способ выделения биолюминесцентных бактерий

Формула изобретения

Способ выделения биолюминесцентных бактерий, предусматривающий приготовление питательной среды, включающей дистиллированную воду, хлористый натрий, питательную основу, посев на нее культур бактерий, сконцентрированных из морской воды на мембранном фильтре, и выращивание при комнатной температуре в течение 22-24 ч, с последующим выделением чистых культур биолюминесцентных бактерий, отличающийся тем, что предварительно определяют концентрацию хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий, и для приготовления питательной среды хлористый натрий в дистиллированную воду добавляют в концентрации соответствующей значению концентрации его в морской воде, а в качестве питательной основы используют сухой питательный агар в количестве 34,0-36,0 г на 1 л дистиллированной воды.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при конструировании питательных сред для выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды.

Известен способ выращивания штамма люминесцентных бактерий Photobacterium leiognathi, который используется при определении токсичности сред [1]. Для выращивания штамма люминесцентных бактерий Photobacterium leiognathi используют:

среду Егоровой: NaCl 30,0 г; КН₂PO₄ 1,0 г; MgSO₄ 0,5 г; пептон 10,0 г; рыбная вытяжка 0,5 л; агар-агар 18,0 г; водопроводная вода 0,5 л; рН 7,4 (устанавливают 40%-ным NaOH);

полусинтетическую среду (г на 1 л дистиллированной воды): NaCl 30,0; КН₂PO₄ 1,0; Na₂HPO₄·12Н₂O 10,0; MgSO₄·7Н₂O 0,2; (NH₄) ₂HPO₄ 0,5; пептон Chemapol 5,0 (пептон Difco 10,0); глицерин 3 мл; агар-агар 20,0; рН 7,0;

минимальную среду (г на 1 л дистиллированной воды): NaCl 30,0; КН₂ PO₄ 1,0; Na₂HPO₄·12Н ₂O 10,0; MgSO₄·7Н₂O 0,2; (NH ₄)₂ HPO₄ 0,5; глицерин 3 мл или глюкоза 4 г; рН 7,0.

Недостатком известного способа является сложность изготовления питательных сред и относительно высокая стоимость составляющих ее компонентов.

Наиболее близким к предложенному способу является выбранный в качестве прототипа способ выделения и культивирования светящихся бактерий [2], включающий приготовление питательной среды, посев на нее светящихся бактерий и выращивание при комнатной температуре в течение 23-25 часов. Питательная среда содержит дистиллированную воду 1,0 л; гомогенат судака 500 г; NaCl 30,0 г; пептон 10,0 г; аспарагин 5,0 г; КН₂PO₄ 1,0 г; MgSO ₄·7Н₂О 0,5 г; агар-агар 20,0 г; рН 7,2-7,4.

Недостатком известного способа является низкий выход светящихся бактерий, а также сложность изготовления питательной среды и относительно высокая стоимость составляющих ее компонентов.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение выхода биолюминесцентных бактерий при удешевлении питательной среды.

Указанная задача достигается тем, что в способе выделения биолюминесцентных бактерий, предусматривающем приготовление питательной среды, включающей дистиллированную воду, хлористый натрий, питательную основу, посев на нее культур бактерий, сконцентрированных из морской воды на мембранном фильтре, и выращивание при комнатной температуре в течение 22-24 часов, с последующим выделением чистых культур биолюминесцентных бактерий, согласно изобретению предварительно определяют концентрацию хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий, и для приготовления питательной среды хлористый натрий в дистиллированную воду добавляют в концентрации, соответствующей значению концентрации его в морской воде, а в качестве питательной основы используют сухой питательный агар в количестве 34,0-36,0 г на 1 л дистиллированной воды.

В предложенном способе благодаря предварительному определению концентрации хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий и добавлению хлористого натрия в дистиллированную воду в концентрации, соответствующей концентрации его в морской воде, создается соленость питательной среды, которая оптимальна для максимального роста выделенных в этом районе моря биолюминесцентных бактерий.

При этом использование в питательной среде в качестве питательной основы сухого питательного агара и уменьшение количества компонентов значительно упрощает и удешевляет способ выделения биолюминесцентных бактерий по сравнению с прототипом.

Совокупность отличительных признаков описываемого способа обеспечивает достижение поставленной задачи.

Сравнение прототипа с заявляемым решением показало, что указанные выше признаки являются отличительными, в связи с чем заявляемый способ соответствует критерию "новизны".

Способ осуществляется следующим образом.

Определяют концентрацию хлористого натрия в морской воде в районе выделения биолюминесцентных бактерий. Готовят питательную среду на дистиллированной воде. В нее добавляют хлористый натрий в количестве, соответствующем определенному значению солености, а также сухой питательный агар в количестве 34-36 г на 1 л дистиллированной воды. На среду производят посев бактерий, сконцентрированных из морской воды на мембранном фильтре, и выращивают при комнатной температуре в течение 22-24 часов, с последующим выделением чистых культур биолюминесцентных бактерий.

Пример 1. Контрольную питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили следующим образом: в 1 л дистиллированной воды добавляли измельченного судака - 500 г; NaCl - 30,0 г; пептона - 10,0 г; аспарагина - 5,0 г; КН₂PO₄ - 1,0 г; MgSO₄·7Н₂O - 0,5 г; агар-агара - 20,0 г; рН среды 7,4.

