способ оценки эффективности антигипоксических препаратов на модели дыхательной гипоксии у daphnia magna straus

Формула изобретения

Способ оценки эффективности антигипоксических препаратов, характеризующийся тем, что регистрируют время гибели гидробионтов в пробе без доступа воздуха в среде с аквариумной водой и среде с добавлением препарата, фиксируют время гибели при изменяющихся по логарифмической шкале возрастающих объемах проб исследуемого вещества с последующим построением графической зависимости времени наступления гибели гидробионтов по оси ординат от объема пробы по оси абсцисс, выявляют прямолинейный участок графической зависимости и определяют tg угла наклона прямолинейного участка графика к оси абсцисс, сравнивают величины tg в контроле и в опыте с предполагаемым антигипоксическим препаратом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности фармакологии, а именно к способам моделирования патологических состояний для исследования фармакологических препаратов.

Известен способ (RU 2256910 «Способ определения чувствительности гидробионтов Daphnia magna Straus к токсическому действию водорастворимых химических веществ»), основанный на определении параметров линейной зависимости времени гибели гидробионтов от концентрации токсиканта и позволяющий определить чувствительность гидробионта к токсиканту в любой момент времени и в широком диапазоне концентраций.

Задача настоящего изобретения состоит в применении указанного способа для оценки антигипоксической активности препаратов, что позволяет с использованием доступного биологического объекта Daphnia magna Straus унифицировать условия гипоксического воздействия и стандартизировать оценку антигипоксантов.

Опыты проводили с использованием в качестве тест-объекта гидробионтов Daphnia magna Straus. Разведение дафний осуществляли в лабораторных условиях в соответствии с требованиями международного стандарта по биотестированию воды (Международный стандарт. Качество воды. Определение угнетения подвижности Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacera).- ИСО 6341. -1987). В эксперимент брали гидробионтов в возрасте 3-5 суток. Дафний помещали по одной особи в герметически закупоренные стеклянные емкости с возрастающими объемами аквариумной воды от 0,1 мл до 5,0 мл (по логарифмической шкале с интервалом 0,1) при температуре 20°С. В ходе опытов дафний не кормили, поэтому время наблюдения за ними ограничивалось тремя сутками. Фиксировали время от момента герметизации проб с дафниями до гибели гидробионтов, которая наступала при рO₂ воды 25-30 мм рт.ст. Для правильного расчета и сравнения получаемых результатов необходимо независимо от сроков наблюдения фиксировать время в минутах. Каждый эксперимент повторяли десять раз.

В ходе исследования определяли среднее время гибели дафний в каждом объеме пробы без доступа воздуха. На основании полученных данных, представленных в таблице 1, строился график зависимости (фиг. 1) времени наступления гибели гидробионтов (Т ср., мин) от объема пробы (V, мл). При анализе полученных результатов был выявлен практически прямолинейный участок графической зависимости и определен tg угла наклона прямолинейного участка графика к оси абсцисс (tg ₁=851). Наличие прямолинейного участка на графике характеризует прямо пропорциональную зависимость между объемом пробы и временем наступления гибели гидробионтов, т.е. при создании постепенно нарастающей дыхательной гипоксии у дафний в диапазоне от 0,1 мл до 5,0 мл происходит равномерное изменение среднего времени гибели дафний.

Таблица 1
Среднее время гибели гидробионтов Daphnia magna Straus, находящихся в замкнутом пространстве, при изменении объема пробы (концентрации расположены по логарифмической шкале с интервалом 0,1), M±m
Объем пробы, мл	Среднее время гибели дафний, мин
5,0	4320±960
4,0	3800±740
3,2	3000±530
2,5	2100±480
2,0	2000±420
1,6	1550±310
1,3	1300±180
1,0	1000±120
0,8	780±108
0,63	590±102
0,5	520±104
0,4	470±92
0,32	440±98
0,25	390±73
0,2	320±61
0,16	210±48
0,13	170±34
0,1	150±22

Прямолинейность графической зависимости, вероятно, демонстрирует наличие одного патологического процесса (гипоксии), приводящего к гибели организма во всем диапазоне объемов проб. Определение тангенса угла наклона графической зависимости (tg ) необходимо для получения количественной характеристики чувствительности гидробионтов к развивающейся гипоксии, учитывающей одновременно и объем вещества и динамику изменения скорости наступления гибели дафний. В связи с этим tg можно назвать количественной характеристикой чувствительности дафний к воздействию недостатка кислорода в диапазоне объемов проб, соответствующей на графике прямолинейному участку. Он показывает, как быстро происходит пропорциональное объемам проб изменение среднего времени гибели дафний.

Принципиальным отличием от ранее используемых способов моделирования гипоксии является не только использование нового биологического объекта (гидробионта Daphnia magna Straus), но и использование в одном эксперименте не одного объема, а ряда постепенно изменяющихся объемов для тестирования экспериментального гидробионта.

Пример.

Приводится последовательность действий при определении антигипоксического действия 2,5% раствора препарата цитофлавин в опытах на гидробионтах Daphnia magna Straus. Фиксируют время гибели дафний, помещенных по одной особи в герметически закупоренные стеклянные емкости с возрастающими объемами водного раствора перепарата от 0,1 мл до 5,0 мл (по логарифмической шкале с интервалом 0,1) при температуре 20°С (таблица 2). На основании результатов, представленных в таблице 2, строят график (фиг. 2) зависимости изменения среднего времени гибели дафний от объема раствора препарата, в котором находится гидробионт, и определяют tg углов наклона прямолинейных участков графика к оси абсцисс. Их два: первый (tg ₂=774) в диапазоне от 0,1 мл до 2 мл, второй (tg ₃=1440) в диапазоне от 2,5 мл до 5 мл. Сравнение полученных результатов с контролем (таблица 1 и фиг. 1) позволяет установить, что 2,5% раствор препарата цитофлавин проявляет антигипоксические свойства (tg ₃ более чем в 1,5 раза превышает tg ₁).

Таблица 2
Влияние 2,5% раствора препарата цитофлавин на среднее время гибели гидробионтов Daphnia magna Straus на фоне дыхательной гипоксии
Объем пробы, мл	Среднее время гибели дафний (мин) в присутствии цитофлавина (М±m)
5.0	5600±1100
4.0	4580±920
3.2	3600±720
2.5	2000±650
2.0	1700±740
1.6	1600±580
1.3	1100±440
1.0	870±280
0.8	840±210
0.63	620±160
0.5	500±140
0.4	450±110
0.32	460±120
0.25	370±90
0.2	300±80
0.16	240±54
0.13	160±60
0.1	130±45