способ определения 5-фторурацила в крови

Формула изобретения

Способ определения 5-фторурацила в крови, характеризующийся тем, что проводят экстракцию 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной в круглодонной колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 ч, затем экстракт охлаждают, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин и фильтруют, после чего фильтрат хроматографируют в колонках с окисью алюминия высотой 10 см и диаметром колонки 0,7 см в течение 5-6 ч, определяют спектрофотометрически наличие в элюате 5-фторурацила, который имеет максимум поглощения при длине волны 266 нм в ультрафиолетовом спектре от 200 до 350 нм, а его количественное содержание определяют по формуле



где С - концентрация вещества, %;

D - оптическая плотность;

b - разведение;

E^1% _cv - удельный показатель поглощения;

а - объем крови, мл.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для терапевтического мониторинга, то есть уровня 5-фторурацила в процессе курсовой терапии с целью контроля за поддержанием эффекта и безопасного уровня 5-фторурацила, а также для дальнейшего изучения метаболизма, фармакокинетики, различных лекарственных форм 5-фторурацила с целью расчета доз, кратности введения, и его сочетания с другими лекарственными препаратами для более эффективного лечения различных заболеваний в области онкологии.

Известен способ определения концентрации лекарственного препарата, в том числе 5-фторурацила, в биологических средах человека при лечении онкологических больных, который состоит в исследовании образцов биологических сред человека, взятых до и после сеанса терапии, причем биологическую среду подготавливают для образца, снимают инфракрасные спектры с образцов и после анализа их кривых, взятых до и после терапии, оценивают индивидуальную чувствительность к терапевтическому воздействию, при этом предварительно, зная исходную концентрацию, определяют дозу вводимого лекарственного препарата, определяют оптическую активность лекарственного препарата, снимают предварительную кривую ПК спектра пропускания образца биологической среды до введения лекарственного препарата, получая калибровочную кривую, снимают кривую ИК спектра пропускания образца биологической среды после введения лекарственного вещества через контрольные промежутки времени для определения концентрации препарата, делают вывод о чувствительности или об интактности конкретной опухоли на данном этапе и времени ее развития к конкретному лекарственному препарату при химиотерапии злокачественной опухоли, причем снятие кривой спектра пропускания образца ведут через промежутки времени, кратные времени рецикла крови и выбранные либо равномерными, либо переменными, либо в их комбинации, получают серию кривых спектра пропускания образца биологической среды при облучении инфракрасным излучением, измеряя величину поглощения на длинах волн в интервале от 1 до 50 мкм, выделенных в соответствии с оптической активностью лекарственного препарата, осуществляют сравнительный анализ динамики темпа выведения лекарственного препарата на основании измерений коэффициентов пропускания в инфракрасном диапазоне длин волн образцов между собой с учетом калибровочной кривой, после компьютерной обработки определяют абсолютные значения концентрации лекарственного препарата на основании сравнительного анализа данных проб, взятых через контрольные промежутки времени (патент RU 2297630, 2007 г.).

Известно качественное определение 5-фторурацила в лекарственной форме - 5% растворе для инъекций методом УФ-спектрофотометрии и тонкослойной хроматографии и количественное определение спектрофотометрическим методом («Фторурацил раствор для инъекций 5%» ФСП 42-0002185401). Данная методика качественного и количественного определения, основанная на экстракции в 1М растворе кислоты хлористо-водородной и спектрофотометрическом методе, является наиболее близким аналогом к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату.

Однако данный метод неприменим для определения 5-фторурацила в крови.

Задачей изобретения является разработка способа качественного и количественного определения 5-фторурацила в крови.

Технический результат при использовании изобретения - определение концентрации 5-фторурацила в крови.

Предлагаемый способ определения 5-фторурацила в крови осуществляется следующим образом. 1 мл крови животного, которому был введен препарат, помещают в сухую мерную колбу емкостью 25 см³ и доводят до объема 0,1М раствором кислоты хлористо-водородной. Полученный раствор помещают в круглодонную химическую колбу емкостью 50 см³, закрывают обратным холодильником и проводят экстракцию на водяной бане при температуре 80°С в течение 1 часа. Экстракт охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют при 5000 об/мин 15 минут. Прозрачную жидкость сливают с осадка и фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента». Фильтрат пропускают через подготовленные хроматографические колонки с оксидом алюминия. Для подготовки хроматографических колонок берут полые стеклянные трубки диаметром 0,7 см, высотой 10 см, заполняют окисью алюминия (ГФ X, с.867) и элюируют водой очищенной до получения прозрачного элюата - сравнение с эталоном (ГФ XI, с.198).

Время прохождения фильтрата через колонку составляет 5-6 часов.

Получен спектр 5-фторурацила в 0,1М растворе кислоты хлористо-водородной методом спектрофотометрии на приборе HEWLETT PACKARD 8452A при длине волны 266 нм в кювете толщиной рабочего слоя 1 см (Фиг.1). Контролем служит раствор 0,1М кислоты хлористо-водородной.

