способ определения локализации инфекций в мочеполовом тракте у мужчин

Формула изобретения

1. Способ определения локализации возбудителей инфекций в мочеполовом тракте у мужчин, включающий последовательный отбор проб мочи и секрета предстательной железы, выделенных при мочеиспускании и после массажа предстательной железы, гигиеническую обработку полового члена после каждой операции отбора, сопоставление количеств возбудителей инфекций в пробах, определение их локализаций в соответствии с количествами в пробах, отличающийся тем, что предварительно соскабливают эпителиальные клетки уретры из ладьевидной ямки - проба 1, вводят в уретру физраствор, собирают его при излитии - проба 2; отбирают среднюю порцию мочи при последующем полном мочеиспускании - проба 3, после чего вводят повторно в уретру физраствор и сливают его, затем массируют предстательную железу и собирают ее секрет - проба 4, а локализацию возбудителей инфекций определяют в каждой из отобранных проб по распределению количественного содержания их ДНК в пробах с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при отсутствии выделения из уретры секрета предстательной железы после ее массажа собирают в пробу постмассажную мочу.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, точнее к урологии и андрологии, и может быть использовано в процессе обследования и лечения пациентов с инфекциями в мочеполовом тракте у мужчин.

В качестве прототипа принят способ определения локализации инфекций в сегментах урогенитального тракта мужчин, предложенный Meares Е.М. и Stamey Т.А. [1]. Способ заключается в исследовании последовательно отобранных образцов биологического материала из урогенитального тракта мужчин, включающем бактериологический посев на кровяном агаре. В ходе обследования выявляют условно патогенные бактерии в первой (проба № 1) и средней (проба № 2) порциях мочи, в секрете предстательной железы (СПЖ) и моче, выпущенной сразу после массажа предстательной железы (пробы № № 3 и 4 соответственно). Позднее Nickel J.C. упростил данный способ, предложив исследовать лишь две порции мочи - пред- и постмассажную, что соответствует пробам № № 1 и 4 в методе Meares Е.М. и Stamey Т.А. [2]. Оба способа основаны на сравнительном анализе количества колониеобразующих единиц бактерий в 1 мл (КОЕ/мл) различных порций мочи и СПЖ. Если бактерий больше в первой порции мочи (проба № 1), считают, что бактериурия уретрального происхождения. Если микробы превалируют во второй порции мочи (проба № 2), подразумевают, что бактериурия преимущественно мочепузырной локализации. Наибольшие концентрации бактерий в СПЖ или в моче, выпущенной сразу после массажа предстательной железы (пробы № № 3 и 4) свидетельствуют в пользу простатической локализации микроорганизмов [1]. Равное число бактерий во всех пробах характеризует тотальную бактериурию.

Однако посев на кровяном агаре не позволяет обнаруживать микроорганизмы, приспособленные к внутриклеточному паразитизму (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы). Внедрение в практику новых лабораторных методов, таких как культуральный, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный, амплификационные (из них в первую очередь полимеразная цепная реакция - ПЦР), позволило выявлять в биологическом материале как сами микроорганизмы (хламидии, микоплазмы и уреаплазмы), так и отдельные их маркеры. Но с помощью этих методов наличие возбудителей скрытых инфекций определяли только качественно. Это делало невозможной оценку распространенности внутриклеточных микроорганизмов в генитальном тракте, так как считалось, что моча и секрет предстательной железы во время получения образцов могли заражаться при их пассаже через мочеиспускательный канал. Последнее обстоятельство препятствовало изучению этиологической роли данных возбудителей в развитии таких урологических заболеваний, как простатит и цистит.

С внедрением в практику метода ПЦР в реальном времени появилась возможность оценивать наличие возбудителей скрытых инфекций не только качественно, но и количественно.

Однако сама по себе количественная оценка числа указанных бактерий в одной отдельно взятой пробе недостаточна и не имеет существенных преимуществ по сравнению с ПЦР. Перспективно только сравнение концентрации бактерий или их маркеров в пробах из различных локализаций.

В данной заявке предлагается способ определения микробной локализации в мужском урогенитальном тракте и таких бактерий, как хламидии, микоплазмы и уреаплазмы. В основе метода лежит выявление фрагментов ДНК каждого возбудителя в различных последовательно полученных образцах генитального материала из различных локализаций в тракте. ДНК возбудителей выявляются известным методом ПЦР в реальном времени. Количество фрагментов ДНК оценивают числом их копий в 100 мкл объема исследуемого биологического материала.

