синтетическая среда для хранения спермы хряков в охлажденном состоянии

Формула изобретения

Синтетическая среда для хранения спермы хряков в охлажденном состоянии, включающая глюкозу, двуводную динатриевую соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты, натрий лимоннокислый трехзамещенный пятиводный (цитрат натрия), аммоний сернокислый, натрий двууглекислый и воду дистиллированную, отличающаяся тем, что дополнительно содержит в качестве антиоксиданта этиловый спирт при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Глюкоза	3,80 - 3,90
Двуводная динатриевая соль
этилендиамин-NNNN-
тетрауксусной кислоты	0,26-0,28
Натрий лимоннокислый
трехзамещенный пятиводный	0,36-0,38
Аммоний сернокислый	0,18-0,20
Натрий двууглекислый	0,05-0,06
Этиловый спирт	0,10-0,20
Вода дистиллированная	Остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к искусственному осеменению сельскохозяйственных животных, в частности к синтетическим средам для разбавления и хранения спермы хряков в охлажденном состоянии.

Известно, что в процессе хранения разбавленной спермы хряков в охлажденном до 16-18°С состоянии происходит активация процессов перекисного окисления липидов, что отрицательно влияет на подвижность и оплодотворяющую способность сперматозоидов, сохраняемых при этой температуре.

В этой связи необходима разработка более совершенных синтетических сред для спермы хряков, позволяющих увеличить сроки хранения разбавленной спермы хряков в охлажденном до 16-18°С состоянии и повысить их оплодотворяющую способность.

Известна среда для хранения спермы хряков, содержащая четырехзамещенный ЭДТА, глюкозу медицинскую безводную, цитрат натрия трехзамещенный, аммоний сернокислый и дистиллированную воду [1].

Также известна синтетическая среда для разбавления спермы хряков, содержащая глюкозу, хелатон-3, лимоннокислый трехзамещенный пятиводный натрий, аммоний сернокислый, двууглекислый натрий, спермосан-3, молочнокислый литий и бидистиллированную воду [2].

Недостатком данных сред является то, что они не поддерживают высокую подвижность сохраняемых в охлажденном состоянии сперматозоидов при хранении более 12-24 часов при 16°С, а также не препятствуют развитию процесса перекисного окисления липидов, что снижает оплодотворяющую способность сперматозоидов.

Известна синтетическая среда для разбавления и замораживания спермы хряков, содержащая глюкозу, цитрат натрия 5,5-водный, этилендиаминтетраацетат двунатриевый двуводный, трис (оксиметил) аминометан, сульфат аммония, сорбит, глицерин и антиоксидант - водный экстракт подсолнечного масла [3].

Недостатком данной среды является то, что она предназначена для разбавления и замораживания спермы хряков и не может применяться для хранения спермы хряков в охлажденном состоянии. Поскольку в процессе замораживания спермы происходят иные физико-химические воздействия на клетку, чем при хранении ее в охлажденном состоянии, поэтому и компоненты среды подбирают соответственно такие, чтобы предотвратить криоповреждения клетки при глубоком до (- 196°С) замораживании. Так, например, важное значение при глубоком замораживании спермы сельскохозяйственных животных имеет защитное действие глицерина. Механизм защитного действия глицерина в основном сводится к следующему: он проникает внутрь клетки и играет роль противосолевого буфера; позволяет вызывать переохлаждение системы путем связывания части свободной воды, что способствует протеканию витрификации ионных процессов; укрепляет мембраны клеток, предохраняя их от повреждающего действия воды при перераспределении ее по обе стороны мембраны. Кроме того, глицерин, проникая в клетку, замещает часть свободной воды и вытесняет электролиты, снижая их внутриклеточную концентрацию до степени, не оказывающей вреда при замораживании. При добавлении глицерина в состав разбавителя он понижает точку замерзания раствора.

Наряду с положительным влиянием глицерин может оказывать и отрицательное действие на биологическую полноценность сперматозоидов. Имеются данные, что глицерин способствует разрушению акросом у сперматозоидов. При использовании глицерина из-за его высокой растворяющей способности повреждаются цитоплазматические мембраны вследствие растворения входящих в них компонентов, в частности липидов, что ведет к потере многих жизненно важных соединений клетки. Глицерин подавляет дыхательную активность сперматозоидов. Поэтому, несмотря на положительную роль глицерина и других компонентов, необходимых при замораживании сперматозоидов хряков, их присутствие в среде для хранения спермы хряков в охлажденном до 16°С состоянии нежелательно.

