серебряная соль n-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5h-пиримидинсульфон)-n'-изоникотиноилгидразида, проявляющая иммунотропную, противомикробную, противогрибковую (противомикотическую) активность, и лекарственное средство на ее основе

Формула изобретения

1. Серебряная соль N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида, проявляющая иммунотропную, противомикробную, противогрибковую (противомикотическую) активность, полученная путем добавления к предварительно интенсивно перемешанной до однородного состояния водной суспензии N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида нитрата серебра при мольном соотношении гидразида к нитрату серебра от 1:1 до 1:4 без доступа света до получения объемного гомогенного осадка, который затем выделяют.

2. Серебряная соль по п.1, для получения которой используют N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида в мелко дисперсном состоянии с выделением полученной соли фильтрованием, многократным промыванием бидистиллированной водой и сушкой при температуре 50-80°С.

3. Лекарственное средство, обладающее иммунотропной, противомикробной, противогрибковой активностью, содержащее в качестве активного вещества серебряную соль N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида по любому из пп.1 и 2 либо смесь N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида и его серебряной соли в соотношении от 1:1 до 4:1.

4. Средство по п.3 в форме таблеток, капсул, мазей, суппозиториев.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию лекарственных средств на основе новых биологически активных веществ, в частности к серебряной соли N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида, проявляющей иммунотропную, противомикробную, противогрибковую (противомикотическую) активность, способу ее получения и лекарственному средству на ее основе.

По данным ВОЗ в настоящее время первой особенностью состояния здоровья населения в мире является снижение иммунореактивности: по разным источникам до 50-70% людей имеют нарушения иммунитета. И второй особенностью, вытекающей из первой, является повышение частоты заболеваний, вызываемых условно-патогенной микробиотой. В связи с этим в последнее время препараты, обладающие двойственным действием - иммуномодулирующим и противомикробным, приобретают особую актуальность.

Известен иммуномодулятор N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразид гидрат (изофон) (патент РФ № 2141322), обладающий антимикобактериальнми свойствами не только в отношении микобактерий лепры, но и туберкулеза, а также других заболеваний, протекающих на фоне иммунодефицита. Изофон получают кипячением эквимолекулярных количеств гидразида изоникотиновой кислоты и 6-метилурацил-5-сульфохлорида в безводном ацетонитриле. Недостатком иммуномодулятора изофон с антимикобактериальной активностью является невысокая биологическая активность, обусловленная плохой растворимостью в воде, что подтверждается экспериментом на животных (кроликах), в котором показано, что около 50% изофона в неизменном виде обнаруживается в продуктах жизнедеятельности. Наряду с названием «ИЗОФОН» иммуномодулятор имеет широко распространенное торговое название «КРИСТАФОН».

Отечественные иммуномодулируюшие препараты с антимикобактериальной активностью кристафон и изофон нормализуют иммунный статус больных лепрой, туберкулезом, хроническим неспецифическим воспалением легких и хламидиозом, включая организм в борьбу с заболеванием, а также, проникая внутрь клетки, стимулируют ее функцию и доносят действующее начало до возбудителя, уничтожают его. Оказывают воздействие на возбудителей, передающихся половым путем (хламидии, трихомонады, уреаплазменные инфекции). Хорошо переносятся и не обнаруживают побочных действий. Обычно эти препараты вводятся в организм человека в таблетированной форме в достаточно большой дозе. При местном введении субстанций необходимо усилить эффективность действия лекарственного средства либо за счет введения других лекарственных веществ, оказывающих синергетический эффект, либо модифицируя субстанцию изофон и кристафон.

