способ создания восстановителей фертильности ярового рапса (brassica napus l.)

Формула изобретения

Способ создания восстановителей фертильности ярового рапса in vitro, включающий введение эксплантов в культуру, получение гаплоидных растений, их диплоидизацию, корнеобразование и пересадку в грунт, отличающийся тем, что проводят предобработку центральных кистей растений со стерильной цитоплазмой и генами восстановления фертильности температурой 4-6°С в течение суток, вводят в культуру неоплодотворенные семязачатки с бутонов длиной 2-4 мм, культивируют на питательной среде MS с добавлением 1 мг/л кинетина, 0,2 мг/л НУК и 0,1 мг/л 2,4-Д, осуществляют стабилизацию и микроразмножение гаплоидных линий, диплоидизацию путем добавления 0,005% раствора колхицина в питательную среду; укорененные растения пересаживают в грунт, где они формируют семена, которые высевают в поле для получения растений-восстановителей фертильности.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности, к селекции и может быть использовано в сельскохозяйственной биотехнологии при культивировании неоплодотворенных семязачатков для получения нового исходного гомозиготного материала для гетерозисной селекции.

Известен аналогичный заявленному способ получения восстановителей фертильности ярового рапса, включающий скрещивание стерильной линии с восстановителем фертильности, проведение возвратных скрещиваний в течение 5-7 поколений для создания фертильного аналога стерильной линии, затем самоопыление в течение еще одного поколения для перевода гена восстановления (Rf) в гомозиготное состояние (McVetty P.B.E. Hybrid canola seed production in Western Canada using the POL CMS system / P.B.E McVetty, R. Scarth, S.R.Rimmer; R. Pinnisch // Proc. of the 9^th Intern. Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7.07.1995 - Vol.1. - P.104-106). Недостатком метода является длительность процесса создания гомозиготных линий (5-7 лет).

Наиболее близким из известных, принятым за прототип, является способ получения гомозиготного материала ярового рапса путем культивирования изолированных пыльников в условиях in vitro, заключающийся в введении эксплантов в культуру, получении гаплоидных растений, их диплоидизации, корнеобразовании и пересадке в грунт (Dunwell J. M., Cornish M., De Courcel A.G.LJ and Middlefell-Williams J.E. Induction and growth of microspore derived embryos of Brassica napus ssp. oleifera // J. Exp.Bot. - 1983. - Vol.34, № 12. - P.1768-1778).

Недостатком данного метода является невозможность получения исходного материала ярового рапса для гетерозисной селекции на основе цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС), т.к. эксплантом являются пыльники, а у растений с ЦМС пыльца стерильна. В связи с этим сохранение материнской цитоплазмы возможно только с помощью культивирования неоплодотворенных семяпочек in vitro. В ходе проведения патентного поиска авторами не обнаружено аналогичных исследований для ярового рапса.

Задачей изобретения является создание исходного материала для гетерозисной селекции на основе ЦМС.

В гетерозисной селекции основным требованием, предъявляемым к родительским компонентам, является их гомозиготность по большинству генов. Одним из путей получения гомозиготных линий ярового рапса является гаплоидия - явление возникновения особей с гаметическим числом хромосом. С помощью методов биотехнологии гаплоиды получают из репродуктивных клеток при культивировании изолированных пыльников или неоплодотворенных семяпочек на искусственных питательных средах. При этом процесс формирования гомозиготных линий ускоряется по сравнению с традиционными методами селекции в 5-7 раз.

Предлагается способ создания восстановителей фертильности ярового рапса с помощью культивирования неоплодотворенных семяпочек in vitro. Развитие семяпочек идет по пути образования каллуса с формированием на нем ростовых почек с последующим их развитием в растения.

Указанный способ включает в себя следующие операции:

1. Донорским материалом являются гибриды между стерильным образцом и восстановителями фертильности.

Бутоны предпочтительно брать с центральной кисти, так как по сравнению с побегами первого и второго порядков они обладают максимальной способностью к каллусообразованию (5,7%) и регенерации (1,3%). Для изолирования семязачатков используются бутоны длиной 2-4 мм с центральной кисти основного побега ярового рапса, частота образования каллуса у которых составляет 3,3%, а выход регенерантов достигает 0,7% (фиг.1).

