способ дифференциальной диагностики типа роста лейомиомы матки

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики типа быстрого роста лейомиомы матки путем иммунологического исследования периферической венозной крови, отличающийся тем, что определяют относительное количество CD4+IL-10+ лимфоцитов и при значении этого показателя равном 5,8% или более диагностируют истинный рост лейомиомы матки, а при значении менее 5,8% - ложный рост лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано в качестве дифференциальной дооперационной диагностики типа быстрого роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста.

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что лейомиома матки является самой распространенной доброкачественной опухолью у женщин репродуктивного возраста, причем в последние годы появилась тенденция к увеличению частоты встречаемости лейомиомы матки у молодых женщин 20-30 лет (Миома матки (современные проблемы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения) / Под ред. И.С.Сидоровой. - М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 256 с.). У 50% пациенток с лейомиомой матки отмечается быстрый рост опухоли, что является показанием к оперативному вмешательству, которое в большинстве случаев приводит к полной утрате репродуктивной функции женщин.

Быстрый рост лейомиомы матки может происходить за счет нарушения питания узла, развития отека и дегенеративных изменений (ложный тип роста) или за счет усиления пролиферации миоцитов (истинный тип роста) (Савицкий Г.А., Савицкий А.Г. Миома матки (проблемы патогенеза и патогенетической терапии). - СПб.: «Элби-СПб», 2000. - 130 с.). Известно, что пролиферирующая миома матки имеет значительно менее благоприятное течение. У пациенток с данным типом опухоли чаще имеют место рецидивы опухоли, этих женщин также относят к группе риска по развитию гиперпластических процессов эндометрия и молочных желез, а также по развитию кистозных и злокачественных образований в яичниках (Миома матки (современные проблемы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения) / Под ред. И.С.Сидоровой. - М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 256 с.). В связи с этим особую актуальность представляет разработка точных лабораторных критериев дифференциальной диагностики типа роста лейомиомы матки, которые помогли бы врачу своевременно разработать оптимальную тактику ведения больной и сделать выбор между консервативным и оперативным методами лечения.

Ранее было предложено дифференцировать характер быстрого роста опухоли по данным цветного доплеровского картирования с оценкой степени изменений сосудистой стенки, расположения и количества сосудов. Показано, что при картировании миом матки с истинным ростом изображение внутриопухолевого кровотока характеризуется множеством сигналов от сосудов в центре миоматозного узла, регистрируется много вен со скоростью венозного кровотока VV max=14 см/с в различных отделах миоматозного узла и минимальные индексы резистентности (IR min) в миометрии составляют 0,50±0,11, в миоматозных узлах - 0,34±0,06, тогда как у больных миомой матки с ложным ростом определяется умеренное количество сигналов в центре узла, IR min в миометрии составляет 0,51±0,09, в миоматозных узлах - 0,45±0,08, отмечается большое количество вен преимущественно по периферии миоматозных узлов с VV max=9 см/с. (Миома матки (современные проблемы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения) / Под ред. И.С.Сидоровой. - М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 256 с.)

Однако дифференциальная диагностика истинного и ложного роста опухоли по этим параметрам имеет ряд недостатков:

- для постановки диагноза предлагается оценивать целый комплекс факторов, что значительно затрудняет интерпретацию результатов:

- отсутствуют четкие диагностические параметры;

- по данным разных авторов существует большой разброс показателей резистентности внутриопухолевого кровотока миоматозных узлов (Миома матки (современные проблемы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения) / Под ред. И.С.Сидоровой. - М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 256 с.), что снижает диагностическую ценность данного параметра;

- отсутствуют данные о точности способа.

Известен способ дифференциальной диагностики быстрорастущей лейомиомы матки, отличающийся тем, что в биоптате эндометрия определяют содержание эпидермального фактора роста и при его значении, равном 6 нг/мл и менее, диагностируют ложный рост миомы, а при значении более 6 нг/мл - истинный рост миомы (Патент № 2258222. Способ дифференциальной диагностики быстрорастущей лейомиомы матки / Посисеева Л.В., Малышкина А.И., Красильникова А.К., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Перетятко Л.П. // Изобретения. Полезные модели. - 2005. - № 22). Однако этот способ имеет ряд недостатков:

1. Способ является инвазивным.

2. Забор эндометрия происходит при проведении гистероскопии в стационарных условиях, что связано с госпитализацией пациентки и использованием дорогостоящего оборудования.