Наиболее близкой к изобретению является модификация изофона-динатриевая соль изофона (изодинафон, патент РФ № 2191015), проявляющая антимикробную и иммунотропную активность. Изодинафон получают путем взаимодействия эквимолярных количеств изофона и едкого натра в воде с последующим осаждением продукта реакции этанолом. Лекарственное средство в качестве активного вещества содержит изодинафон в количестве 0,01-2 г и может быть использовано в виде капсул, таблеток, инъекций и мазей. Использование изодинафона в качестве лекарственного препарата позволяет сократить дозу применяемого лекарственного средства, снизив тем самым стоимость лечения. Однако соединение такого рода, несмотря на преимущества в растворимости препарата в воде, легко разлагается на две части по гидразиновому фрагменту: производное сульфопиримидина (III), производное изоникотиновой кислоты (IV) и другие соединения.

Соответственно следует ожидать снижения активности препарата изодинафон и проявление биологической активности продуктов его распада. Кроме того, указанная модификация изофона имеет достаточно узкий спектр бактерицидного действия. Так, изодинафон показал в случае с B.cereus бактерицидную антимикробную активность, в случае с St.Aureus - бактериостатическую антимикробную активность.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в получении нового соединения на основе производных пиримидона и гидразида изоникотиновой кислоты, проявляющего усиленную иммунотропную, противомикробную, противогрибковую (противомикотическую) активность в сравнении с кристафоном и изофоном, и создании на его основе лекарственного средства.

Поставленная задача решается группой изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, а именно: способом получения нового соединения - серебряной соли кристафона и лекарственным средством на его основе.

Новое соединение - серебряная соль N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида (кристафона), проявляющая иммунотропную, противомикробную, противогрибковую (противомикотическую) активность, получено путем добавления к предварительно интенсивно перемешанной до однородного состояния водной суспензии N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида нитрата серебра при мольном соотношении гидразида к нитрату серебра от 1:1 до 1:4 без доступа света до получения объемного гомогенного осадка, который затем выделяют.

N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида используют в мелко дисперсном состоянии с выделением полученной соли фильтрованием, многократным промыванием бидистиллированной водой и сушкой при температуре 50-80°С.

Поставленная задача решается также лекарственным средством, обладающим иммунотропной, противомикробной, противогрибковой активностью, содержащим в качестве активного вещества серебряную соль N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида либо смесь N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида и его серебряной соли в соотношении от 1:1 до 4:1.

Лекарственное средство может быть выполнено в форме таблеток, капсул, мазей, суппозиториев.

Согласно изобретению серебряная соль кристафона может представлять собой соединение формулы I

или соединение формулы (II)

или смесь соединений (I) и (II).

Сущность предложенного изобретения заключается в том, что для усиления иммунотропной, противомикробной, противогрибковой (противомикотической) активности за счет дополнительного действия серебра предложено использовать субстанцию, представляющую собой серебряную соль кристафона.

Серебро обладает мощным бактерицидным, иммуномодулирующим, вяжущим, анальгезирующим свойствами и оказывает стимулирующее действие на кроветворные органы. Наиболее широко в медицине применяется способность серебра оказывать бактерицидный эффект в малых дозах, причем активностью обладают только ионы серебра. Бактерицидность проявляется уже в концентрации 0,0001%. Спектр действия препаратов серебра значительно шире многих антибиотиков и сульфаниламидов. Он включает как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии (в том числе антибиотикорезистентные штаммы), вирусы и грибы. Таким образом, исходя из вышеназванных свойств, серебро проявляет олигодинамическое действие.

Ввести серебро в организм сложно, т.к. его ионы непосредственно в месте введения образуют труднорастворимые комплексы с отрицательно заряженными белками и рядом функциональных групп ферментов, в связи с чем остро встает проблема выбора эффективной лекарственной формы.

Для кристафона в водном растворе характерна лактим-лактамная (прототропная) таутомерия, и, по сути дела, кристафон при переходе в раствор существует в двух таутомерных формах - лактамная (кето-форма) и лактимная (енольная форма).