Наиболее близким аналогом (прототипом) нашего изобретения является (ГХЦС) среда для разбавления спермы хряков [4], которая содержит следующие компоненты: глюкоза медицинская безводная - 40 г; двуводная динатриевая соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты (трилон-Б) - 2,6 г; натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный (цитрат натрия) - 3,8 г; аммоний сернокислый - 1,8 г; натрий двууглекислый - 0,5 г; вода дистиллированная - 1000 мл; спермосан-3 - 250 тыс.ЕД. Соотношение ингредиентов (мас.%):

Глюкоза медицинская безводная	3,80
Двуводная динатриевая соль
этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты	0,26
Натрий лимонно-кислый
трехзамещенный пятиводный	0,36
Аммоний сернокислый	0,18
Натрий двууглекислый	0,05
Вода дистиллированная	остальное
Спермосан-3	250 тыс.ЕД.

Недостатком данной среды является то, что она не содержит антиоксидантов и не позволяет поддерживать высокую оплодотворяющую способность спермы хряков, сохраняемой при 16-18°С.

Известно, что в процессе хранения сперматозоидов в охлажденном состоянии в них может происходить накопление супероксидных радикалов, являющихся предшественниками всех активных форм кислорода in vivo. Их образование приводит к повреждению ДНК, белков, липидов и т.д. Стационарность процессов окисления липидов является важным условием стабильности и функционирования клеточных мембран, поскольку установлено, что при развитии ПОЛ изменяется как жирнокислотный состав мембран, так и их физико-химические свойства (микровязкость, текучесть, мембранный потенциал, полярность внутренних областей мембраны и т.п.). Следствием этого является изменение транспортных свойств мембраны и активности мембранно-связанных ферментов.

С целью предотвращения ПОЛ и накопления токсичных продуктов пероксидации липидов некоторые исследователи предлагают использовать в составе синтетических сред для разбавления спермы животных различные антиоксиданты.

Целью изобретения является повышение живучести и оплодотворяющей способности сперматозоидов хряка при разбавлении и хранении в охлажденном до 16°С состоянии.

Поставленная цель достигается тем, что среда, включающая: глюкозу; двуводную динатриевую соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты (трилон-Б); натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный (цитрат натрия); аммоний сернокислый; натрий двууглекислый и воду дистиллированную, дополнительно содержит в качестве антиоксиданта этиловый спирт при следующем соотношении ингредиентов (мас.%):

Глюкоза	3,80-3,90
Двуводная динатриевая соль
этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты	0,26-0,28
Натрий лимонно-кислый
трехзамещенный пятиводный	0,36-0,38
Аммоний сернокислый	0,18-0,20
Натрий двууглекислый	0,05-0,06
Этиловый спирт	0,10-0,20
Вода дистиллированная	остальное

Этиловый спирт - бесцветная жидкость, во всех соотношениях хорошо смешивается с водой, химическая формула - С₂Н₅OH, молекулярная масса 46,069. При включении в состав среды в нетоксичных концентрациях существенно не изменяет осмотическое давление и pH среды.

Этиловый спирт обладает антиоксидантными свойствами [5]. Введение этилового спирта в оптимальном количестве в состав среды для хранения спермы хряков в охлажденном состоянии позволяет снизить вероятность активации процесса перекисного окисления липидов в сохраняемой сперме хряков. Ранее этиловый спирт в составе сред для спермы животных не использовался.

Допустимые граничные значения концентраций компонентов в заявленной среде приведены в таблице 1.

Таблица 1
Компоненты среды и качественные показатели сохраняемой спермы хряков	Состав сред (мас.%)
1-й	2-й	3-й
Глюкоза	3,80	3,85	3,90
Двуводная динатриевая соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты	0,26	0,27	0,28
Натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный	0,36	0,37	0,38
Аммоний сернокислый	0,18	0,19	0,20
Натрий двууглекислый	0,050	0,055	0,060
Этиловый спирт	0,10	0,15	0,20
Вода дистиллированная	до 100	до 100	до 100
Абсолютный показатель живучести сперматозоидов при 16°С, усл.ед.	996	1025	985

Если содержание компонентов выходит за границу крайних нижних или верхних значений предполагаемой среды, то это дает худшие результаты и не приводит к достижению поставленной цели (таблица 2).

Таблица 2
Компоненты сред и показатели качества сохраняемой спермы хряков	Качественные показатели спермы при следующем содержании компонентов
Глюкоза	3,75	3,95
Двуводная динатриевая соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты	0,25	0,30
Натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный	0,35	0,39
Аммоний сернокислый	0,17	0,21
Натрий двууглекислый	0,040	0,070
Этиловый спирт	0,05	0,25
Вода дистиллированная	до 100	до 100
Абсолютный показатель живучести сперматозоидов при 16°С, усл.ед.	860	840

Пример приготовления среды.

В стерильную химическую колбу вносят по рецепту оптимальный (второй) состав предлагаемой среды в мас.%: глюкозу медицинскую безводную - 3,85; натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный - 0,37; двуводную динатриевую соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты - 0,27; аммоний сернокислый - 0,19; натрий двууглекислый - 0,055; этиловый спирт - 0,15; вода дистиллированная - остальное и санирующий препарат (согласно наставлению по его применению).

