способ получения биологически активной добавки "мобелиз" и полученная этим способом бад "мобелиз"

Формула изобретения

1. Биологически активная добавка, содержащая лактопероксидазу, лактоферрин, ангиогенин, панкреатическую РНКазу, лизоцим молочный и лизоцим куриного яйца при следующем соотношении, мг:

Лактопероксидаза	17,9±1,2
Лактоферрин	10,3±1,4
Ангиогенин	0,9±0,1
Панкреатическая РНКаза	2,7±0,1
Лизоцим молочный	0,09±0,01
Куриный лизоцим	65,8±3,6

2. Способ получения биологически активной добавки по п.1, включающий очистку молочного сырья центрифугированием, сорбцию белков на ионообменнике, хроматографическое их разделение, элюирование, определение фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., диализ полученной белковой фракции проводят против физиологического раствора, фосфатного буфера или дистиллированной воды, стабилизацию и микробиологическую очистку осуществляют микрофильтрацией через полупроницаемые мембраны 0,22-0,45 мкм, из полученных катионных сывороточных белков молока, а именно лактопероксидазы, лактоферрина, ангиогенина, панкреатической РНКазы, молочного лизоцима составляют композицию с куриным лизоцимом при соотношении компонентов 1:2 соответственно при температуре плюс 20±2°С, замораживают при температуре минус 35-40°С, подвергают сублимационному высушиванию с максимальной температурой досушки плюс 37±2°С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской, фармацевтической, косметической промышленности, а именно к способам получения биологически активных веществ, которые могут использоваться в качестве биологически активных добавок (БАД).

Известна антибактериальная композиция, содержащая в качестве активных компонентов аполактоферрин и лизоцим [Патент JP 62249931 (Япония). / Антибактериальная композиция. / Оконоги Шигео (JP); Кийозава Исао (JP); Кудо Цутомо (JP); Кавасе Козо (JP); Такасе Митсунори (JP); Озава Казухиро (JP); Ямаучи Коджи (JP)]. Композиция применяется для лечения инфекционных болезней и подавления пролиферации вредных бактерий в кишечнике, а также оказывает профилактическое действие на организм человека. Композиция содержит в качестве активных компонентов аполактоферрин и лизоцим в соотношении 5:95-95:5.

Известен способ получения биологически активного продукта из молозива [Патент CN 1112394 (Китай). / Способ приготовления биологически активного продукта из молозива коров. / Жаокуоун Денг (CN); Юниян Лю (CN); Лю Шенгву (CN)]. Способ включает следующие последовательные операции: удаление жира и казеина центрифугированием, добавление пепсина или соляной кислоты, удаление сгустка центрифугированием, осаждение иммуноглобулина насыщенным сульфатом аммония или гиперфильтрацией, сбор и отделение иммуноглобулина и лизоцима. Полученный продукт обладает значительным действием для профилактики и лечения диареи, а также хронических бронхитов у новорожденных. Недостатком данного способа является то, что при добавлении пепсина или соляной кислоты часть биологически значимых компонентов молозива теряет свою активность.

В Японии запатентовано антибактериальное средство [Патент JP 6199698 (Япония) / Антибактериальное средство и способ обработки антибактериальным средством. / Томита Мамору (JP); Ямаучи Кочи (JP)]. Целью работы являлось получение антибактериального средства, обладающего антибактериальным действием в отношении широкого спектра микроорганизмов и пригодного для использования в технологиях консервирования пищевых продуктов без ухудшения вкуса и запаха путем использования в качестве активных компонентов лактоферрина или его антибактериального пептида, а также лизоцима. Средство получали путем использования водного раствора лактоферрина, выделенного из коровьего молока, последующего добавления 1 н соляной кислоты до pH 2, нагревания до 120°С в течение 15 минут и охлаждения, смешения с лизоцимом, используемым в качестве активного компонента, добавления наполнителя, формования в форме парафармацевтиков. К недостаткам данного способа можно отнести то, что используемые условия обработки лактоферрина с применением низких значений pH в сочетании с высокотемпературной обработкой приводят к частичной потере его активности.