Лактимная енольная форма приобретает ароматический характер и гидроксильная группа в пиримидиновом цикле приобретает свойства фенольного гидроксила. При взаимодействии суспензии кристафона в воде с нитратом серебра AgNO₃ образуется серебряная соль (изомеры).

Наиболее вероятно образование следующих структур серебряной соли кристафона (I), (II) или их смеси.

В молекуле серебряной соли кристафона присутствует ион серебра, способный крайне медленно диссоциировать в липофильной среде, высвобождая ионы серебра, что обеспечивает пролонгированное действие препаратов. Критическим фактором для бактерицидного действия в ране является требуемая локальная концентрация и возможность достижения этого уровня системным введением или местным применением. Если локальное кровоснабжение скомпрометировано, например при ишемии конечностей, отеке ткани или термической коагуляции, а также при наличии струпа и/или липодермосклероза, шансы системной терапии для достижения терапевтических концентраций значительно снижаются, тогда как серебряные соли способны обеспечить необходимую концентрацию за счет длительного сохранения в липидных тканях (Беликов В.Г. «Современные синтетические и природные лекарственные средства», Пятигорск, 2003 г.), (Применение препаратов серебра в медицине, Новосибирск, 1994 г, с.106).

Кроме того, известно бактерицидное действие как ионов серебра, так и нанокластеров серебра, способных образовываться из серебряной соли кристафона в организме человека. Известно, что нанокластеры серебра представляют собой специфические нанореакторы, действующие аналогично некоторым ферментам. Вероятно, за счет этой функции происходит повышение иммунотропной активности.

С другой стороны, хотя механизм бактерицидного действия пока точно не известен, полагают, что ионы серебра, высвобождаемые из липофильного соединения в липофильную среду, угнетают специфический фермент, который участвует в процессах метаболизма многих видов бактерий, вирусов и грибков.

Полученное соединение - серебряные соли кристафона - может использоваться как самостоятельное лекарственное средство, так и в различных соотношениях с кристафоном для усиления действия последнего.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения серебряной соли N-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5-пиримидинсульфон)-N'-изоникотиноилгидразида (кристафона).

Водную суспензию, содержащую 2 г (0,0061 моль) кристафона, предварительно обрабатывают ультразвуком при частоте 22-44 кГц до однородной дисперсии, добавляют серебра нитрат 4,2 г (0,0244 моль). Затем без доступа света реакционную смесь обрабатывают ультразвуком до получения объемного гомогенного осадка. Полученный осадок фильтруют, многократно промывают бидистиллированной водой и сушат в вакуумном сушильном шкафу (100-200 мм рт.ст.) при температуре 50-80°С. Получают порошок белого или белого с сероватым оттенком цвета. В полученной смеси обнаруживается 24,88 мас.% серебра, что соответствует 99,8 чистоты серебряной соли. Количество серебра определяли титрованием роданида аммония (метод Фольгарда) в среде разбавленной НNО₃ (ГФ X). В качестве индикатора применяют раствор железо-аммонийных квасцов. Титрование прекращают после появления не исчезающей при энергичном взбалтывании раствора окраски роданидного комплекса железа.

В ПМР-спектре серебряной соли кристафона после обработки в растворе AgNO₃ отмечается сдвиг протонов пиридинового кольца с 7,65 (кристафон) до 7,8 (серебряная соль кристафона) миллионных долей (далее м.д.), сдвиг триплетов СН₃ группы с 2,3-2,5 (кристафон) до 2,0 (серебряная соль кристафона) м.д., отсутствие изменений химических сдвигов протонов в гидразидной группе, принципиальные изменения части спектра пиримидинового фрагмента: интенсивность поглощения в серебряной соли кристафона уменьшилась вдвое по сравнению с кристафоном, в ПМР-спектре серебряной соли кристафона отмечается новый дуплет с =10,7; 10,8 м.д., и появляется новый синглет в области фенольной группы =5,2 м.д.