Способ Meares E.M. и Stamey T.A. труден для реализации в практической работе [2, 4]. Этот метод имеет и другие недостатки. Во-первых, присутствие врача в момент сбора мочи у некоторых пациентов создает психологические трудности, в ряде случаев препятствующие началу мочеиспускания. Во-вторых, не все могут прервать мочеиспускание и уже до массажа предстательной железы опорожняют мочевой пузырь полностью. После этого собрать постмассажную мочу удается далеко не всегда. В-третьих, при искусственном прерывании мочеиспускания пациентом в момент сбора мочи возможен мочевой рефлюкс в виде ретроградного попадания мочи в семявыбрасывающие и простатические протоки и далее в ацинусы предстательной железы. Возможность подобного рефлюкса доказана клиническими наблюдениями [3]. Это может поставить под сомнение, что выявленные бактерии изначально локализовались в секрете предстательной железы, а не в моче из мочевого пузыря. В-четвертых, наличие возбудителя в первой порции мочи не позволяет точно дифференцировать уретральную локализацию от мочепузырной, так как моча, хотя и проходит через уретру, но поступает из мочевого пузыря.

Цель - повышение точности определения локализации в мочеполовом тракте у мужчин инфекционных микроорганизмов, в том числе и скрытых генитальных инфекций (хламидиоз, микоплазмоз и уреаплазмоз).

Сущность предложенного способа определения локализации инфекций в мочеполовом тракте у мужчин, включающего последовательный отбор проб мочи и секрета предстательной железы (СПЖ), выделенных при мочеиспускании и после массажа предстательной железы, гигиеническую обработку полового члена после каждой операции отбора, сопоставление количеств бактерий в пробах, определение их локализаций в соответствии с количествами в пробах, но при этом предварительно соскабливают пробу эпителиальных клеток уретры из ладьевидной ямки, вводят в уретру физраствор и собирают его в пробу при излитии. Затем отбирают среднюю пробу при последующем полном мочеиспускании. Далее опять вводят в уретру физраствор и собирают его при излитии. Затем массируют предстательную железу и собирают пробу ее секрета. Определяют локализации инфекций по распределению количественного содержания ДНК инфекций в пробах с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.

Описание предлагаемого метода. Все пробы исследуемого материала, за исключением порции мочи, отбирает врач. Для отбора материала используются только стерильные пробирки и контейнеры.

Описание чертежа. На чертеже изображен схематически пооперационный отбор проб в предлагаемом способе, где: 1 - соскоб из уретры. 2 - смыв из уретры, 3 - средняя порция мочи из мочевого пузыря, 4 - секрет простаты после промывания уретры, 4а - постмассажная моча (после промывания уретры).

Перед началом обследования пациента информируют о необходимости воздерживаться от мочеиспускания в течение 2-3 часов. Перед исследованием выполняют туалет наружных половых органов. Головку полового члена обрабатывают мыльным раствором, обмывают водой до полного удаления мыльного раствора и вытирают насухо. Крайнюю плоть заводят за головку полового члена. Стерильной одноразовой щеточкой соскабливают из ладьевидной ямки мочеиспускательного канала эпителиальные клетки уретры (проба № 1). Пробу переносят в стерильный эппендорф со стерильной транспортной средой. Далее в уретру вводят 5 мл стерильного физраствора. Несколько секунд спустя пациент сливает его в стерильный контейнер (проба № 2). Отверстие мочеиспускательного канала осушают гигиенической салфеткой. Затем пациент полностью опорожняет мочевой пузырь. Во время мочеиспускания собирают приблизительно 50 мл средней порции мочи в стерильный контейнер, 5-10 мл этой мочи отливают в другой стерильный контейнер, направляемый в лабораторию (проба № 3). Далее пациент осушает гигиенической салфеткой наружное отверстие мочеиспускательного канала от остатков мочи. После этого в уретру вновь вводят 5 мл стерильного физраствора, несколько секунд спустя затем сливаемого в отдельный контейнер (данная проба не исследуется). Вновь тщательно осушают гигиенической салфеткой наружное отверстие мочеиспускательного канала.

Для получения СПЖ железу массируют по общепринятой методике. Удерживают крайнюю плоть за головкой полового члена и одновременно фиксируют стерильный контейнер с широким горлом напротив мочеиспускательного отверстия. После выделения СПЖ и его сбора в контейнер стерильной щеточкой СПЖ переносят в эппендорф с транспортной средой для ПЦР (проба № 4). Каждую из отобранных проб ( № № 1-4) исследуют раздельно методом ПЦР в реальном времени для выявления фрагментов ДНК искомых возбудителей. Когда получить СПЖ не удается, после массажа простаты собирают постмассажную мочу (проба № 4а).

Интерпретация результатов лабораторных исследований основывается на количественных различиях содержания ДНК возбудителей инфекций в пробах из различных сегментов мочеполового тракта (таблица 6; чертеж).