Японскими учеными запатентован в России способ получения продукта, содержащего «активные молочно-белковые компоненты», и продукт, полученный этим способом (варианты) [Патент № 21-6785 (Россия). Способ получения продукта, содержащего активные молочно-белковые компоненты, и продукт, полученный этим способом (варианты). / Йосиказу Юки (JP), Кумико Теразава (JP), Томойо Накагава (JP), Казуо Кате (JP)]. Целью разработанного способа является получение для недоношенных детей продуктов, получаемых из грудного или коровьего молока и содержащих активные молочные белковые компоненты, а именно иммуноглобулины, лактоферрин и лизоцим. Эти продукты также могут быть использованы в качестве добавки к грудному молоку и как фармацевтические продукты, например, при терапии неподдающегося поноса. Авторы патента термин «активные белковые компоненты» используют для обозначения любого белка, который в минимальных количествах проявляет физиологические и фармакологические свойства. Продукты получают по способу, состоящему из стадий добавления к молочной плазме или сыворотке сахарного спирта, или дисахарида, или стабилизатора, состоящего из дисахарида и аминокислоты (глицин), и проведения термообработки полученной смеси при pH 6-8, при примерно 60°С в течение около 10 ч; продукты, содержащие активные компоненты молочного белка, представляют собой осадок, образовавшийся при добавлении сульфата аммония в концентрации 30-60% (мас./объем) к термообработанной смеси. Термообработанную смесь охлаждают, а осажденную фракцию собирают центрифугированием и растворяют в изотоническом солевом растворе, подвергают адекватному диализу и стерилизации с помощью мембранной фильтрации. Недостатком данного способа является использование длительной (10 ч) термообработки, в результате которой уничтожаются не только вирусы, но и нативные вещества молока.

Известен способ получения бактерицидной композиции, содержащей лизоцим куриного яйца [Патент СА 2000849 (Канада). / Бактериостатическая и бактерицидная композиция и метод ее использования. / Сапс Альфред Т (USA)]. Композиция включает лизоцим, минеральный компонент и кислотоиммуномодулятор с последующим доведением pH до значения не больше 5,0 для термолабильной композиции и не больше 8,0 для термостабильной композиции. Бактериостатическая, бактерицидная композиция, полученная данным способом, может быть использована для ингибирования развития большого числа микроорганизмов. В связи с этим она применяется в качестве консерванта для продления сроков хранения свежих продуктов, молока, молочных продуктов, включая творог.

В Японии запатентован способ выделения из молока препарата ангиогенина, обладающего физиологической активностью [Патент № 2-296000 (Япония)]. Благодаря наиважнейшей функции ангиогенина - способности индуцировать рост кровеносных сосудов, предлагается использовать его для обработки поврежденных тканей, язв, при имплантации органов. К недостаткам двух вышеперечисленных аналогов можно отнести наличие одного антибактериального компонента и узкую направленность предлагаемой композиции.

Запатентован способ выделения ангиогенина, который представляет собой трехэтапный метод хроматографической очистки ангиогенина от белков молока с помощью ионообменной хроматографии на СМ-целлюлозе и гидрофобной хроматографии на CM Toyopearl 650 S Butyl Toyopearl 650 S [Патент № 2109784 (РФ). Способ выделения ангиогенина. / Рогов И.А., Шалыгина A.M., Комолова Г.С., Михайлов A.M., Тихомирова Н.А.]. Недостатком данного способа является многостадийность обработки молочного сырья при получении ангиогенина, что не исключает возможность его частичной потери.

