способ обнаружения комплексов между гепаринами и поликатионами

Формула изобретения

Способ обнаружения поликатионов, образующих комплексы с гепаринами, характеризующийся тем, что растворы поликатионов вводят в состав 1%-ного агарозного геля, а растворы гепаринов вносят в лунки, проводят электрофорез, окрашивают гель 0,1%-ным раствором альцианового синего в 3%-ной уксусной кислоте, и по наличию окрашенных пиков преципитации судят об образовании комплекса.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для выбора поликатионов, образующих комплексы с гепаринами.

В последние десятилетия низкомолекулярные гепарины (НМГ) с более узким молекулярно-массовым распределением 4-6 кДа вытесняют лекарственный препарат нефракционированный гепарин (НФГ), традиционно используемый при лечении и профилактики тромбозов [1]. Поликатион сульфат протамина (СП) образует комплексы с гепаринами благодаря электростатическому взаимодействию, используется для нейтрализации антикоагулянтной активности нефракционированного гепарина [2], то есть является его антидотом. Но, так как у препаратов НМГ снижен заряд молекул, СП не может полностью нейтрализовать их антикоагулянтную активность [3]. Кроме того СП обладает рядом недостатков. Его внутривенное введение может сопровождаться отдельными побочными эффектами: увеличение давления в легочной артерии и уменьшение систолического и диастолического кровяного давления, потребления кислорода миокардом, частоты сердечных сокращений и системного сосудистого сопротивления; бронхоспазм и шок [4].

Поликатионы хитозаны тоже могут образовывать комплексы с гепаринами [5], а благодаря биосовместимости с тканями человека, низкой токсичности, способности усиливать регенеративные процессы при заживлении ран, биодеградируемости [6] можно предполагать, что хитозаны представляют особый интерес как антидоты гепарина.

Известен способ обнаружения комплексов между гепаринами и сульфатом протамина - нефелометрическое титрование, состоящий в титровании раствора сульфата протамина раствором гепарина в воде, путем подачи раствора осадителя (гепарина) в кювету спектроколориметра [7].

К недостаткам этого известного способа следует отнести то, что при большом количестве образцов поликатионов этот метод трудоемок, требует много времени и дорогой аппаратуры.

Этот способ выбран нами в качестве прототипа.

Задачей изобретения является создание способа быстрой оценки возможности образования комплексов между поликатионами и гепаринами.

Поставленная задача достигается тем, что в способе обнаружения комплексов между гепаринами и поликатионами, включающем горизонтальный электрофорез в геле агарозы, для получения преципитирующих комплексов гепаринов с поликатионами предусмотрено следующее отличие: в гель агарозы добавляют поликатионы, в лунки - гепарины.

Предложенный способ отличается простотой исполнения, позволяет быстро, всего за 30 минут определить наличие комплексов между одним поликатионом и 30-ю образцами гепаринов, а также количественно определить наличие гепаринов в жидкостях. Ранее горизонтальный электрофорез никогда с этой целью не использовали.

Мы исследовали возможность образования и подвижность в электрическом поле комплексов между образцами гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ) и классическим антидотом сульфатом протамина, а также с предполагаемыми антидотами (для нейтрализации антикоагулянтной активности гепаринов) хитозанами с ММ от 6 до 21 кД, и степенью дезацетилирования от 61 до 93% при горизонтальном электрофорезе в геле агарозы.

Сущность предложенного способа заключается в следующем.

Электрофорез растворов гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ с ММ 15,0 кД) проводят в слое 1%-ной агарозы в 0,02 М веронал-мединаловый буфер рН 8,6, содержащем сульфат протамина или хитозаны с ММ от 6 до 21 кД, и степенью дезацетилирования (СД) от 61 до 93%, на стеклянных пластинках. В геле вырезают лунки, заполняют их 5 мкл растворов антикоагулянтов. Электрофорез проводят в камере "Multiphor" в течение 30 мин при градиенте потенциала 10 В/см. Окрашивают преципитаты 0,1%-ным раствором альцианового синего в 3%-ной уксусной кислоте. Избыток красителя смывают 3%-ной уксусной кислотой. Пластины с высохшим гелем сканируют, переводят изображение в формат JPG и оценивают высоту и площадь пиков преципитации с помощью программы PhotoM 1,31.

