способ моделирования хронической обструктивной болезни легких

Формула изобретения

Способ моделирования хронической обструктивной болезни легких, включающий введение лабораторным животным ингаляционного оксиданта, отличающийся тем, что в качестве оксиданта используют диоксид азота в концентрации 30-40 мг/м³, который ингалируют ежедневно в течение 1,5-2 ч не менее 60 дней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной пульмонологии, и может быть использовано при создании модели хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Хроническая обструктивная болезнь легких - заболевание, в основе которого лежит хроническое воспаление с развитием прогрессирующей, преимущественно необратимой обструкции бронхов и ремоделирования легочной ткани. Отсутствие заметного прогресса в лечении ХОБЛ объясняется не только необратимостью морфологических изменений в бронхолегочной системе, но и недостаточной изученностью механизмов возникновения и развития этих изменений.

Известен способ моделирования ХОБЛ-подобного состояния путем ингаляций диоксида серы [Wagner U., Staats P., Fehmann H.C., Welte Т., Greneberg D.A., Fisher A. Analysis of airway secretions in a model of sulfur dioxide induced chronic obstructive pulmonary disease (COPD) // J. Occup. Med. Toxicol. - 2006. - Vol.1:12. doi: 10.1186/1745-6673-1-12]. Крыс подвергали непрерывному воздействию диоксида серы в дозах от 5 до 80 ppm (от 14 до 229 мг/м³ ) в течение 20-25 дней. Только при дозе 20 ppm или 57 мг/м ³ было выявлено сочетание признаков воспаления дыхательных путей и гиперсекреции, которое трактовалось как ХОБЛ.

Известен способ моделирования ХОБЛ [Xu J., Zhao M., Liao S. Establishment and pathological study of models of chronic obstructive pulmonary disease by SO2 inhalation method // Chin. Med. J. (Engl). - 2000. - Vol.113 (30). - P.213-216.], в котором использовали ингаляции диоксида серы в очень высокой концентрации 250 ppm или 715 мг/м ³ в режиме 5 ч/дн., 5 дн./нед., 7 нед. Снижение пиковой величины выдыхаемого потока воздуха (<80% нормы) в сочетании с гистологическими признаками воспаления и гиперсекреции оценивали как ХОБЛ. Воспроизводимость получаемой модели составляет 64%.

Недостатки указанных способов заключаются в необходимости проведения многочасовых или непрерывных ингаляций, противоречивости приводимых авторами результатов при использовании большого диапазона концентраций диоксида серы, низкой воспроизводимости. Заключения о хроническом характере полученных изменений представляются необоснованными, поскольку исследования выполнялись сразу по окончании ингаляций и не проводились длительные наблюдения за животными в постэкспозиционном периоде. Недостатки диоксида серы как индуктора воспалительного процесса в бронхах обусловлены его токсикологическими характеристиками. Диоксид серы обладает сильным раздражающим действием. Хорошо растворяясь в воде, он фиксируется слизистой оболочкой верхних дыхательных путей и достигает респираторных отделов лишь при высоких концентрациях, вызывающих токсическое поражение легочной паренхимы. Вместе с тем он способен вызвать бронхоспазм в достаточно низких концентрациях, не вызывающих альтерацию легочной ткани.

Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в создании подтвержденных гистологически хронического воспаления и обструкции бронхов, а также в повышении воспроизводимости модели.

Сущность изобретения заключается в достижении заявленного технического результата в способе моделирования хронической обструктивной болезни легких, включающем введение лабораторным животным ингаляционного оксиданта, при этом в качестве оксиданта используют диоксид азота в концентрации 30-40 мг/м³, который ингалируют ежедневно в течение 1,5-2 часов не менее 60 дней.

Выбор диоксида азота в качестве оксиданта для моделирования ХОБЛ был обусловлен тем, что основными этиологическими факторами развития воспалительного процесса при ХОБЛ являются табачный дым и поллютанты промышленного происхождения. Среди аэрогенных поллютантов наиболее агрессивен диоксид азота, концентрации которого в воздушной среде производственных и бытовых помещений в 10-100 раз превышают допустимые нормы. Диоксид азота - важный компонент табачного дыма, и значительная часть населения при курении (как активном, так и пассивном) подвергается воздействию диоксида азота в сверхвысоких концентрациях, достигающих в табачном дыме 90-150 мг/м³. В отличие от диоксида серы оксиды азота, плохо растворяясь в воде, легко проникают до уровня терминальных бронхиол и альвеол. Обладая значительным оксидативным потенциалом, диоксид азота взаимодействует с ненасыщенными липидами клеточных мембран, вызывая цепную реакцию выработки свободных радикалов и инициируя в легких оксидативный стресс - важный механизм развития ХОБЛ, а также подавляет антиоксидантную защиту легких, окисляя низкомолекулярные восстанавливающие субстраты (глутатион, аскорбиновую кислоту, -токоферол) и белки.

