способ определения фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственной птицы

Формула изобретения

Способ идентификации фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственной птицы, отличающийся тем, что быстрорастущие и медленнорастущие формы определяют по суммарному содержанию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбриона, причем этот показатель у медленнорастущих превосходит таковой у быстрорастущих в 10 и более раз.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к селекции сельскохозяйственной птицы.

Известно, что основным критерием, по которому можно прогнозировать продуктивные качества птицы, является порода-линия-кросс (формы). В последнее время некоторые виды птиц, считавшихся ранее дикими, приобрели сельскохозяйственное значение. Но не везде ведется строгий контроль их происхождения. В связи с этим затруднено не только прогнозирование продуктивных качеств, но и селекционная работа. Внешние (фенотипические) признаки не всегда четко проявляются. Классическим методом выяснения происхождения животных является генетическая экспертиза как непосредственная, основанная на анализе ДНК (заявка № 2004126246/13), так и опосредованная - по иммунологическим реакциям (заявка № 97121627/13). Но она может быть использована только в том случае, если известны маркеры. В этом ее основной недостаток. Определение по другим показателям (по продолжительности периода эмбрионального развития - заявка № 96101232/13), возможно лишь у тех видов животных, у которых выявлена их жесткая взаимосвязь с теми или иными формами, а величина различия достаточно велика.

В предлагаемом изобретении разработан способ определения фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственных птиц, простой для использования и дающий однозначный ответ. В основе изобретения лежит обнаруженный нами факт, что суммарное содержание нитро- и нитрозосоединений (RNO+RNO ₂) в амниотической жидкости эмбрионов сельскохозяйственной птицы тесно связано со скоростью роста птенцов после вылупления. У быстрорастущих (мясных) форм этот показатель многократно ниже, чем у исходных, а также яичных. Это позволяет использовать его для прогнозирования мясной продуктивности фенотипически невыраженных особей, а также для подбора пар в селекционной работе.

Пример конкретного выполнения

Эксперименты проводились на амниотической жидкости эмбрионов птиц, полученных в ООО "Генофонд" (г.Сергиев Посад) - куры, перепела и цесарки, в парке птиц "Воробьи" (Калужская область) - страусы. Отборы амниотической жидкости брались на 7 и 11 сутки инкубации у куриных эмбрионов, на 10 - у перепелиных, на 9 и 15 - у цесариных и на 15 и 18 - у страусиных. В каждом случае было исследовано от 10 до 30 эмбрионов.

В амниотической жидкости определялось суммарное содержание нитрата, нитрита, высокомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (то есть высоко- и низкомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (RNO+RNO ₂)). Этот показатель был относительно (±10%) стабилен в течение всего периода развития эмбриона.

Определение содержания RNO+RNO₂ осуществлялось при помощи метода, основанного на способности нитрозосоединений ингибировать фермент каталазу. Он подробно описан в следующих работах: [Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2003) Биохимия, 68, 769-776; Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2005) Биохимия, 70, 575-587; Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. Вестник Гродненского Государственного Университета им. Янки Купалы, 2007, серия 2, № 2(52), с.93-100].

Порядок определения RNO+RNO ₂ и необходимые реактивы

40 мМ р-р КН ₂РО₄ (или NaH₂PO₄);

1,5 М маточный раствор NaCl;

25 мкМ маточный водный раствор нитрита (натрия либо калия) - для калибровки;

30 мМ маточный водный раствор хлорида ванадия (VCl ₃) - восстановитель нитросоединений в нитрозо-.

Гемолизированные эритроциты коровы, полученные путем разбавления крови дистиллированной водой в 10 раз;

Перекись водорода (3% р-р).

Порядок проведения анализа

1. Определяется активность каталазы в реакционной среде, содержащей 40 мМ фосфатный буфер, рН 6,0, 150 мМ NaCl, 9 нМ фирменного препарата каталазы, либо гемолизированные эритроциты коровы (можно крысы, человека), содержащие эндогенную каталазу. Это - контрольный образец.

2. Проводится калибровка. Определяется активность каталазы в вышеуказанной среде в присутствии 125, 250 и 500 нМ нитрита.