Изобретение позволяет быстро и качественно определить наличие комплексов между гепаринами и поликатионами, а также количественно определить наличие гепаринов в биологических жидкостях.

В качестве объекта исследования использовали образцы НМГ с молекулярной массой (ММ) 3,4; 4,7; 5,4; 5,7; 6,1 кД и НФГ с MM 15,0 кД. Образцы НМГ получали с помощью деполимеризации НФГ из легких крупного рогатого скота (партия

D0110001 CHANGZHOU QUIANHONG BIO-PHARM CO. LTD, Китай) хитинолитическим ферментным комплексом [8] в лаборатории инженерии ферментов Центра "Биоинженерия" РАН. В качестве преципитиногенов использовали образцы хитозанов со степенью дезацетилирования (СД) 61-93% и ММ 6-21 кДа, полученные в той же лаборатории. ММ определяли по [9], степень дезацетилирования (СД) - по [9].

Краткое описание чертежа.

Электрофорез низкомолекулярных гепаринов в агарозном геле с сульфатом протамина (А) и хитозаном с ММ 16 кД и СД 91% (В). НМГ и НФГ (a - 1,25 мкг, b - 2,5 мкг) добавляли в 3-4 мм лунки, вырезанные в 1%-ном геле агарозы. Электрофорез проводили при градиенте 10 В/см в 0,02 М веронал-мединаловый буфер pH 8,6. Через 30 минут пластины с гелем окрашивали 0,1%-ным раствором альцианового синего. Пластины с высохшим гелем сканировали и измеряли пики преципитации в формате jpg. 1 - НФГ 15 кД; 2 - НМГ 5,1 кД; 3 - НМГ 7,4 кД; 4 - НМГ 4,7 кД; 5 - НМГ 4,0 кД; 6 - НМГ 2,7 кД.

На чертеже представлено сканированное изображения результата электрофореза образцов гепаринов в агарозном геле, в который добавлен классический антидот сульфат протамина (А) или хитозан (Б). У зон преципитации окрашенных комплексов ("ракеток") измеряли высоту в миллиметрах.

В качестве гелеобразующей среды использовали агарозу (Merck). Для электрофореза применяли 0,02 М веронал-мединаловый буфер pH 8,6.

В результате исследования отмечено наличие пиков преципитации, а следовательно, и комплексов, при проведении электрофореза гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ с ММ 15 кД) как с классическим антидотом для гепаринов - сульфатом протамина, а также и с хитозанами (ММ от 6 до 21 кД, и СД от 61 до 93%). Показана умеренная положительная связь между ММ образцов НМГ и высотой пиков преципитации с хитозанами. Коэффициенты линейной корреляции составили 0,6-0,93 (Таблица 1). При наличии большого количества образцов хитозанов возникает потребность быстрого анализа возможности образования комплексов между гепаринами и хитозанами, т.к. традиционные методы обнаружения комплексов гепаринов с антидотом сульфатом протамина, достаточно трудоемкие, требуют большого количества времени, дорогой аппаратуры и реактивов. Быстрый метод оценки комплексообразования позволяет с минимальными затратами отсеять образцы хитозанов, которые слабо или вовсе не образуют комплексы с гепаринами, а следовательно, не способны нейтрализовать их антикоагулянтную активность.

Способ позволяет быстро оценить образцы гепаринов на предмет образования комплексов с предполагаемыми антидотами хитозанами.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1

На стеклянную пластину размером 9×9 см наносили 10 мл 1%-ной агарозы в 0,02 М веронал-мединаловый буфер pH 8,6, который содержал 1 мг сульфата протамина. В геле вырезали лунки, заполняли их 5 мкл растворов исследуемых гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ) в концентрациях 125, 250, 500 и 1000 мкг/мл, электрофорез проводили в камере "Multiphor" в течение 30 мин при градиенте потенциала 10 В/см и окрашивали преципитаты 0,1%-ным раствором альцианового синего в 3%-ном растворе уксусной кислоты. Избыток красителя отмывали 3%-ной уксусной кислотой.