Структура серебряной соли кристафона была определена на основании сравнения ИК-спектров кристафона и его серебряной соли. Анализ ИК- спектров проводился по двум реперным полосам в области 3307 см^-1 и 1743 см ^-1 (СО в положении 2), характеризующим карбонильную группу в пиримидиновом цикле кето-формы кристафона, а также группы интенсивных полос в области 3200-3000 см^-1 (NH в положении 3). В ИК-спектре серебряной соли кристафона исчезает полоса 1743 см^-1, а интенсивность поглощения группы полос 3200-3000 см^-1 резко уменьшается, что свидетельствует об образовании серебряной соли кристафона.

Пример 2. Способ получения серебряной соли кристафона.

Водную суспензию, содержащую 1 г (0,003 моль) кристафона, предварительно тщательно перемешивают на механической мешалке 3000 об/мин до однородной дисперсии, добавляют серебра нитрат 1,03 г (0,006 моль). Затем без доступа света реакционную смесь перемешивают на механической мешалке до получения объемного гомогенного осадка. Полученный осадок фильтруют, многократно промывают бидистиллированной водой и сушат в вакуумном сушильном шкафу (100-200 мм рт.ст.) при температуре 50-80°С. Получают порошок белого или белого с сероватым оттенком цвета.

В полученной смеси обнаруживается 24,78 мас.% серебра, что соответствует 99,4 чистоты серебряной соли.

Анализ ПМР и ИК-спектров продуктов реакции в примере 1 и 2 показал идентичность обоих продуктов и их соответствие серебряной соли кристафона.

Пример 3. Способ получения серебряной соли кристафона.

Водную суспензию, содержащую 1 г (0,003 моль) кристафона, предварительно тщательно перемешивают на механической мешалке 1000-3000 об/мин до однородной дисперсии, добавляют серебра нитрат 0,516 г (0,003 моль). Затем без доступа света реакционную смесь перемешивают на механической мешалке до получения объемного гомогенного осадка. Полученный осадок фильтруют, многократно промывают бидистиллированной водой и сушат в вакуумном сушильном шкафу (100-200 мм рт.ст.) при температуре 50-80°С. Получают порошок белого или белого с сероватым оттенком цвета.

В полученной смеси обнаруживается 24,73 мас.% серебра, что соответствует 99,2 чистоты серебряной соли.

Анализ ПМР и ИК-спектров продуктов реакции в примере 1, 2 и 3 показал идентичность всех продуктов и их соответствие серебряной соли кристафона.

Примеры 4-5. Получение смесей кристафона и его серебряной соли.

Для доклинических исследований были использованы смеси чистого кристафона и серебряной соли кристафона с чистотой 98,3-99,5 при массовых соотношениях 50:50 (масс.%) (пример 4), 80:20 (масс.%) (пример 5).

Пример 6. Изготовление суппозиториев с серебряной солью кристафона, кристафоном и их смесями.

Из кристафона, серебряной соли кристафона (примеры 1-3) и их смесей, взятых в соотношении, указанном в примерах 4-5, были изготовлены суппозитории на полиэтиленоксидной основе и основе Витепсол массой по 1,5 г. Каждый суппозиторий содержит по 0,2 г субстанции (кристафона, его серебряной соли или их смеси).

Для изготовления суппозиториев в разогретую на водяной бане основу (до 60-70°С для полиэтиленоксидной основы и до 40-60°С для основы Витепсол) в количестве 13 г вводят предварительно растертый в ступке кристафон (или его серебряную соль, или их смесь) в количестве 2 г. Полученную смесь тщательно и интенсивно перемешивают до получения гомогенной суспензии. Полученную суспензию разливают по гнездам формы для изготовления суппозиториев, после застывания суппозитории извлекают из формы и упаковывают.

Пример 7. Результаты доклинических испытаний препаратов, содержащих кристафон, серебряную соль кристафона и их смесь на наличие антимикробной и противогрибковой активности в опытах in vitro.

