мл, обеззараженной кипячением в течение 60 мин, и взвеси живой культуры того же штамма В. abortus 19 ВА концентрацией 3,0-5,0×10⁹ м.к./мл в объеме 1 мл, после обескровливания животных сыворотку инактивируют при 60-65°С в течение 1-1,5 ч, для перекрестной абсорбции используют бакмассу штамма В. melitensis 548.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-abortus, используемой для видовой дифференциации штаммов возбудителей рода Brucella.

Известна биотехнология получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки (anti-abortus) с использованием штамма бруцелл вида В.abortus первого биовара, включающая внутривенное заражение кроликов суспензией штамма В.abortus 544 в дозе 1×10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. Через 5-7 дней животных обескровливают, полученную сыворотку абсорбируют бакмассой штамма гетерологичного вида бруцелл В. melitensis 16М. Абсорбированную сыворотку инкубируют при 37°С в течение 2 ч, концентрируют центрифугированием, разводят в фенолсолевом растворе [Corbel М.Х., Yill K.P.W., Thomas E.L. Methods for the identification of Brucella. Central Veterinary Lab. New Haw, Weybrige, Sury KT153, № 13, 1978].

Недостатком описанной биотехнологии является получение сыворотки с использованием вирулентного штамма бруцелл на этапе заражения кроликов и этапе абсорбции сыворотки. Полученная сыворотка характеризуется низкой чувствительностью (1:160), что препятствует получению конечных результатов дифференциации с достаточной степенью достоверности.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-abortus, при котором заражение кроликов проводят разовой дозой штамма В. abortus 544 (1,8-2,0×10 ⁸ КОЕ/мл), обескровливают животных через 5-7 дней, инактивируют сыворотку при 60-65°С в течение 1-1,5 ч и проводят перекрестную абсорбцию сыворотки бакмассой штамма В. melitensis 28 при ее концентрации 3,5-3,7×10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки, с последующим добавлением фенола [Патент РФ № 2104031, опубл. 10.02.98. Бюл. № 4].

Способ является достаточно эффективным для получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-abortus, титры которой после перекрестной абсорбции составляют 1:160-1:320.

Использование в биотехнологии получения сывороток живых культур вирулентных штаммов бруцелл на этапах заражения лабораторных животных и их обескровливания делает технологический процесс получения сыворотки опасным из-за возможного негативного воздействия на персонал фактора биологической опасности (вирулентного штамма В. abortus).

Целью изобретения является разработка биотехнологии получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-abortus, позволяющей существенно снизить риск опасного воздействия биологического фактора (вирулентного штамма возбудителя бруцеллеза) на персонал при опытно-экспериментальном производстве, с сохранением высокой специфической активности и специфичности сыворотки.

Для достижения поставленной цели предлагаемый способ получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-abortus включает иммунизацию кроликов породы Шиншилла разовой дозой в объеме 1 мл смесью (1:1) из взвеси вакцинного штамма В. abortus 19ВА концентрацией 3,0-5,0×10⁹ м.к. (микробных клеток)/мл, обеззараженной кипячением в течение 60 мин, и взвеси живой культуры того же штамма В. abortus 19ВА концентрацией 3,0-5,0×10⁹ м.к. /мл, обескровливание животных через 9 суток, инактивацию сыворотки при 60-65°С в течение 1-1,5 ч. Для перекрестной абсорбции используют бакмассу штамма В. melitensis 548, полученную путем выращивания культуры в течение 70-72 ч и добавляемую к сыворотке из расчета 3,5-3,7×10 ⁹ м.к. на 10 мл сыворотки, с последующей инкубацией сыворотки при 37°С в течение 2 ч, ее концентрированием путем центрифугирования (30 мин при 5000 об/мин) и добавлением фенола в качестве консерванта до конечной концентрации 0,3-0,4%.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки.