Пример 2

На стеклянную пластину размером 9×9 см наносили 10 мл 1%-ной агарозы в 0,02 М веронал-мединаловый буфер pH 8,6, который содержал 1 мг хитозана со степенью дезацетилирования 85% и молекулярной массой 6 кДа. В геле вырезали лунки, заполняли их 5 мкл растворов исследуемых гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ) в концентрациях 125, 250, 500 и 1000 мкг/мл, электрофорез проводили в камере "Multiphor" в течение 30 мин при градиенте потенциала 10 В/см и окрашивали преципитаты 0,1%-ным раствором альцианового синего в 3%-ном растворе уксусной кислоты. Избыток красителя отмывали 3%-ной уксусной кислотой.

Пример 3

На стеклянную пластину размером 9×9 см наносили 10 мл 1%-ной агарозы в 0,02 М веронал-мединаловый буфер pH 8,6, который содержал 1 мг хитозана со степенью дезацетилирования 85% и молекулярной массой 10 кДа. В геле вырезали лунки, заполняли их 5 мкл растворов исследуемых гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ) в концентрациях 125, 250, 500 и 1000 мкг/мл, электрофорез проводили в камере "Multiphor" в течение 30 мин при градиенте потенциала 10 В/см и окрашивали преципитаты 0,1%-ным раствором альцианового синего в 3%-ном растворе уксусной кислоты. Избыток красителя отмывали 3%-ной уксусной кислотой.

Пример 4

На стеклянную пластину размером 9×9 см наносили 10 мл 1%-ной агарозы в 0,02 М веронал-мединаловый буфер pH 8,6, который содержал 1 мг хитозана со степенью дезацетилирования 85% и молекулярной массой 21 кДа. В геле вырезали лунки, заполняли их 5 мкл растворов исследуемых гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ) в концентрациях 125, 250, 500 и 1000 мкг/мл, электрофорез проводили в камере "Multiphor" в течение 30 мин при градиенте потенциала 10 В/см и окрашивали преципитаты 0,1%-ным раствором альцианового синего в 3%-ном растворе уксусной кислоты. Избыток красителя отмывали 3%-ной уксусной кислотой.

Пример 5

На стеклянную пластину размером 9×9 см наносили 10 мл 1%-ной агарозы в 0,02 М веронал-мединаловый буфер pH 8,6, который содержал 1 мг хитозана со степенью дезацетилирования 70% и молекулярной массой 21 кДа. В геле вырезали лунки, заполняли их 5 мкл растворов исследуемых гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ) в концентрациях 125, 250, 500 и 1000 мкг/мл, электрофорез проводили в камере "Multiphor" в течение 30 мин при градиенте потенциала 10 В/см и окрашивали преципитаты 0,1%-ным раствором альцианового синего в 3%-ном растворе уксусной кислоты. Избыток красителя отмывали 3%-ной уксусной кислотой.

Пример 6

На стеклянную пластину размером 9×9 см наносили 10 мл 1%-ной агарозы в 0,02 М веронал-мединаловый буфер pH 8,6, который содержал 1 мг хитозана со степенью дезацетилирования 61% и молекулярной массой 21 кДа. В геле вырезали лунки, заполняли их 5 мкл растворов исследуемых гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ) в концентрациях 125, 250, 500 и 1000 мкг/мл, электрофорез проводили в камере "Multiphor" в течение 30 мин при градиенте потенциала 10 В/см и окрашивали преципитаты 0,1%-ным раствором альцианового синего в 3%-ном растворе уксусной кислоты. Избыток красителя отмывали 3%-ной уксусной кислотой.

Пример 7

На стеклянную пластину размером 9×9 см наносили 10 мл 1%-ной агарозы в 0,02 М веронал-мединаловый буфер pH 8,6, который содержал 1 мг хитозана со степенью дезацетилирования 91% и молекулярной массой 16 кДа. В геле вырезали лунки, заполняли их 5 мкл растворов исследуемых гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ) в концентрациях 125, 250, 500 и 1000 мкг/мл, электрофорез проводили в камере "Multiphor" в течение 30 мин при градиенте потенциала 10 В/см и окрашивали преципитаты 0,1%-ным раствором альцианового синего в 3%-ном растворе уксусной кислоты. Избыток красителя отмывали 3%-ной уксусной кислотой.