Определение антимикробного и противогрибкового действия предлагаемых по изобретению субстанций и их комбинаций проводилось по стандартной методике, утвержденной МЗ Государственной фармакопеей, М., «Медицина», 1990 г., вып. 2, «Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье».

Испытания проведены в отношении:

S.aureus - музейный (контрольный штамм) номер 906, полученный из ГИСК им.Тарасевича;

E.coli М-17 - музейный (контрольный штамм) номер В-8208, полученный из ГИСК им.Тарасевича;

Ps.aeruginosae - изолят, выделенный от больного;

C.albicans - изолят, выделенный от больного.

Данные результатов испытания in vitro на S.aureus, E.coli, Ps.Aeruginosae, Candida albicams определения противомикробной, противогрибковой (противомикотической) активности серебряной соли кристафона и ее смеси с кристафоном сведены в таблицу 1.

Таблица 1
Препараты	S.aureus	E.coli	Ps.Aerugino sae	Candida albicams
Кристафон	++
Серебряная соль кристафона	+++	+++	+++	+
Кристафон:Серебряная соль кристафона 1:1	+++	+++	+++	+
Кристафон:Серебряная соль кристафона 4:1	++	+++	+++

Как видно из таблицы 1, серебряная соль кристафона обладает ярко выраженным антимикробным действием в отношении всех испытуемых культур и небольшим противогрибковым действием в отличие от кристафона, который проявляет активность только в отношении S.aureus.

Пример 8. Результаты доклинических исследований по изучению эффективности препаратов, содержащих серебряную соль кристафона, при лечении бактериальных вагинитов у крыс в сравнении с известным препаратом Бетадин, суппозитории вагинальные.

В качестве патогенов для инфицирования были выбраны S.aureus (типовой штамм 7М (ННИЭМ, Н.Новгород)) и Е.coli (штамм 782-2) как одни из наиболее частых возбудителей бактериальных вагинитов. Изучение микробиоцидной активности препаратов осуществляли методом серийных разведений согласно ранее описанным рекомендациям (Медицинская микробиология, 1999; Энциклопедия клинических лабораторных тестов, 1997; Лабораторные методы исследования в клинике, 1987).

В таблице 2 представлены результаты изменения цитологической картины влагалищных мазков крыс в баллах. При цитологическом исследовании придерживались следующих критериев при выставлении баллов: 1 - единичные бактериальные клетки; 2 - мало клеток; 3 - умеренное число клеток; 4 - много клеток.

Таблица 2
Препарат	Микрофлора, M±SEM
Через 5 дней после применения препарата	Через 10 дней после применения препарата
Серебряная соль кристафона	1,7±0,78	2,4±1,32
Кристафон:серебряная соль кристафона 1:1	2,3±0,97	2,7±1,08
Кристафон:серебряная соль кристафона 4:1	3±0,55	4±1,56
Кристафон	3±1,23	3,3±2,23
Контроль № 1 (без лечения)	4±0,56	4±0,25
Контроль № 2 (Бетадин)	3,4±0,88	3,3±0,76

Из полученных результатов видно, что для всех препаратов, содержащих серебряную соль кристафона, эффект больше, чем при отсутствии лечения или при лечении препаратом Бетадин.

Пример 9. Результаты микробиологических исследований.

При микробиологических исследованиях наиболее выраженное снижение S.aureus наблюдалось при использовании препарата, содержащего смесь кристафона и его серебряной соли в вагинальной полости крыс после инвагинального применения препаратов.