Свежеприготовленная синтетическая среда перед разбавлением спермы должна исследоваться по внешнему виду, цвету и периодически по показателю pH и осмотическому давлению.

Предлагаемая синтетическая среда по физико-химическим свойствам должна отвечать следующим требованиям: внешний вид - прозрачная жидкость без осадка и механических примесей; без запаха; pH - при температуре 20°С - 6,7±0,10; осмотическое давление - 7,0-8,5 атм.

Приготовленную среду используют для разбавления спермы в течение 3-4^x часов с момента приготовления. При использовании среды к 1 объему спермы добавляют 1-6 объемов среды в зависимости от концентрации сперматозоидов. Разбавленную сперму хряков хранят в термостате при 16°С.

Преимуществами заявленной среды является повышение живучести сперматозоидов и их оплодотворяющей способности при хранении спермы в охлажденном до 16°С состоянии.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение воздействия этилового спирта в составе среды на биологическую полноценность сперматозоидов хряка.

Сперму для исследования получали от хряков крупной белой породы мануальным способом. После взятия каждого эякулята определяли его объем и ряд качественных показателей (активность спермиев в процентах, концентрацию в млрд/мл, общее количество сперматозоидов в эякуляте в млрд.).

Для изучения воздействия этилового спирта в составе среды на сохранение биологической полноценности сперматозоидов хряка, вне организма при разбавлении спермы были использованы следующие его концентрации: 0,025; 0,05; 0,075; 0,10; 0,15; 0,20 и 0,25 мас.%. В контрольной группе нативную сперму хряка разбавляли ГХЦС средой.

Разбавленную сперму расфасовывали в пронумерованные флаконы и вместе с контрольным образцом хранили при 16°С, периодически определяя подвижность сперматозоидов через каждые 24 часа до полной их гибели. Затем вычисляли абсолютный показатель живучести (Sa) сперматозоидов.

Проведенные исследования показали, что при использовании в опыте этилового спирта в составе предлагаемой среды в концентрации 0,075-0,20 мас.% наблюдали повышение абсолютного показателя живучести сперматозоидов от 1022 до 1079 усл.ед. в то время как в контроле, где использована ГХЦС среда (прототип), абсолютный показатель живучести сперматозоидов был равен 762 усл.ед. В результате абсолютный показатель живучести в предлагаемой среде на 34-41% больше по сравнению с контролем (прототипом).

Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Концентрация этилового спирта, мас.%	Число экспериментов	Подвижность свежеполученной спермы, %	Абсолютный показатель живучести сперматозоидов при 16°С, усл.ед.
0,025	9	85	847±38,9
0,050	9	85	894±42,3
0,075	9	85	1022±36,5 x
0,10	9	85	1034±42,6 x
0,15	9	85	1068±43,8 x
0,20	9	85	1079±39,3 x
0,25	9	85	852±43,6
Контроль (прототип)	9	85	762±33,6
x - P<0,01

Пример № 2.

Испытание предлагаемой среды в производственных условиях.

Предложенная среда для разбавления и хранения спермы хряков в охлажденном до 16°С состоянии при следующем соотношении компонентов (в мас.%): глюкоза - 3,85; натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный - 0,37; двуводная динатриевая соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты - 0,27; аммоний сернокислый - 0,19; натрий двууглекислый - 0,055; этиловый спирт - 0,15; вода дистиллированная - остальное и санирующий препарат (согласно наставлению по его применению), была испытана в производственных условиях на оплодотворяющую способность спермы, сохраняемой в течение 24^х часов. Осеменение свиноматок проводили комиссионно на свинокомплексе ЗАО «Мордовский бекон» в республике Мордовия. Предлагаемой средой осеменили 146 голов свиноматок, средой ГХЦС (прототип) 128 голов, опоросилось соответственно 124 и 98 свиноматок. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4
Синтетическая среда	Осеменено свиней, гол.	Опоросилось	Среднее многоплодие, гол.
гол.	%
Предлагаемая (оптимальный вариант)	146	124	85,4	10,9
Контроль ГХЦС среда (прототип)	128	98	79,6	10,6

Испытания показали, что предложенная среда для разбавления и хранения спермы хряков в охлажденном до 16°С состоянии повысила оплодотворяемость свиноматок на 5,8% и их многоплодие на 0,3 поросенка по сравнению с контролем (прототипом).

Таким образом, введение этилового спирта в состав предлагаемой среды для разбавления и хранения спермы хряков в охлажденном до 16°С состоянии позволяет значительно улучшить биологическую полноценность сперматозоидов (абсолютный показатель живучести на 34-41%), а также повысить оплодотворяемость свиноматок на 5,8% и их многоплодие на 0,3 поросенка по сравнению с контролем (прототипом) ГХЦС средой.

Источники информации

1. А.С. СССР № 869768. Бюл. № 37, 1981.

2. А.С. СССР № 1708327 А1. Бюл. № 4, 1992.

3. Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1981, с.69.