Пример 8

На стеклянную пластину размером 9×9 см наносили 10 мл 1%-ной агарозы в 0,02 М веронал-мединаловый буфер pH 8,6, который содержал 1 мг хитозана со степенью дезацетилирования 93% и молекулярной массой 7,4 кДа. В геле вырезали лунки, заполняли их 5 мкл растворов исследуемых гепаринов (НМГ с ММ от 3,4 до 6,1 кД и НФГ) в концентрациях 125, 250, 500 и 1000 мкг/мл, электрофорез проводили в камере "Multiphor" в течение 30 мин при градиенте потенциала 10 В/см и окрашивали преципитаты 0,1%-ным раствором альцианового синего в 3%-ном растворе уксусной кислоты. Избыток красителя отмывали 3%-ной уксусной кислотой.

Список литературы

1. Low-molecular-weight heparin (LMWH) in the treatment of thrombosis. Holzheimer RG. Eur J Med Res. 2004 Apr 30; 9(4):225-39.

2. Lohne F, Klow NE, Stavnes S(2004) Acta Radiol., 45, 2, 171-5.

3. Crowther M, Berry LR, Monagle PT, Chan AC.(2002), Br J Haematol, 116, 178-864.

4. Pugsley MK, Kalra V, Froebel-Wilson S (2002), Life Sci.,72, 3,293-305.

5. Preparation of water-soluble chitosan/heparin complex and its application as wound healing accelerator. Biomaterials. 2003 Apr; 24(9):1595-601 Kweon DK, Song SB, Park YY.

6. H.Yi, L-Q Wu, W.E.Bentley, R Ghodssi, G W.Rubloff, J N.Culver, G F.Payne, Biofabrication with Chitosan, Biomacromolecules, Vol.6, No.6, 2005, 2881-2895.

7. Мазов М.Ю., Кобяков В.В., Андреевичева Т.Ю., И.А.Донецкий, В.П.Панов. Химико-фармацевтический журнал стр 1260-1262.

8. Bannikova GE, Stolbushkina PP, Drozd NN, Vikhoreva GA, Varlamov VP, Makarov VA, Panov AV. Heparin hydrolysis by a immobilise ensyme complex from Streptomyces kurssanovii. Prikladnaia biokhimia i mikrobiologia, 2004; 40(4):429-34.

9. Wang W, Во S, Li S, Qin W. Determination of the Mark-Houwin equation for chitosans with different degrees of deacetylation. Int J Biol Macromol 1991; 13(5), 281-5.

Таблица 1. Электрофоретическая подвижность комплексов гепаринов с поликатионами (сульфат протамина и хитозанами)
ММ гепаринов, кДа	Высота пиков преципитации, мм
Хитозан СД 85% MM 6,0 кД	Хитозан СД 85% MM 10,0 кД	Хитозан СД 85% MM 21,0 кД	Хитозан СД 70% MM 21,0 кД	Хитозан СД 61% MM 21,0 кД	Хитозан СД 91% MM 16,0 кД	Хитозан СД 93% MM 7,4 кД	Сульфат протамина
3,4	6,1±0,6	7,8±0,7	9,3±0,2	5,3±1,6	4,0±1,4	5,8±1,1	2,7±0,1	7,3±0,7
4,7	11,7±0,4	21,3±6,7	21,7±5,6	12,0±0,1	12,0±0,2	11,5±2,7	6,8±0,1	21,5±0,3
5,4	9,4±1,4	16,7±5,6	21,0±4,5	10,7±0,7	8,3±0,8	9,8±2,2	5,8±1,0	21,5±5,0
5,7	10,6±1,0	21,7±7,7	21,3±7,9	12,8±0,2	12,0±0,2	12,0±2,1	8,0±1,2	32,3±1,1
6,1	9,3±0,5	21,2±7,7	22,3±6,7	9,3±2,7	8,8±1,8	12,0±4,1	8,7±0,9	17,3±6,2
15,0	17,4±0,4	22,5±0,6	25,2±0,5	14,7±0,7	15,5±0,9	14,7±1,0	13,5±0,7	43,6±1,5