Наряду с ним запатентован способ получения биологически активного концентрата, обогащенного панкреатической рибонуклеазой А, ангиогенином и лизоцимом, из молочного ультрафильтрата [Патент № 2204262 (РФ). Способ получения биологически активного концентрата, обогащенного панкреатической рибонуклеазой А, ангиогенином и лизоцимом, из молочного ультрафильтрата. / Рогов И.А., Шалыгина A.M., Тихомирова Н.А., Комолова Г.С., Федорова Т.В., Машков А.Е., Цуман В.Г., Пыхтеев Д.А., Плаксина Г.В.]. Способ заключается в том, что молочное сырье, в качестве которого используют ультрафильтрат, сначала концентрируют в 10-12 раз посредством обратного осмоса через мембрану с размером пор 1000-5000 Да при давлении 0,4-0,7 МПа и температуре 4-10°С, затем производят очистку белкового раствора от лактозы и минеральных веществ добавлением калий-фосфатного буфера с pH 6,7-7,0, посредством диафильтрации, полученный белковый концентрат стерилизуют, подвергая его микрофильтрации через мембрану с размером пор 0,10-0,45 мкм при давлении 0,2-0,7 МПа и температуре 4-10°С.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения биологически активной добавки на основе лактоферрина, лактопероксидазы, ангиогенина, панкреатической РНКазы, лизоцима и полипептидов, полученной методом катионнообменной хроматографии на СМ-целлюлозе [Патент № 2183935 (РФ). Способ получения биологически активной добавки «МИЛКАНГ» и полученная этим способом БАД «МИЛКАНГ». / Рогов И.А., Титов Е.И., Шалыгина A.M., Тихомирова Н.А., Комолова Г.С., Рогов С.И.]. Способ заключается в том, что сначала белки молочного происхождения отделяют от жировой фракции, затем проводят сорбцию и хроматографическое разделение, элюирование, определение фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., диализ против физиологического раствора, стабилизируют ее путем проведения микрофильтрации через полупроницаемую мембрану с селективностью более 50 кДа, после чего полученную БАД, включающую ангиогенин, панкреатическую РНКазу, лизоцим и полипептиды, направляют на фасовку. Данный способ является прототипом. Недостатком данного способа является получение БАД в жидкой форме, что значительно снижает уровень сохранности компонентов, входящих в состав БАД в процессе хранения, а также использование этапа микрофильтрации через мембрану с размером пор 50 кДа, исключающего получение более полного спектра защитных катионных белков молока.

Таким образом, в результате патентного и литературного поиска установлено, что получение биологически активных веществ из молока является актуальной задачей, а использование катионных сывороточных белков молока, таких как лизоцим, ангиогенин, лактоферрин, лактопероксидаза, панкреатическая рибонуклеаза, в том числе в сочетании с куриным лизоцимом в виде биологически активных препаратов находит широкое распространение не только в пищевой отрасли, а также медицине, фармакологии, но и в косметологии.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка способа получения БАД на основе композиции физиологически значимых ферментов, выделенных из сырья животного происхождения, и получения этим способом БАД, содержащей в концентрированном виде защитный комплекс молока, включающий катионные белковые вещества (лактопероксидазу, лактоферрин, лизоцим, ангиогенин, панкреатическую рибонуклеазу), а также куриный лизоцим, обладающие синергетическими парафармацевтическими свойствами.

Это достигается тем, что для получения БАД проводят очистку молочного сырья центрифугированием, сорбцию белков на ионообменнике, хроматографическое их разделение, элюирование, определение фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., диализ против физиологического раствора, фосфатного буфера или дистиллированной воды сырья для получения БАД на основе нативных катионных белковых веществ молочного происхождения: ангиогенина, панкреатической РНКазы, молочного лизоцима, лактопероксидазы, лактоферрина, стабилизацию и микробиологическую очистку микрофильтрацией через полупроницаемые мембраны с селективностью 0,22-0,45 мкм, составление композиции с куриным лизоцимом проводят при соотношении компонентов 1:2, соответственно сывороточные катионные белки молока: куриный лизоцим при температуре плюс 20±2°С с последующим замораживанием при температуре минус 35-40°С и сублимационным высушиванием с максимальной температурой досушки плюс 37±2°С. Биологически активная добавка «МОБЕЛИЗ» характеризуется тем, что она дополнительно содержит куриный лизоцим при следующем соотношении указанных белковых веществ, мг: лактопероксидаза 17,9±1,2; лактоферрин 10,3±1,4; ангиогенин 0,9±0,1; панкреатическая РНКаза 2,7±0,1; лизоцим молочный 0,09±0,01; куриный лизоцим 65,8±3,6.

Технический результат, полученный согласно данному способу производства, заключается в том, что БАД содержит в нативном виде куриный лизоцим, лактопероксидазу, лактоферрин, лизоцим, ангиогенин, панкреатическую РНКазу, которые в композиции проявляют синергетические свойства, обладают ангиогенным, антимикробным, иммуномодуляторным, антиоксидантным, противострессорным, общеукрепляющим действием, а также способствуют взаимной стабилизации компонентов БАД в ходе получения, консервирования и хранения.