Пример № 1. Пациент С., 26 лет обратился с жалобами на увеличение размеров правого яичка в течение последних 6 месяцев, изменение макроскопических характеристик эякулята. При осмотре было выявлено, что размеры придатка правого яичка увеличены, а сам придаток отечный и болезненный при пальпации. Установлен диагноз: хронический правосторонний эпидидимит. Методом ПЦР в реальном времени в уретральном соскобе были обнаружены Mycoplasma hominis (1,1×l0⁴ копий ДНК/100 мкл), Ureaplasma urealyticum (2,2×10 ³ копий ДНК/100 мкл). При обследовании предложенным способом М. hominis обнаружены по ходу всей уретры и в мочевом пузыре с максимальным количеством возбудителя в ладьевидной ямке, a U. urealyticum обнаружены только в ладьевидной ямке уретры. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Результаты обследования пациента С., 26 лет.
Номер пробы	Вид инфекции	Локализация выявленных инфекций
М. hominis (количество копий ДНК в 100 мкл материала)	U. urealyticum (количество копий ДНК в 100 мкл материала)
1	1,1(104)	5,0(103)	М. hominis обнаружены по ходу всей уретры и в мочевом пузыре с максимальным количеством возбудителя в ладьевидной ямке. В СПЖ возбудители не выявлены. U. urealyticum обнаружены только в ладьевидной ямке уретры.
2	3,8(102 )	не обнаружены
3	7,2(102)	не обнаружены
4	не обнаружены	не обнаружены

Пример № 2. Пациент Г., 21 год, обратился с жалобами на выделения из уретры, боль и резь при мочеиспускании, частые позывы к мочеиспусканию. Первичное заражение произошло за 4 месяца до обращения. В течение прошедших 4-х месяцев пациент дважды обращался за медицинской помощью и прошел 2 курса антибактериальной терапии. У постоянной половой партнерши при первичном обследовании хламидии не были выявлены, и она в течение 4-х месяцев никакого лечения не получала. Это, вероятно, являлось причиной повторного инфицирования пациента. При осмотре пациента выявлены обильные прозрачные слизистые выделения из уретры. Установлен диагноз: генитальная хламидийная инфекция, хронический уретрит, хронический простатит в стадии обострения. Методом ПЦР в уретральном соскобе были обнаружены С.trachomatis. Хламидийная инфекция была подтверждена серологическим методом. Возбудители других заболеваний, передаваемых половым путем, не были выявлены. При обследовании предложенным способом С.trachomatis были выявлены по всей протяженности уретры, в мочевом пузыре и предстательной железе. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты обследования пациента Г., 21 год.
Номер пробы	Вид инфекции	Локализация выявленных инфекций
С.trachomatis (количество копий ДНК в 100 мкл материала)
1	4,6(104)	Вся уретра, мочевой пузырь и предстательная железа инфицированы С.trachomatis
2	4,8(103 )
3	2,6(103)
4	2,4(103 )

Пример № 3. Пациент Г., 23 года, обратился с жалобами на выделения из уретры. Заражение произошло за 2 недели до обращения. При осмотре пациента выявлены скудные слизистые выделения из уретры, гиперемия кожи головки полового члена и крайней плоти. Установлен диагноз: генитальная инфекция, уретрит, баланопостит. Методом ПЦР в реальном времени в уретральном соскобе были обнаружены С.trachomatis (6,6×10² копий ДНК/100 мкл). Хламидийная инфекция была подтверждена серологическим методом. Возбудители других заболеваний, передаваемых половым путем, не были выявлены. При обследовании предложенным способом было установлено, что хламидии локализуются в ладьевидной ямке уретры, в мочевом пузыре и отсутствуют в СПЖ. Результаты обследования представлены в таблице 3.

Таблица 3
Результаты обследования пациента Г., 23 года.
Номер пробы	Вид инфекции	Локализация выявленных инфекций
С.trachomatis (количество копий ДНК в 100 мкл материала)
1	5,6(103)	С.trachomatis локализуются в слизистой оболочке ладьевидной ямки мочеиспускательного канала и в мочевом пузыре; С.trachomatis не обнаружены в СПЖ.
2	не обнаружены
3	3,2(104)
4	не обнаружены
4а*	7,6(102)
*постмассажная моча.

Пример № 4. Пациент Г., 33 лет обратился с жалобами на выделения из уретры в течение нескольких недель. При осмотре пациента выявлены скудные прозрачные слизистые выделения из уретры и незначительная гиперемия кожи головки полового члена. Установлен диагноз: генитальная инфекция, хронический уретрит. Методом ПЦР в реальном времени в уретральном соскобе были обнаружены М. genitalium. Возбудители других заболеваний, передаваемых половым путем, не были выявлены. При обследовании предложенным способом было установлено, что М. genitalium были выявлены по ходу всей уретры и в мочевом пузыре и не обнаружены в СПЖ. Результаты обследования пациента по предлагаемому методу до лечения и через один месяц после него представлены в таблице 4.