Выбор дозы и длительности воздействия диоксида азота основывался на следующих положениях. Параметры экспозиции должны исключать острые токсические повреждения легких, гибель животных и не оказывать резкого раздражающего действия на дыхательные пути. Порог раздражающего действия диоксида азота при 15-минутной экспозиции составляет 90 мг/м³ . Вдыхание диоксида азота в концентрации 100 мг/м³ уже представляет опасность для организма человека и животных, а при концентрации >500 мг/м³ развивается отек легких. Доза 350-450 мг/м³ при длительности воздействия 15 мин приводит к гибели 50% животных (ЛД₅₀). Опытным путем были установлены параметры экспозиции диоксида азота, которые не вызывают острых токсических повреждений, обеспечивают 100% выживаемость животных и хронический характер формирующихся патологических изменений, характерных для ХОБЛ. При этом воспроизводимость модели составляет 90%.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Животных (взрослые крысы линии Вистар) помещают в камеру, которая соединена шлангом с лабораторной установкой для получения ex temporae диоксида азота. Лабораторная установка состоит из колбы Вюрца с отводной трубкой и делительной воронки. Камеру и установку располагают в вытяжном шкафу. Навеску азотнокислого натрия (50 мг) помещают в колбу Вюрца и с помощью делительной воронки по каплям прибавляют концентрированную серную кислоту. В результате химической реакции

2NaNO ₂+H₂SO₄=Na₂SO₄ +NO+NO₂+Н₂О

выделяется смесь оксидов азота. Под влиянием кислорода воздуха, содержащегося в колбе, бесцветный оксид азота (NO) переходит в наиболее стабильный желто-бурый диоксид (NO₂), который по отводной трубке и соединительному шлангу с помощью резиновой груши нагнетают в экспериментальную камеру. Через специальное герметично закрывающееся отверстие забирают пробы воздуха для определения концентрации диоксида азота и поддержания ее в пределах 30-40 мг/м³ . Ингаляции проводят ежедневно в течение 1,5-2 часов не менее 60 дней.

Способ иллюстрируется следующими экспериментальными исследованиями.

Объектом моделирования явились взрослые крысы линии Вистар (самцы) массой тела 180-200 г (n=160). Исследования выполнены на четырех группах животных (по 30 особей в каждой группе) с различными сроками воздействия диоксида азота: 15, 30, 60 дней и восстановительный период 6 мес. Контролем к каждой группе служили 10 интактных крыс.

Животных помещали в камеру объемом 90 л, оснащенную вентилятором для обеспечения равномерного распределения газа, и подвергали 30-40 минутным экспозициям диоксида азота по описанной выше методике три раза в день с интервалом между экспозициями 30 мин на протяжении 15, 30 и 60 дней. Прерывистый режим экспозиции обусловлен необходимостью проветривания камеры от накапливающегося при дыхании животных углекислого газа.

Животных контрольных групп на те же сроки помещали в аналогичную камеру, заполненную воздухом. После завершения 60-дневного периода экспозиции диоксидом азота за 30 животными продолжали наблюдение в течение полугода (восстановительный период). Эвтаназию животных осуществляли путем цервикальной дислокации.

Структурно-функциональные изменения, развивающиеся под воздействием ингаляций диоксида азота, оценивали по результатам морфологического, морфометрического и иммуногистохимического исследования легочной ткани, иммунологического исследования бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ).

1. Гистология

Динамика структурных изменений легочной ткани на различных сроках воздействия диоксида азота представлена в таблице 1.