Разработан достаточно простой современный способ получения БАД на основе куриного лизоцима и катионных сывороточных белков молока, обладающих биологической активностью. Впервые получена композиционная биологически активная добавка на основе фракции катионных белков молочного происхождения, обогащенная лактопероксидазой, лактоферрином, лизоцимом, ангиогенином, панкреатичекой РНКазой в сочетании с белком немолочного происхождения - куриным лизоцимом. Благодаря получению фракции белков в нативном состоянии данную композицию целесообразно использовать в качестве основы БАД к пищевым продуктам или в технологиях производства медицинских, фармацевтических и косметических препаратов. Для получения фракции катионных белковых веществ молока применена ионообменная хроматография на СМ-целлюлозе. В качестве функциональной протекторной среды для комплекса катионных сывороточных белков молока использован куриный лизоцим. Для обеспечения полифункциональной направленности БАД использовано соотношение компонентов как 1:2 катионные сывороточные белки молока: куриный лизоцим, которое является наиболее приближенным к содержанию катионных сывороточных белков и лизоцима в свежевыдоенном цельном молоке. Кроме того, при таком соотношении компонентов обеспечивается рекомендуемая дозировка концентрации лизоцима для обогащения продуктов детского питания. Для обеспечения наиболее быстрого смешения компонентов с минимальным воздействием на белковую структуру компонентов температуру составления БАД поддерживают на уровне плюс 20±2°С. Для стерилизации, микробиологической очистки БАД использована микрофильтрация через полупроницаемые мембраны. Для обеспечения длительных сроков хранения полученной БАД в нативном виде применяют быстрое замораживание до температур минус 35-40°С и сублимационную сушку с максимальной температурой досушки плюс 37±2°С. В качестве источника катионных белковых веществ молока, обладающих антимикробными, антиоксидантными, иммуномодуляторными свойствами, использовано цельное молоко, а также вторичное молочное сырье молочной промышленности (обезжиренное молоко). Молоко, в частности вторичные молочные ресурсы, является перспективным источником получения биологически активных веществ [Н.А.Тихомирова, Г.С.Комолова, И.И.Ионова. Биологически активные белки молока: Учеб. пособие. - М: МГУПБ, 2004. - 80 с.], которые могут быть использованы в качестве активной основы БАД для получения продуктов специального назначения и препаратов лечебно-профилактической направленности широкого спектра действия. В частности, представляют интерес практически не используемые в традиционных технологиях катионные белки, обладающие многофункциональными свойствами: лактопероксидаза (78 кДа, обладает антимикробной активностью), лактоферрин (78-80 кДа, полифункциональный белок: бактерицидная и бактериостатическая активность, стимулирует клеточный рост, белок острой фазы ингибирует иммунные и воспалительные реакции, участвует в процессах внутреннего пищеварения, иммуномодулятор), ангиогенин (14,5 кДа, полифункциональный белок: фактор роста кровеносных сосудов, активный фактор костеобразования, иммунорегулятор, бактерицидное действие, белок острой фазы, участвует в передаче пассивного иммунитета), панкреатическая РНКаза (12 кДа, противовирусное действие), лизоцим (около 14 кДа, обладает бактерицидным действием, является фактором неспецифической защиты, стимулирует восстановление поврежденных тканей, обладает противовоспалительным, иммунорегулирующим, антитоксическим и противоопухолевым действиями, является фактором местной защиты для пищеварительной системы организма человека).

В последние годы для повышения биологической ценности и в качестве природного консерванта в технологии производства молочных продуктов функционального назначения используют лизоцим. Лизоцим не только сам по себе является полифункциональным белком, но также способен проявлять синергизм в комплексе с другими биологически активными белками молока. Богатым источником лизоцима, относящегося к тому же типу, что и молочный, является куриный лизоцим. Присутствие куриного лизоцима в составе комплексных смесей на основе сывороточных катионных белков молока, как показали собственные исследования, обеспечивает высокую устойчивость компонентов к процедурам замораживания-оттаивания, сублимации, технологическим факторам, применяемым в технологиях получения молочных продуктов. Кроме того, куриный лизоцим оказывает стабилизирующее действие на молочные белки в условиях хранения его растворов при температурах как +4°С, так и +20°С.