3. Способ чрезвычайно трудоемок, так как для его осуществления требуется выделение обогащенной популяции мононуклеарных клеток из ткани эндометрия с последующим культивированием клеток в течение 24 часов, при этом для культуральных исследований необходимы дорогостоящие питательные среды и СО ₂-инкубатор.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ дифференциальной диагностики быстрорастущей лейомиомы матки по определению относительного содержания Т-хелперов в периферической крови женщин в постменопаузальном возрасте с нерегрессирующей лейомиомой матки. При низких значениях этого показателя (менее 29%) диагностируют пролиферирующую лейомиому матки - истинный рост, а при показателях уровня Т-хелперов выше 29% диагностируют рост миомы за счет развития отека - ложный рост (Миома матки (современные проблемы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения) / Под ред. И.С.Сидоровой. - М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 256 с.)

Способ имеет ряд недостатков:

1. Данный способ применим для диагностики типа роста миомы матки у женщин только в период постменопаузы, данные о возможности его использования у женщин репродуктивного возраста отсутствуют, тогда как необходимость диагностики типа быстрого роста миомы матки особенно актуальна именно у женщин активного репродуктивного возраста, когда своевременная дифференциальная диагностика истинного или ложного роста опухоли имеет принципиальное значение для разработки оптимальной тактики ведения больной и сохранения репродуктивной функции женщины.

2. В настоящее время доказано, что популяция Т-хелперов неоднородна по своему составу и для определения их роли в развитии различных патологических ситуаций большую ценность имеет определение функциональной активности Т-хелперов по уровню продукции ими различных цитокинов (Игнатьева Г.А. Иммунная система и патология: (Лекция) // Пат. физиология и экспериментальная терапия. - 1997. - № 4. - С.26-37.)

3. Нет данных о точности, чувствительности и специфичности способа.

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Техническим решением заявляемого способа является дооперационная дифференциальная диагностика типа роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста, которая достигается тем, что в периферической крови женщин с быстрорастущей лейомиомой матки определяют относительное количество лимфоцитов с фенотипом CD4+IL-10+ и при значении этого показателя, равного 5,8% или более, диагностируют истинный рост лейомиомы матки, а при значении менее 5,8% - ложный рост с точностью 79,1%.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается дифференцировать истинный и ложный тип быстрого роста лейомиомы матки по определению относительного содержания в периферической крови CD4+IL-10+ лимфоцитов. Ранее было показано, что уровень CD4+IL-10+ лимфоцитов повышен у больных с дисплазиями соединительной ткани (Baráth S, Sipka S, Aleksza M, Szegedi A, Szodoray P, Végh J, Szegedi G, Bodolay E. Regulatory Т cells in peripheral blood of patients with mixed connective tissue disease // Scand. J. Rheumatol. - 2006. - Vol.35. - N.4. - P.300-304). Кроме того, отмечалось увеличение этого пула Т-хелперов в крови пациентов с аллергией после проведения им курса аллерген-специфической иммунотерапии (Gardner LM, Thien FC, Douglass JA, Rolland JM, O'Hehir RE. Induction of Т 'regulatory' cells by standardized house dust mite immuno-therapy: an increase in CD4+CD25+interleukin-10+Т cells expressing peripheral tissue trafficking markers // Clin. Exp.Allergy. - 2004. - Vol.34. - N.8. - P.1209-1219). Для дифференциальной диагностики типа быстрого роста лейомиомы матки этот показатель ранее не применяли.

Популяцию Т-хелперов с фенотипом CD4+IL-10+ относят в настоящее время к пулу Tr1 регуляторных Т-лимфоцитов (Treg), осуществляющих супрессию иммунного ответа и предотвращающих развитие аутоиммунных реакций (Maloy K.J., Powrie F. Regulatory T cells in the control of immune pathology // Nature Publishing Group. - 2001. - V.2. - N.9. - P.816-822). Известно, что чрезмерная активация Treg подавляет развитие противоопухолевого иммунитета (Gallimore A., Sakaguchi S. Regulation of tumour immunity by CD25+T cells // Immunology. - 2002. - V.107. - P.5-9), поэтому увеличение уровня CD4+IL-10+ лимфоцитов в периферической крови женщин с лейомиомой матки может лежать в основе иммунных нарушений, приводящих к усилению пролиферативных процессов в миометрии и быстрому росту лейомиомы матки.