В элюате присутствие 5-фторурацила определяют спектрофотометрически. Полученный элюат в ультрафиолетовом спектре в области от 200 до 350 нм имеет максимум поглощения при длине волны 266 нм в кювете толщиной рабочего слоя 1 см.

Качественное и количественное определение 5-фторурацила в элюате проводят спектрофотометрически на приборе HEWLETT PACKARD 8452A при длине волны 266 нм в кювете толщиной рабочего слоя 1 см. Контролем служит элюат плацебо. Рассчитывают содержание 5-фторурацила по формуле:

где С - концентрация вещества, в %,

D - оптическая плотность,

b - разведение,

Е^1% _cv - удельный показатель поглощения,

а - объем крови, мл.

Предлагаемое изобретение было апробировано на белых беспородных крысах самцах средней массой 270 г. Опытным животным 5-фторурацил вводился инъекционно в виде 5% раствора из расчета 50 мг/кг или 0,96 мг/0,27 кг и был качественно обнаружен в крови. 5-фторурацил был обнаружен для последующего количественного определения его в крови при различных путях введения, что имеет большое значение для изучения методов лечения различных онкологических заболеваний, их коррекции, титрования доз.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими фигурами: на фиг.1 изображен спектр 5-фторурацила в 0,1М растворе кислоты хлористо-водородной при максимуме поглощения 266 нм; на фиг.2 - спектр 5-фторурацила при извлечении из крови в 0,1М растворе кислоты хлористо-водородной при максимуме поглощения 266 нм; на фиг.3 - спектр 5-фторурацила в воде очищенной при максимуме поглощения 266 нм; на фиг.4 - спектр 5-фторурацила в смеси растворителей: воды очищенной и 0,1М раствора кислоты хлористо-водородной в соотношении 1:1 при максимуме поглощения 266 нм.

Пример 1. Способ определения 5-фторурацила в крови осуществляется следующим образом. 1 мл крови животного, которому был введен препарат, помещают в сухую мерную колбу емкостью 25 см³ и доводят до объема 0,1М раствором кислоты хлористо-водородной. Полученный раствор помещают в круглодонную химическую колбу емкостью 50 см³, закрывают обратным холодильником и проводят экстракцию на водяной бане при температуре 80°С в течение 1 часа. Экстракт охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют при 5000 об/мин 15 минут. Прозрачную жидкость сливают с осадка и фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента». Фильтрат пропускают через подготовленные хроматографические колонки с оксидом алюминия. Для подготовки хроматографических колонок берут полые стеклянные трубки диаметром 0,7 см, высотой 10 см, заполняют окисью алюминия (ГФ X, с.867) и элюируют водой очищенной до получения прозрачного элюата - сравнение с эталоном (ГФ XI, с.198).

Время прохождения фильтрата через колонку составляет 5-6 часов.

В элюате присутствие 5-фторурацила определяют спектрофотометрически. Полученный элюат в ультрафиолетовом спектре в области от 200 до 350 нм имеет максимум поглощения при длине волны 266 нм в кювете толщиной рабочего слоя 1 см.

Качественное и количественное определение 5-фторурацила в элюате проводят спектрофотометрически на приборе HEWLETT PACKARD 8452A при длине волны 266 нм в кювете толщиной рабочего слоя 1 см (Фиг.2). Контролем служит элюат плацебо. Рассчитывают содержание 5-фторурацила по формуле:

где С - концентрация вещества, в %,

D - оптическая плотность,

b - разведение,

Е^1% _cv - удельный показатель поглощения,

а - объем крови, мл.

Пример 2. Способ определения фторурацила из крови осуществляется следующим образом. 1 мл крови животного, которому был введен препарат, помещают в сухую мерную колбу емкостью 25 см³ и доводят до объема водой очищенной. Далее проводят определение 5-фторурацила по методике примера 1 (Фиг.3).

Спектр поглощения 5-фторурацила в элюате свидетельствует о наличии препарата в крови. Однако обозначение максимума поглощения 5-фторурацила при длине волны 266 нм нечеткое. Наличие белков крови в образцах препятствует объективному выявлению максимума поглощения 5-фторурацила при длине волны 266 нм.

Пример 3. Способ определения фторурацила из крови осуществляется следующим образом. 1 мл крови животного, которому был введен препарат, помещают в сухую мерную колбу емкостью 25 см³ и доводят до объема смесью растворителей воды очищенной и 0,1М раствором кислоты хлористо-водородной в соотношении 1:1. Далее способ определения 5-фторурацила из крови проводят по методике примера 1 (Фиг.4).

Спектр поглощения 5-фторурацила в элюате свидетельствует о наличии препарата в крови. Однако обозначение максимума поглощения 5-фторурацила при длине волны 266 нм нечеткое. Наличие белков крови в образцах препятствует объективному выявлению максимума поглощения 5-фторурацила при длине волны 266 нм.

Из приведенных примеров видно, что оптимальным качественным анализом 5-фторурацила в крови, является методика, описанная в примере 1.