Таблица 4
Результаты обследования пациента Г., 33 лет.
Номер пробы	М. genitalium (количество копий ДНК в 100 мкл материала)	Локализация выявленных инфекций
До лечения	Через 1 месяц после лечения
1	4,4(103 )	1,6(102 )	До лечения - М. genitalium были выявлены по ходу всей уретры и в мочевом пузыре. Обнаружение фрагментов ДНК М. genitalium в СПЖ могло быть связано с инфицированием СПЖ при его пассаже через уретру. После лечения - М genitalium были обнаружены только в ладьевидной ямке уретры. Последнее могло быть связано либо с недостаточно эффективным лечением, либо с повторным инфицированием пациента.
2	5,4(104 )	не обнаружены
3	7,2(104)	не обнаружены
4	4,2(102 )	не обнаружены

Пример № 5. Пациент Ж., 25 лет обратился с жалобами на периодическую боль в мошонке, выделения из уретры в течение нескольких месяцев. При осмотре пациента гиперемия кожи крайней плоти и головки, отечность, повышенное образование смегмы. Установлен диагноз: генитальная инфекция, хронический простатит, баланопостит. Методом ПЦР в уретральном соскобе были обнаружены С.trachomatis. Возбудители других заболеваний, передаваемых половым путем, не были выявлены. При обследовании предложенным способом было установлено, что С.trachomatis локализуются во всем мочеиспускательного канале и в мочевом пузыре. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5
Результаты обследования пациента Ж., 25 лет.
Номер Пробы	Вид инфекции	Локализация выявленных инфекций
С.trachomatis (количество копий ДНК в 100 мкл материала)
1	1,8(103)	С.trachomatis локализуются во всем мочеиспускательного канале и в мочевом пузыре; СПЖ после массажа предстательной железы выделить не удалось.
2*	1,8(104 )
3**	1,1(103)
4	не получен
4а***	1,2(10 4)
* моча; ** смыв; *** постмассажная моча.

Таблица 6
Интерпретация результатов исследования методом ПЦР в реальном времени проб, последовательно получаемых из урогенитального тракта мужчин.
Пробы с максимальным количеством копий бактериальной ДНК в 100 мкл объема исследуемого материала	Локализация возбудителя в мужском урогенитальном тракте
Проба 1 (соскоб из уретры)	Ладьевидная ямка уретры
Проба 2 (смыв из уретры, полученный до мочеиспускания)	Весь мочеиспускательный канал
Проба 3 (средняя порция мочи)	Мочевой пузырь
ДНК бактерий выявлены в пробах 1-3 и не обнаружены в секрете предстательной железы (СПЖ)	- Мочеиспускательный канал и мочевой пузырь - Предстательная железа не инфицирована.
Проба 4 (СПЖ)	Предстательная железа
Все пробы (1-4)	Тотальное инфицирование мочеиспускательного канала, мочевого пузыря и предстательной железы
Проба 4а (постмассажная моча)	Если в СПЖ возбудитель не обнаружен или концентрация фрагментов его ДНК на один или несколько порядков меньше, чем в постмассажной моче, следует считать, что инфицирован мочевой пузырь.

Примечание: обнаружение в СПЖ (проба № 4) ДНК возбудителей скрытых инфекций в количестве, на один или несколько порядков меньшем, чем в пробах № № 1, 2 и 3, не позволяет в полной мере утверждать, что обнаруженные микроорганизмы локализуются в предстательной железе. Однако отрицательные результаты при исследовании СПЖ некоторых пациентов, у которых возбудитель выявляется в уретре и моче, позволяют думать, что инфицирование предстательной железы существует даже тогда, когда концентрация фрагментов микробной ДНК в СПЖ меньше, чем в уретре или моче.

Приведенные примеры использования заявляемого способа доказывают достижение поставленной цели - повышение точности определения наличия и локализации микроорганизмов в мочеполовом тракте у мужчин. Это способствует повышению эффективности и контроля лечения выявленных инфекционных заболеваний.

Литература

1. Meares E.M., Stamey T.A. Bacteriologic localization patterns in bacterial prostatitis and urethritis. Invest. Urol. 1968; 5:492-518, (прототип).

2. Nickel J.C. The pre and post massage test (PPMT) a simple screen for prostatitis. Thech. Urol. 1997; 3:38-43.

3. Persson B.E., Ronquist G. Evidence for a mechanistic association between nonbacterial prostatitis and levels of urate and creatinine in expressed prostatic secretion. J. Urol. 1996; 155:958-960.

4. Domingue G.J., Hellstrom W.J.G. Prostatitis. Clin, Microb. Rev. 1998; 11(4):604-613.