Питательную среду стерилизовали при 111°С в течение 20 мин. Охлажденную до 45°С среду разливали в стерильные чашки Петри, рН среды 7,4±0,1.

Проводили концентрирование бактерий из морской воды (Черного и Азовского морей) методом мембранных фильтров и выращивали их на контрольной питательной среде при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Данные приведены в таблице 1.

Пример 2. Для приготовления питательной среды использовали питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой, который готовят из сухого препарата промышленного производства.

В предлагаемом способе использовался сухой питательный агар производства ФГУП «НПО «МИКРОГЕН» МЗ РФ следующего состава (в г)

Панкреатический гидролизат кильки	17,9
Агар микробиологический	11,2±1,2
Натрия хлорид	7,7±0,2
рН	7,3±0,2

Приготовили его следующим образом:

32 г сухого питательного агара размешали в 1 л дистиллированной воды, прокипятили 1-2 мин до полного расплавления агара. Профильтровали через ватно-марлевый фильтр, разлили в стерильные емкости.

Затем добавили NaCl - 30,0 г, т.е. концентрация хлористого натрия или соленость воды составила 30 . Простерилизовали автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. Охлажденную до 45°С среду разливали в стерильные чашки Петри слоем 3-4 мм, рН среды 7,4±0,1.

Готовая среда в чашках Петри прозрачная, желтого цвета.

Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Дополнительно измеряли соленость, т.е. концентрацию хлористого натрия в этой воде, которая для данных районов Азовского моря составила 10 , а Черного моря - 17 . Фильтры с бактериями помещали на поверхность приготовленной питательной среды и выращивали при комнатной температуре в течение 22 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Данные приведены в таблице 1.

Пример 3. Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примеру 2. Сухой питательный агар добавляли в количестве 33,0 г на 1 л дистиллированной воды, NaCl добавляли в количестве 22,0 г на 1 л дистиллированной воды, т.е. концентрация хлористого натрия или соленость воды составила 22 . Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Фильтры с бактериями помещали на поверхность приготовленной питательной среды и выращивали при комнатной температуре в течение 23 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Данные приведены в таблице 1.

Пример 4. Методом мембранных фильтров проводили концентрирование бактерий из воды, отобранной в Азовском и Черном морей. Дополнительно измеряли соленость этой воды, которая для этих районов Азовского моря составила 10 , а Черного моря - 17 .

Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примеру 2, 3, сухой питательный агар - 34,0 г на 1 л дистиллированной воды, NaCl добавляли в количестве 17,0 г на 1 л дистиллированной воды, т.е. соленость воды составляла 17 .

Фильтры с бактериями помещали на питательную среду и выращивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет.

Данные приведены в таблице 1.

Пример 5. Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Дополнительно измеряли соленость этих вод, которая для этих районов морей составила 17 и 10 соответственно.

Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примерам 2-4, но NaCl добавляли в количестве 10,0 г на 1 л дистиллированной воды, т.е. соленость воды устанавливали 10 ; сухой питательный агар добавляли в количестве 36,0 г на 1 л дистиллированной воды.

Фильтры с бактериями помещали на поверхность приготовленной питательной среды и выращивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет.

Данные приведены в таблице 1.

Пример 6. Питательную среду для культивирования биолюминесцентных бактерий готовили по примерам 2-5, но NaCl добавляли в количестве 5 г, т.е. соленость воды устанавливали 5 ; сухой питательный агар добавляли в количестве 37,0 г на 1 л дистиллированной воды.

Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров. Фильтры с бактериями помещали на поверхность приготовленной питательной среды и выращивали при комнатной температуре в течение 23 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет.

Данные приведены в таблице 1.

Количество колоний биолюминесцентных бактерий, выросших на фильтрах, помещенных на питательные среды с различной концентрацией хлористого натрия, представлено в таблице 1.

Таблица 1
Пример	Содержание NaCl в дистиллированной воде в %	Выход колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из разных морских сред
Черного моря	Азовского моря
1	Контрольная	2-3	1-3
2	30	3-4	1-2
3	22	5-6	2-3
4	17	8-9	3-4
5	10	2-3	6-8
6	5	0-1	2-3

Как видно из таблицы 1, наибольшее количество колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из Черного моря, выросло на питательной среде, где концентрация хлористого натрия составляет 17 , т.е. 17 г на 1 л дистиллированной воды, что соответствует солености 17 района Черного моря, откуда выделены аборигенные биолюминесцентные бактерии (пример 4); а наибольшее количество биолюминесцентных бактерий, выделенных из Азовского моря, выросло на питательной среде, в которой концентрация хлористого натрия составляет 10 , т.е. 10,0 г на 1 л дистиллированной воды, что соответствует концентрации хлористого натрия или солености 10 воды в районе Азовского моря, откуда выделены аборигенные биолюминесцентные бактерии (пример 5).

Таким образом, предложенный способ, используя более простую и дешевую питательную среду, в 2,5-4,0 раза повышает выход колоний биолюминесцентных бактерий по сравнению со средой-прототипом.

Источники информации

1. Авт. свид. № 1484829 МКИ C12N 1/20.

2. Родина А.Г. Методы водной микробиологии» Ленинград: Наука 1965 г., стр.297-298 (прототип).