Использование в качестве иммунизирующего агента смеси (1:1) из взвеси вакцинного штамма В. abortus 19ВА, обеззараженной кипячением в течение 60 мин, и взвеси живой культуры того же штамма В. abortus 19ВА, значительно снижает риск биологической опасности при манипуляциях персонала на этапе иммунизации и обескровливания. Использование в качестве агента для перекрестной абсорбции культуры штамма В. melitensis 548 обеспечивает получение сыворотки с более высокой специфической активностью. Титры полученной предлагаемым способом бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-abortus составляют 1:320-1:640. Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Культуру В. abortus 19ВА выращивают на косяках плотной питательной среды в течение 48 ч при температуре 37°С, готовят 2 мл взвеси данного штамма концентрацией 5,0×10 ⁹ м.к./мл. Один миллилитр взвеси обеззараживают кипячением в течение 60 минут. Готовят 1 мл смеси (1:1) из взвеси, обеззараженной кипячением, и взвеси живой культуры В. abortus 19ВА, которую вводят внутривенно кролику массой 2,5-3,0 кг. Через 9 суток животных обескровливают, сыворотку отбирают и инактивируют при 60°С в течение 1 ч. Параллельно выращивают культуру штамма гетерологичного вида В. melitensis 548 на матрацах в течение 72 ч. Бакмассу смывают 0,9% раствором натрия хлорида, центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения 5000 об/мин, осадок собирают и добавляют к нему 0,9% раствор натрия хлорида. Полученную бакмассу из расчета 3,7×10⁹ м.к. на 10 мл добавляют к сыворотке, инкубируют при 37°С в течение 2 ч и центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения 5000 об/мин. Сыворотку отбирают и добавляют фенол до 0,3-0,4%. Титр сыворотки составляет 1:320-1:640.

Пример 2. Выполняют аналогично примеру 1 за исключением того, что готовят 2 мл взвеси штамма В. abortus концентрацией 4,0×10⁹ м.к./мл. Один миллилитр взвеси обеззараживают кипячением в течение 60 минут. Готовят 1 мл смеси (1:1) из взвеси, обеззараженной кипячением, и взвеси живой культуры В. abortus 19ВА, которую вводят внутривенно кролику массой 2,5-3,0 кг. Через 9 суток животных обескровливают, сыворотку отбирают и инактивируют при 60°С в течение 1 ч. Параллельно выращивают культуру штамма гетерологичного вида B. melitensis 548 на матрацах в течение 72 ч. Бакмассу смывают 0,9% раствором натрия хлорида, центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения 5000 об/мин, осадок собирают и добавляют к нему 0,9% раствор натрия хлорида. Полученную бакмассу из расчета 3,7×10⁹ м.к. на 10 мл добавляют к сыворотке, инкубируют при 37°С в течение 2 ч и центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения 5000 об/мин. Сыворотку отбирают и добавляют фенол до 0,3-0,4%. Титр сыворотки составляет 1:320-1:640.

Пример 3. Выполняют аналогично примеру 1 за исключением того, что готовят 2 мл взвеси штамма В. abortus 19ВА концентрацией 3,0×10⁹ м.к./мл. Один миллилитр взвеси обеззараживают кипячением в течение 60 минут. Готовят 1 мл смеси (1:1) из взвеси, обеззараженной кипячением, и взвеси живой культуры В. abortus 19ВА, которую вводят внутривенно кролику массой 2,5-3,0 кг. Через 9 суток животных обескровливают, сыворотку отбирают и инактивируют при 60°С в течение 1 ч. Параллельно выращивают культуру гетерологичного вида В. melitensis 548 на матрацах в течение 72 ч. Бакмассу смывают 0,9% раствором натрия хлорида, центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения 5000 об/мин, осадок собирают и добавляют к нему 0,9% раствор натрия хлорида. Полученную бакмассу из расчета 3,7×10 ⁹ м.к. на 10 мл добавляют к сыворотке, инкубируют при 37°С в течение 2 ч и центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения 5000 об/мин. Сыворотку отбирают и добавляют фенол до 0,3-0,4%. Титр сыворотки составляет 1:320-1:640.

Выбор штамма для иммунизации кроликов обеспечивает создание оптимальных условий биологической безопасности в ходе данной манипуляции. Выбор граничных значений заявляемых параметров предлагаемого способа обусловлен тем, что уменьшение концентраций иммунизирующего агента (В. abortus 19ВА) ниже 3,0×10⁹ м.к./мл приводит к недостаточному образованию антител, что в конечном итоге снижает специфическую активность получаемой сыворотки, а увеличение иммунизирующей дозы выше 5,0×10⁹ м.к./мл нецелесообразно, так как заявленные пределы концентраций используемого штамма обеспечивают достаточную степень иммунизации животных, в противном случае дальнейшее повышение иммунизирующих доз приведет к недифференцированному иммунологическому ответу.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование обеспечивает получение бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-abortus с существенно сниженным риском биологической опасности технологического цикла, чем по способу-прототипу, за счет использования на этапе иммунизации животных-продуцентов вместо вирулентного вакцинного штамма бруцелл В. abortus 19ВА. При этом сохраняется высокая специфическая активность и специфичность получаемой сыворотки.