2. Предобработку соцветий донорского материала для увеличения индуцирующей способности неоплодотворенных семязачатков перед стерилизацией следует проводить пониженной температурой +4-6°С в течение суток (фиг.2).

3. Для стерилизации бутонов ярового рапса наряду с 7%-м раствором Domestos используются экологически чистые электроактивированные водные растворы анолит и смесь анолита с католитом (рН=7), ускоряющие развитие неоплодотворенных семяпочек ярового рапса в культуре in vitro (табл.1).

Таблица 1 Эффективность стерилизации бутонов различными дезинфицирующими веществами при введении неоплодотворенных семязачатков ярового рапса в культуру in vitro (2004-2005 г.)
Дезинфицирующий раствор	Концентрация раствора, %	Инфицировано семязачатков, %	Получено регенерантов, %	Развитие регенерантов (по 5-бальной шкале)
грибной инфекцией	бактериальной инфекцией
Хлорамин	7	9,8	21,1	0,8	3
10	0	0	2,5	3
Domestos	5	0	12,5	4,2	3
7	0	0	8,0	5
10	0	0	5,1	4
Анолит	рН=6	0	0	12,7	5
Анолит+католит	рН=7	0	0	21,0	5
рН=9	0	0	14,5	5

4. Культивирование неоплодотворенных семязачатков осуществляется на питательной среде MS, содержащей 1 мг/л кинетина, 0,2 мг/л НУК и 0,1 мг/л 2,4-Д при 16-часовом фотопериоде и освещенности 5 тыс. люкс. Образовавшиеся на каллусе ростовые почки переносятся на безгормональную среду, на которой происходит регенерация гаплоидных проростков.

5. Стабилизация гаплоидов осуществляется одновременно с микроразмножением и проводится в течение 3-4 пассажей с чередованием ростовой (ГК, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л) - безгормональной - ростовой сред для нормально развитых регенерантов, и безгормональной - ростовой - безгормональной для слабо развитых регенерантов.

6. Диплоидизация гаплоидного материала осуществляется путем добавления в питательную среду 0,005% колхицина и выдержке на ней эксплантов в течение 48 часов. Стабилизация колхицинированных растений ведется при последующем культивировании на питательной среде, содержащей 0,25 мг/л кинетина, в течение месяца.

8. Формирование корней осуществляется при культивировании микроклонов на среде с 1 мг/л НУК. Затем следует пересадить растения в грунт, где они формируют семена.

9. Семена полученных линий высеваются в поле и собранной с них пыльцой проводится опыление форм с ЦМС для анализа способности восстанавливать фертильность.

В результате применения метода культуры неоплодотворенных семязачатков получены линии, донорские растения которых имели стерильную цитоплазму типа Polima и гены восстановления фертильности. В условиях теплицы и поля полученные растения цвели и после опыления их пыльцой формы, обладающей ЦМС, завязались семена.

10. Семена полученных растений высеваются в поле и проводится анализ фертильности пыльцевых зерен.

Полученные семена были высеяны в теплице, и у растений в период цветения проведен анализ фертильности, позволивший выявить 87,3-94,5% фертильных пыльцевых зерен (табл.2).

Установлено, что фертильность донорского растения № 8 повысилась в результате индуцирования гаплоидии в культуре неоплодотворенных семязачатков in vitro с 78,7% до 94,5%, что свидетельствует о том, что линия РЛ 8 может быть использована в качестве восстановителя фертильности в гетерозисной селекции ярового рапса.

Таблица 2 Фертильность пыльцевых зерен линий, полученных в культуре неоплодотворенных семязачатков
№ растения	Просмотрено
Всего, шт.	фертильных пыльцевых зерен
шт.	%
Контроль	2357	1854	78,7
РЛ 8/1	643	575	89,4
РЛ 8/2	754	658	87,3
РЛ 8/3	689	651	94,5
РЛ 8/4	725	668	92,1
РЛ - реституционная линия, полученная в культуре неоплодотворенных семязачатков	НСР 05=0,15

Разработанный способ получения восстановителей фертильности в течение 1-1,5 лет может обеспечить получение необходимого объема растений ярового рапса для включения в селекционный процесс.

Данный подход к получению восстановителей фертильности возможен и для других видов культурных растений, у которых семеноводство гетерозисных гибридов осуществляется на основе ЦМС.