Способ осуществляется по стандартной методике следующим образом:

1) К 3 мл гепаринизированной крови из кубитальной вены добавляют 3 мл Среды 199 и выделяют обогащенную популяцию мононуклеарных клеток стандартным методом скоростного центрифугирования (Bourn A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest. - 1968. - v.21. - N97. - p.77).

2) Суспензию мононуклеарных клеток дважды отмывают физраствором, доводят концентрацию клеток до 1×10⁶ кл/мл. К 0,1 мл полученной суспензии одновременно добавляют 20 мкл моноклональных антител анти-CD4, конъюгированных с флюоресцеинизотионатом (000 «Сорбент», Москва). Клетки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают в 1 мл физраствора.

3) Проводят процедуру внутриклеточного окрашивания клеток с использованием набора для пермеабилизации клеточной мембраны FIX & PERM cell permeabilization kit (CALTAG Laboratories, США) и моноклональных антител к IL-10 (CALTAG Laboratories, США) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Для этого к 50 мкл клеточной суспензии добавляют 100 мкл фиксирующего буфера А из набора FIX & PERM cell permeabilization kit и инкубируют клетки в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Далее клетки отмывают от фиксирующего буфера и добавляют 100 µ1 пермеабилизирующего буфера В и 2 мкл моноклональных антител к IL-10, меченных фикоэритрином. Клетки инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают и фиксируют в 0,5 мл фиксирующего раствора CellFix (BD Biosciences, Belgium).

4) Определяют относительное (процентное) количество двойных позитивных CD4+IL-10+ лимфоцитов в лимфоцитарном гейте на проточном цитометре.

Использование предлагаемого способа позволяет с высокой точностью, 79,1%, дифференцировать истинный и ложный тип быстрого роста лейомиомы матки.

Отличительными признаками способа являются: установлен дифференциально-диагностический параметр относительного содержания CD4+IL-10+ лимфоцитов в периферической крови женщин репродуктивного возраста с быстрорастущей лейомиомой матки, при значении которого 5,8% или более, диагностируют истинный рост лейомиомы матки, а при значении менее 5,8% - ложный рост лейомиомы матки.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Больная О., 32 года, поступила на плановое оперативное лечение. Наблюдалась в женской консультации с миомой матки малых размеров (6-7 недель). При очередном осмотре через год после первого обращения обнаружен быстрый рост миомы матки. У больной появились боли внизу живота и пояснице. В анамнезе 1 медицинский аборт, родов не было. Метод контрацепции - барьерный.

При осмотре: шейка матки без дефектов слизистой, тело матки увеличено до 12-13 недель беременности за счет в основном одного узла, исходящего из левой боковой стенки, плотное, подвижное, безболезненное. Придатки при пальпации без особенностей.

По данным УЗС: тело матки неоднородной структуры, размеры вместе с узлом - 133×78×128 мм. Из левого ребра матки исходит субсерозный узел диаметром до 85 мм. Полость матки не деформирована. М-эхо 8 мм. Правый яичник 36×18 мм. Левый яичник 35×11 мм. Оба яичника обычной структуры.

Анализ крови: Hb - 118 г/л, эритроциты 4,2 т/л, цветной показатель 0,9, лейкоциты - 7,8 г/л, палочкоядерные нейтрофилы - 2, сегментоядерные нейтрофилы - 57, моноциты - 11, лимфоциты - 30, СОЭ - 19 мм/ч.

Клинический диагноз: интрамурально-субсерозная лейомиома матки, быстрый рост, болевой синдром.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в периферической крови CD4+IL-10+ лимфоцитов составило 12,5%, что выше заявляемого параметра (5,8%).

Заключение: диагностируется истинный тип быстрого роста лейомиомы матки.

Произведена операция - консервативная миомэктомия.

При гистологическом исследовании операционного материала получен ответ: «пролиферирующая лейомиома матки с большим количеством сосудов разного калибра». Таким образом, диагноз истинного типа роста лейомиомы матки подтвердился.

Пример 2. Больная К., 36 лет. Наблюдалась в женской консультации по поводу миомы матки малых размеров - 6 недель - в течение года. За это время стала отмечать, что менструации стали более длительными и обильными до 8 дней, появилась слабость после менструации и частое мочеиспускание. В анамнезе 1 своевременные роды без осложнений. Метод контрацепции - барьерный. Планируются вторые роды. При влагалищном исследовании: шейка цилиндрическая, без дефектов слизистой, матка увеличена до 14 недель беременности в основном за счет одного большого узла по передней стенке, мягковатая при пальпации, подвижная, безболезненная, придатки не пальпируются, своды свободные.