Таблица 1
Сроки воздействия диоксида азота	Характеристика морфологических изменений легочной ткани
15 дней	В просветах крупных и мелких бронхов отек слизистой оболочки и пласты десквамированного эпителия. Гиперплазия лимфоидных образований в стенке бронхов и нарушение образования секрета бронхиальными железами.
30 дней	В стенке бронхов отек стромы, лимфоцитарно-лейкоцитарная инфильтрация подслизистого слоя и дистрофия эпителия бронхиальных желез. Инфильтрация лейкоцитами с примесью лимфоцитов и плазмоцитов перебронхиальной и периваскулярной клетчатки и межальвеолярных перегородок. В респираторной части легких - участки перерастяжения. Расширение просвета мелких бронхов с атрофией мышечной пластинки.
60 дней	В стенке крупных бронхов - умеренный склероз, дистрофические и атрофические изменения бронхиальных желез, участки плоскоклеточной метаплазии цилиндрического эпителия. В субэпителиальном отделе стенки бронхов - периваскулярный и перибронхиальный склероз, диффузная лимфомоноцитарная инфильтрация с примесью лейкоцитов. В мелких дистальных бронхах - атрофия слизистой оболочки и мышечной пластинки, выраженная дилятация просвета, дистрофия хрящевой пластинки и бронхиальных желез. В мелких и крупных сосудах - дисциркуляторные нарушения, перекалибровка сосудов, редукция капиллярного русла в межальвеолярных перегородках. В респираторной части легких - признаки эмфиземы и очагового фиброза.
Восстановительный период (6 мес)	Сохраняются все перечисленные выше изменения в крупных, средних, мелких бронхах и респираторной части легких. Клетки Клара замещались бокаловидными клетками, просвет бронхиол заполнен слизистым секретом.
Контроль	Структура легочной ткани без особенностей. В респираторной части - редкие участки перерастяжения.

Представленные результаты морфологических исследований позволяют считать, что под влиянием длительного воздействия ингаляционного оксиданта диоксида азота происходит формирование модели ХОБЛ, предполагающей развитие нарастающего по степени выраженности и распространенности повреждения легочных структур. Так, при ингаляции диоксида азота в течение 15, 30 и 60 дней происходило формирование хронического воспалительного процесса в бронхах. Выявлен морфологический субстрат, предрасполагающий к бронхиальной обструкции: гиперплазия и гиперсекреция бокаловидных клеток, метаплазия реснитчатого эпителия, способствующая нарушению трахеобронхиального клиренса, истончение и атрофия мышечной пластинки мелких бронхов и расширение их просвета. Изменения респираторной части легких - перерастяжение и эмфизема - способствуют возникновению клапанного механизма обструкции. Гиперпродукция секрета и нарушение его оттока из респираторного тракта способствуют персистенции воспалительного процесса и возникновению порочного круга, приводящего к прогрессированию морфологической перестройки (ремоделированию) легких экспериментальных животных. Структурные изменения, формирующиеся в бронхах и респираторной части легких после 60 дней воздействия диоксида азота, характеризуют хронический воспалительный процесс с возможностью возникновения необратимой обструкции бронхов.

2. Морфометрия

При морфометрическом анализе выявлено достоверное увеличение фиброзной ткани в бронхах, артериях и межальвеолярных перегородках после 60 дней воздействия диоксида азота. Выраженность развития фиброзной ткани в стенке долевого бронха, легочной артерии и межальверолярных перегородках после 60-дневного воздействия диоксида азота (в пикселях) представлена в таблице 2.

Таблица 2
Группы животных	Стенка бронха	Стенка артерии	Межальвеолярные перегородки
60 дней NO2	4,96±0,03*	4,74±0,02*	5,30±0,04*
Контроль	3,69±0,01	4,01±0,01	3,29±0,02
Примечание: * различие с контролем достоверно, р<0,05

3. Иммуногистохимия

Количество Т-лимфоцитов в стенке мелких и средних бронхов (описательные статистики, т-тест для одиночных вариантов) представлено в таблице 3.

Таблица 3
Лимфоциты	Среднее (М)	±	±m	t	p
60 дней NO2	61,66	3,17	1,58	38,79	0,000038
контроль	28,08	4,72	2,36	-	-

Результаты т-теста по группирующим показателям выявили значительное и достоверное увеличение количества Т-лимфоцитов в перибронхиальной ткани мелких и средних бронхов после 60 дней воздействия диоксида азота, что свидетельствует о хроническом воспалении в стенках бронхов и повышении специфического иммунитета.

4. Содержание цитокинов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости

Экспозиция диоксида азота в течение 60 дней привела к значительному увеличению содержания в БАЛЖ провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли (TNF ) и трансформирующего фактора роста (TGF ). Данные представлены в таблице 4 (М±m).

Таблица 4
Группы животных	TNF (пг/мл)	TGF (нг/мл)
60 дней NO2	204,95±25,76*	31,27±7,24*
6 мес восстановления	234,82±32,46*	29,69±8,12*
Контроль (интактные животные)	1,50±0,03	Не определяется
Примечание: * различие с интактными животными достоверно, р<0,05.

Из данных, представленных в таблице 4, видно, что за время восстановительного периода (6 мес после окончания воздействия диоксида азота) содержание обоих цитокинов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости, являющейся «зеркалом» локальных процессов в легких, сохранялось на высоком уровне, что свидетельствует о персистирующем воспалении.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о хроническом характере формирующихся патологических изменений, характерных для ХОБЛ. При этом воспроизводимость модели составляет 90% при 100% выживаемости животных.