Разработанный способ позволяет получать БАД, содержащую в концентрированном, но при этом нативном виде вышеперечисленные катионные белки молока, а также куриный лизоцим. Благодаря сохранности их нативных свойств БАД обладает антимикробным, антиоксидантным, иммуномодуляторным, ангиогенным, антитоксическим, противоопухолевым свойствами, что позволяет использовать ее как непосредственно, так и в виде добавки к молочным и другим продуктам питания, которые могут быть рекомендованы в качестве диетического, функционального, лечебно-профилактического питания. Наличие куриного лизоцима в составе БАД обеспечит стабилизирующее действие в отношении молочных белков в процессе хранения, технологической обработки при получении обогащенных ею продуктов питания. Применение куриного лизоцима в составе комплекса катионных белков молока также будет способствовать повышению скора серосодержащих аминокислот, обеспечит возрастание биологической ценности как самой добавки, так и обогащенных ею продуктов питания.

Белковый состав БАД проверяют электрофоретически в ПААГ, а нативность белков - по ферментативной активности (лактопероксидаза, лизоцим, пРНКаза), методом иммуноферментного анализа (лактоферрин) и по взаимодействию с плацентарным ингибитором (ангиогенин).

Способ осуществляют следующим образом. Для получения БАД «МОБЕЛИЗ» берут молочное сырье с нативными катионными белковыми веществами, обезжиривают центрифугированием, далее обезжиренную белковую фракцию наносят на колонку с сорбентом СМ-целлюлозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируют, собирая фракции с A₂₆₀>0,1. Фракции объединяют и проводят диализ против дистиллированной воды или фосфатного буфера. Диализат подвергают микрофильтрации через полупроницаемые мембраны с селективностью 0,22-0,45 мкм. Полученный белковый комплекс, содержащий лактопероксидазу, лактоферрин, панкреатическую РНКазу, ангиогенин, лизоцим, смешивают с куриным лизоцимом в соотношении 1:2 при температуре плюс 20±2°С. В результате получают БАД в жидкой форме, которую затем направляют на фасовку. С целью обеспечения более длительных сроков хранения полученную БАД после фасовки подвергают замораживанию до температур минус (35-40)°С и последующей сублимационной сушке (максимальная температура досушки плюс 37±2°С, получая тем самым сухую форму БАД. Белковый состав полученной БАД представлен в таблице 1.

Таблица 1
Белковый состав БАД «МОБЕЛИЗ»
№	Наименование белка	Содержание, мг
1	Лактоферрин	10,3±1,4
2	Лактопероксидаза	17,9±1,2
3	Панкреатическая РНКаза	2,7±0,1
4	Ангиогенин	0,9±0,1
5	Лизоцим молочный	0,09±0,01
6	Лизоцим куриный	65,8±3,6
	Общий белок	97,69±7,01

Пример

Цельное молоко в количестве 1 л обезжиривают центрифугированием, проводят сорбцию белков на ионообменнике СМ-целлюлозе, наносят на колонку и проводят ионообменную хроматографию, элюируют, собирая фракции с А₂₈₀>0,1. Фракции объединяют и проводят диализ против дистиллированной воды или фосфатного буфера (pH 6,7). Полученный диализат подвергают микрофильтрации через полупроницаемые мембраны 0,22-0,45 мкм. В результате получают 10-25 мл белковой фракции. Затем полученную фракцию катионных сывороточных белков молока смешивают с куриным лизоцимом в соотношении компонентов 1:2. Готовую БАД в жидкой форме фасуют в стерильную тару. В сухой форме БАД «МОБЕЛИЗ» получают с применением сублимационной сушки с предварительным замораживанием готовой БАД. Состав полученной БАД в сухой форме представлен в таблице 2.

Таблица 2
Белковый состав БАД «МОБЕЛИЗ»
№	Наименование белка	Содержание, мг/г белка
1	Лактоферрин	0,108
2	Лактопероксидаза	0,187
3	Панкреатическая РНКаза	0,028
4	Ангиогенин	0,009
5	Лизоцим молочный	0,001
6	Лизоцим куриный	0,667

Таким образом, в сравнении с прототипом в состав БАД помимо белков молока входит дополнительно куриный лизоцим, который способствует проявлению синергетического эффекта, стабилизации компонентов в ходе получения БАД и ее хранения. Биологически активная добавка «МОБЕЛИЗ», включающая компоненты, обладающие общеукрепляющим, антимикробным, антиоксидантным, противовирусным, ангиогенным, иммуномодуляторным, противоопухолевым свойствами, может быть рекомендована для использования в технологиях производства медицинских, фармацевтических и косметических препаратов.