3. Образец амниотической жидкости (200 мкл) инкубируется в течение 15 минут с равным объемом 30 мМ р-ра VCl₃. Затем переносится в основную среду (см п.1). Суммарное содержание RNO+RNO₂ определяется по степени снижения активности каталазы в соответствии с калибровкой (см. п.2).

Активность каталазы определяется любым известным методом, не требующим использования перекиси водорода в концентрации более 9 мМ.

Установлено, что линии и кроссы птиц, отличающиеся высокой скоростью прироста живой массы, содержат в амниотической жидкости многократно меньше нитро- и нитрозосоединений, чем исходные и яичные формы.

Анализ амниотической жидкости указанных в таблице пород, линий и кроссов показал, что все формы кур, перепелов и цесарок, считающиеся мясными, содержат многократно меньшую концентрацию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости, чем исходные и яичные - десятки и сотни микромоль против тысяч (таблицы 1-3).

Таблица 1
Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости куриных эмбрионов на 11-й день инкубации (Х±mx)
Породы, линии, кроссы	RNO+RNO2, мМ
Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ)
Русская белая	6,8±1,5
Юрловская (мясояичная)	7,5±2,0
Кросс "Радонеж"	5,4±1,5
Кросс "Хайсекс белый"	5,5±1,5
Его родительская линия Х3	5,5±1,5
Г8 - родительская линия кросса "Смена"	5,5±1,0
Быстрорастущие (МЯСНЫЕ) бройлеры и некоторые их родительские линии
Кросс "Смена"	0,2±0,05
Его родительская линия Г6	0,02±0,005
Кросс "Конкурент АК839"	0,04±0,015
Его родительская линия К3	0,06±0,02
Его родительская линия К8	0,04±0,015
Его родительская линия К9	0,06±0,02
Кросс "Кобб-500"	0,15±0,05

Таблица 2
Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов цесарок различных пород и линий на 15-й день инкубации (Х±mx)
Цесарки (породы и линии)	RNO+RNO2, мМ
ИСХОДНЫЕ
Серо-крапчатая	7,5±1,2
Кремовая	8,4±2,0
Загорская белогрудая (ЗБ)	5,5±1,0
Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ)
ЗБ-2 (линия ЗБ)	5,5±1,0
Быстрорастущие (МЯСНЫЕ)
ЗБ-1 (линия ЗБ)	0,04±0,015

Таблица 3
Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов перепелов различных пород на 10-й день инкубации (X±m x)
Породы	RNO+RNO 2, мМ
Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ)
Японская серая	5,5±1,0
Быстрорастущие (МЯСНЫЕ)
Эстонская	0,03±0,01
Фараон	0,2±0,05

Эта закономерность наблюдается и на страусах. В страусоводческих хозяйствах разводят две разновидности страусов: черношеяя и голубошеяя. Потомство, полученное в результате скрещивания этих разновидностей, отличается более высокой, чем родительские формы, скоростью прироста живой массы. Анализ содержания нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбрионов страусов показал ту же закономерность, которая наблюдалась у кур, перепелов и цесарок: эмбрионы гибридов содержали более чем на порядок меньше нитрозо- и нитросоединений, чем родительские формы (таблица 4).

Таблица 4
Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов различных форм черного африканского страуса на 18-й день инкубации (Х±mх)
ФОРМЫ	RNO+RNO 2, мМ
ИСХОДНЫЕ
Черношеяя (Ч)	70±20
Голубошеяя (Г)	70±20
Быстрорастущая (МЯСНАЯ)
Потомство Ч Х Г	5,0±1,0

В таблице 5 представлены факты идентификации фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание нитро- и нитрозосоединений в амнионе. Тест во всех случаях давал однозначные ответы.

Таблица 5
Определение фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание метаболитов NO в амнионе
Самец	Самка	Содержание RNO+RNO2 в амнионе, мМ	Вывод
№	Формы	№	Формы
1	Черношеий	1	невыражена	80	Самка черношеяя
2	Голубошеий	2	невыражена	5	Самка черношеяя
Самец 2 или 3? неизвестно	Голубошеий или черношеий - необходимо определить	3	черная	90	Черношеий самец № 3
3	Черношеий	4	невыражена	4-5	Самка голубошеяя
3	Черношеий	5	невыражена	6	Самка голубошеяя
3	Черношеий	6	невыражена	85	Самка черношеяя