По данным ультразвукового сканирования (УЗС): тело матки размерами 78×60×70 мм неоднородной структуры. Из передней стенки исходит интрамурально-субсерозный узел на широком основании размерами 98×103×85 мм, пониженной эхогенности, неоднородной структуры. Полость матки не деформирована. М-эхо 10 мм. Правый яичник 40×31 мм, левый яичник 41×36 мм. Оба яичника нормальной структуры.

Анализ крови: Hb - 101 г/л, эритроциты - 4,3 т/л, цветной показатель 0,77, лейкоциты - 6,7 г/л, эозинофилы - 5, сегментоядерные нейтрофилы - 62, моноциты - 7, лимфоциты - 26, СОЭ - 28 мм/ч.

Клинический диагноз: интрамурально-субсерозная лейомиома матки больших размеров, быстрый рост, дизурические расстройства.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в периферической крови CD4+IL-10+ лимфоцитов составило 3,9%, что ниже заявляемого параметра (5,8%).

Заключение: диагностируется ложный тип быстрого роста лейомиомы матки.

Произведена операция: консервативная миомэктомия. При гистологическом исследовании операционного материала был установлен диагноз: «лейомиома матки с выраженным отеком и очаговым гиалинозом стромы». Таким образом, диагноз ложного типа роста лейомиомы матки подтвердился.

Пример 3. Больная Л., 30 лет. Наблюдалась в женской консультации в течение 3 лет с миомой матки небольших размеров (6 недель). В течение последних 6 месяцев появились боли внизу живота, обильные менструации, сопровождающиеся снижением гемоглобина. В анамнезе 1 своевременные роды. Метод контрацепции - внутриматочная спираль (ВМС) в течение 5 лет. При влагалищном исследовании: шейка матки без дефектов слизистой, матка увеличена до 12 недель беременности, с неровной поверхностью, плотная, подвижная, безболезненная, придатки не пальпируются, своды свободные.

По данным УЗС: тело матки размерами 89×109×78 мм неоднородной структуры. На передней стенке, справа, интрамурально-субсерозный узел 65×80×73 мм с явлением отека. Полость матки не деформирована. М-эхо 12 мм. Правый яичник 38×25 мм, левый яичник 43×31 мм, нормальной структуры.

Анализ крови: Hb - 125 г/л, эритроциты - 4,35 т/л, цветной показатель 0,9, лейкоциты - 8,8 г/л, эозинофилы - 2, сегментоядерные нейтрофилы - 67, моноциты - 13, лимфоциты - 18, СОЭ - 29 мм/ч.

Клинический диагноз: интрамурально-субсерозная лейомиома матки, быстрый рост, болевой синдром.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в периферической крови CD4+IL-10+ лимфоцитов было 5,8%, что соответствует пограничному значению заявляемого параметра.

Заключение: диагностируется истинный тип быстрого роста лейомиомы матки.

Произведена операция: консервативная миомэктомия.

При гистологическом исследовании операционного материала получен результат: «пролиферирующая лейомиома с умеренным количеством сосудов и отеком стромы». Таким образом, диагноз истинного типа роста подтвердился.

Указанным способом обследовано 24 женщины с быстрорастущей лейомиомой матки. Данные исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1
Показатель	Количество обследованных
Всего женщин	24
Истинно-положительный результат	9
Ложно-положительный результат	2
Истинно-отрицательный результат	10
Ложно-отрицательный результат	3
Итого: точность заявляемого способа - 79,1%
чувствительность заявляемого способа - 75,0%
специфичность заявляемого способа - 83,3%

Преимущества заявляемого способа:

1. способ применим для диагностики типа быстрого роста лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста;

2. высокая точность - 79,1%, чувствительность - 75,0%, специфичность - 83,3%;

3. простота и доступность выполнения методики;

4. длительность проведения методики определения CD4+IL-10+ лимфоцитов в периферической крови не превышает 2,5 часов;

5. применение способа позволит на дооперационном этапе проводить дифференциальную диагностику типа быстрого роста миомы матки и в максимальной степени способствовать сохранению репродуктивной функции женщин.