способ количественного определения геномной днк из микрообразцов тканей млекопитающих

Формула изобретения

Способ определения концентрации (мкг/мкл) геномной ДНК из микрообразцов тканей млекопитающих, включающий измерение флуоресценции бромистого этидия, интеркалированного в молекулу ДНК, отличающийся тем, что проводят параллельно амплификацию фрагмента гена бета-глобина в исследуемом образце ДНК, а также амплификацию фрагмента гена бета-глобина в ряде образцов стандартной ДНК известной концентрации в диапазоне концентраций от 0,005 до 0,04 мкг/мкл, число циклов амплификации составляет 30, продукты амплификации разделяют электрофорезом в агарозном геле, фотографируют окрашенную бромистым этидием электрофореграмму в УФ-свете, измеряют экстинкции полос ампликонов на электрофореграмме опытного и стандартного образцов программой PhotoM 1.31, строят калибровочный график зависимости экстинкции полос ампликонов от исходной концентрации ДНК в стандартных образцах и по калибровочному графику определяют концентрацию ДНК в исследуемой пробе.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к молекулярной генетике и может найти применение в медицине и сельском хозяйстве, например, при расчетах удельной копийности генов у трансгенных организмов.

Существует способ определения концентрации ДНК, основанный на измерении оптической плотности растворов ДНК (Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж.Сэмбрук. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984, с.410), но он требует достаточно большого количества материала и высокой степени его очистки.

Гораздо более удобным способом определения концентрации ДНК является способ, основанный на измерении флуоресценции бромистого этидия, интеркалированного в молекулу ДНК (M.G. Murray, H.E.Paaren, Anal. Biochem. 154, 638-642, 1986, http://www.turnerbiosystems.com/doc/appnotes/998_2675.php). Способ заключается в том, что образец ДНК смешивают с раствором бромистого этидия и после инкубации измеряют на флуориметре флуоресценцию пробы. Этот способ выбран нами в качестве прототипа.

Недостатком прототипа является его недостаточно высокая чувствительность. Способ позволяет определять количество ДНК в образце, содержащем не менее 0,5 мкг ДНК. Для анализа микрообразцов (особенно эмбрионального происхождения) требуется способ, обладающий более высокой чувствительностью. Кроме того, прототип недостаточно специфичен. Наличие в образце примесей РНК или чужеродной (например, микробной или растительной) ДНК приводит к искажению результатов, т.к. бромистый этидий образует флуоресцирующий комплекс с любой нуклеиновой кислотой.

Задачей изобретения является создание способа количественного определения геномной ДНК из микрообразцов тканей млекопитающих, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью.

Поставленная задача достигается тем, что проводят опытную и калибровочную ПЦР с разведениями стандартного образца геномной ДНК, продукты амплификации разделяют электрофорезом в агарозном геле, фотографируют окрашенную электрофореграмму в УФ-свете и сравнивают экстинкции ампликонов опытного и стандартного образцов. Способ осуществляют следующим образом.

Из тканей мыши выделяли ДНК и на спектрофотометре определяли ее концентрацию. Это - стандартный образец ДНК. Из него делали разведения в диапазоне от 0,002 до 0,05 мкг/мкл. Проводили амплификацию фрагмента гена бета-глобина мыши с образцами из серии разведения стандартной ДНК и параллельно с исследуемым образцом, который выделяли так же, как и стандартный образец. Для ПЦР использовали праймеры к гену бета-глобина, являющемуся однокопийным в геноме мыши. Поскольку выбран однокопийный ген, не существует опасности искажения результатов, обусловленной индивидуальными внутривидовыми колебаниями копийности гена-мишени. Кроме того, ген бета-глобина отсутствует в геноме микроорганизмов и растений. Проводили электрофорез ампликонов в агарозном геле, окрашивали раствором бромистого этидия и получали цифровое изображение электрофореграммы. С помощью программы анализа графических объектов измеряли экстинкцию окрашенных полос ампликона и строили калибровочный график зависимости оптической плотности ампликона от концентрации ДНК в разведенных образцах стандартной ДНК. По калибровочному графику (см. фиг.1) определяли концентрацию ДНК в исследуемом образце.

Пример конкретного выполнения.

Стандартная ДНК была выделена из печени мыши. Определение концентрации ДНК проводили на спектрофотометре при длине волны 260 нм. Она составила 0,4 мкг/мкл. Сделали разведения стандартной ДНК. Концентрация составляла: 0; 0,005; 0,01; 0,02 и 0,04 мкг/мкл.

Исследуемый образец - ДНК, выделенная из амниотической оболочки 10,5-суточного эмбриона мыши.

Праймеры к гену бета-глобина мыши: 5'-CCACAGATCCTATTGCCATGCCC-3' - прямой, 5'-CATAAGACCCCAGTAATGAGCC-3' - обратный. Длина ампликона составляет 501 пару оснований.

Состав реакционной пробы.

Реакционная проба в объеме 20 мкл имела следующий состав.

реагент	Конечная концентрация
Стерильная деионизованная вода	-
10 × Taq буфер "Sintol"	1х
2 mM dNTP "Fermentas"	0,2 мМ
Праймер прямой	0,2 мкМ
Праймер обратный	0,2 мкМ
Taq ДНК полимераза 5Е/мкл Termostar "Sintol"	2Е
25 мМ MgCl2	2,5 мМ
ДНК-матрица	1,5 мкл

Режим амплификации: 95° - 5 мин (95° - 30 сек, 57,5° - 1 мин, 72° - 30 сек) - 30 циклов, 72° - 10 мин. Проводили амплификацию стандартных и исследуемых образцов на амплификаторе «Терцик». По окончании реакции по 10 мкл реакционной смеси вносили в лунки 1,5% агарозного геля и проводили электрофорез. Гель окрашивали раствором бромистого этидия и фотографировали аппаратом Olimpus флуоресценцию электрофореграммы в УФ-свете. С помощью программы PhotoM 1.31 измерили оптическую плотность полос ампликонов в стандартных и исследуемых образцах. Результаты представлены на фиг.2, графике и в таблице.

Таблица 1. Результаты измерения экстинкции ампликонов на электрофореграмме с помощью программы PhotoM 1.31.
№ пробы	Ст1	Ст2	Ст3	Ст4	Ст5	Амн № 6
Концентрация ДНК в стандартных образцах мкг/мкл	0	0,005	0,01	0,02	0,04	?
Оптическая плотность стандартных образцов	0	0,0802	0,147	0,229	0,407	0,168