Таблица 3
Препарат	Снижение количества КОЕ S.aureus штамм 7М (в количество раз относительно исходного уровня заражения)	Снижение количества КОЕ Е.coli штамм 782-2 (в количество раз относительно исходного уровня заражения)
Через 5 дней после применения препарата	Через 10 дней после применения препарата	Через 5 дней после применения препарата	Через 10 дней после применения препарата
Серебряная соль кристафона	4,58±1,12	6,92±2,94	9,69±1,8	25,6±2,6
Кристафон: серебря ная соль кристафона 1:1	7,41±2,34	6,67±4,44	6,68±4,29	4,93±1,37
Кристафон: серебря ная соль кристафона 4:1	3,12±2,3	5,93±2,35	3,3±2,02	4,07±0,19
Кристафон	2,0±0,14	1,93±1,2	0,65±0,72	0,65±0,8
Плацебо	1,55±0,92	2,03±1,98	1,22±1,36	0,59±0,2
Бетадин	4,81±3,6	6,98±0,73	4,41±3,4	12,7±8,9

В ходе эксперимента у крыс контрольной (без лечения) группы наблюдались усиленные влагалищные выделения на 3-7 дни эксперимента. За период наблюдения животные опытных групп оставались подвижными, внешне выглядели здоровыми. Данные клинического осмотра свидетельствуют об отсутствии генерализованной септической системной реакции организма при инвагинальном инфицировании. Что касается рН влагалищной среды при вагинитах, а нормальная кислотность влагалищной среды у крыс близка к нейтральной рН=7 [Larsen et al., 1977], то в контрольной группе при развитии бактериального вагинита отмечено закисление среды (рН=6). В опытных же группах наблюдалось достоверное возвращение величины рН к нормальным значениям. В контрольной серии экспериментов без лечения слизистая оболочка влагалища представлена рыхлой соединительной тканью, покрытой неороговевающим плоским эпителием, имеющим неровную базальную мембрану за счет неглубокого акантоза. В слизистой оболочке отмечался умеренно выраженный воспалительный инфильтрат, распределяющийся диффузно в собственной пластинке. При лечении животных препаратами, содержащими серебряную соль кристафона и ее смесь с кристафоном, не отмечалось каких-либо паталогических изменений в структуре влагалища, явлений отека подлежащей соединительной ткани не обнаружено.

Серебряная соль кристафона в виде порошка или в виде порошка в капсулированной форме, где вспомогательным веществом является лактоза (результаты in vitro) и вагинальных суппозиториев (результаты доклиники), обладает близкой иммуномодулирующей, противомикробной, противогрибковой (противомикотической) активностью. Данные свойства будут также проявляться в препаратах в форме вагинальных и наружных мазей, а также будет проявляться общее иммуномодулирующее и противомикробное действие при пероральном применении в форме твердых желатиновых капсул и таблеток по аналогии с кристафоном и изофоном, дополнительно усиленное за счет наличия в молекуле атома серебра (в том числе по отношению к микобактериям туберкулеза и лепры).

Примеры рецептур других форм лекарственного средства представлены ниже. Капсулы: активное начало кристафон, его серебряная соль и их смеси, взятые в соотношении, указанном в примерах 4-5 - 100 мг, 200 мг, 500 мг, в первых двух случаях в качестве наполнителя использовалась лактоза.

Таблетки: активное начало кристафон, аргокристон и их смеси, взятые в соотношении, указанном в примерах 4-5 - 200 мг, наполнители: крахмал - 30 мг, тальк - 5 мг, лактоза - 15 мг.

Мазь: активное начало кристафон, его серебряная соль и их смеси, взятые в соотношении, указанном в примерах 4-5 - 3 г, основа: воск эмульсионный - 20 г, вазелиновое масло - 20 г, вазелин - 10 г, ПОЭ 400 - 10 г, вода дистиллированная - 37 г.

Учитывая широкий спектр противомикробной активности серебряной соли кристафона и его иммунотропные свойства, можно рекомендовать его для применения в медицинской практике специалистами - гинекологами, венерологами и урологами - для лечения заболеваний, передающихся половым путем, для лечения вагинитов, вагинозов различной природы, кожных заболеваний, обусловленных снижением иммунитета и развитием патогенной микрофлоры, а также для лечения грибковых заболеваний различной локализации.