способ удаления суммарных растворенных веществ (tds) из сточных вод кожевенных заводов

Формула изобретения

1. Бактериальный штамм МТСС 5097, пригодный для уменьшения суммарного содержания растворенных твердых веществ в необработанных или в обработанных путем электрофлотации сточных водах кожевенного завода.

2. Способ приготовления инокулята штамма МТСС 5097 по п.1, предназначенного для уменьшения содержания суммарных растворенных веществ в необработанных или в обработанных путем электрофлотации сточных водах кожевенных заводов, включающий следующие этапы:

а) культивирование указанного штамма на питательной среде с агаром, содержащей почвенный экстракт и питательный агар, с целью получения чистой культуры;

b) инокуляцию штамма в питательный бульон с целью получения посевного материала;

с) инкубацию посевного материала при примерно 37°С в течение примерно 16-18 ч при перемешивании предпочтительно со скоростью 100 об/мин;

d) инокуляцию питательного бульона посевным материалом до тех пор, пока оптическая плотность культуры не достигнет значения 1,0;

е) сбор клеток из культуры с целью получения осадка;

f) промывание осадка 0,05 М фосфатным буфером, рН 6,8;

g) центрифугирование промытого осадка;

h) суспендирование промытого осадка в минимальном количестве сточных вод, и

i) гомогенизацию указанного осадка с целью получения фракции клеток, способных снижать уровень суммарных растворенных веществ в сточных водах кожевенных заводов.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что на стадии (а) указанный штамм культивируют при температуре в диапазоне 37±2°С в течение 16-24 ч.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что питательный бульон содержит 5,0 г пепсинового гидролизата животной ткани, 5,0 г хлорида натрия, 1,5 г мясного экстракта, 1,5 г дрожжевого экстракта и приблизительно 0,2 мл Tween-80.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный штамм центрифугируют со скоростью 6000-7000 об/мин при температуре примерно 4°С в течение 20 мин.

6. Способ по п.2, отличающийся тем, что осадок бактерий после центрифугирования промывают 0,05 М фосфатным буфером, рН 6,8.

7. Аэробный способ уменьшения суммарного содержания растворенных веществ (TDS) в сточных водах кожевенного завода с использованием бактериального штамма МТСС 5097 по п.1, включающий следующие стадии: а) внесение штамма МТСС 5097 в сточные воды кожевенного завода и инкубацию при температуре 37°С и перемешивании около 100 об/мин.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что соотношение сточных вод к биомассе составляет 1:1.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что сточные воды кожевенного завода представляют собой необработанные или обработанные путем электрофлотации сточные воды кожевенного завода.

10. Способ по п.7, отличающийся тем, что рН сточных вод составляет около 7,0.

11. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что при инкубации около 24 ч уменьшение суммарного содержания растворенных твердых веществ в необработанных сточных водах кожевенного заводов составляет около 8,5%.

12. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что при инкубации около 48 ч уменьшение суммарного содержания растворенных твердых веществ в необработанных сточных водах кожевенного заводов составляет около 8,3%.

13. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что при инкубации около 24 ч уменьшение суммарного содержания растворенных твердых веществ в необработанных сточных водах кожевенного завода составляет около 11,1%.

14. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что при инкубации около 48 ч уменьшение суммарного содержания растворенных твердых веществ в необработанных сточных водах кожевенного заводов составляет около 10,7%.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается бактериального штамма, депонированного под номером МТСС 5097, пригодного для уменьшения содержания суммарных растворенных веществ (TDS, total dissolved solids) как в не обработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов, а также способа приготовления инокулята (определенной дозы) настоящего штамма с целью уменьшения содержания TDS как в не обработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов, и аэробного способа уменьшения содержания TDS в сточных водах кожевенных заводов с использованием настоящего штамма.

Уровень техники

Тот факт, что сброс сточных вод, содержащих опасные соединения, в окружающую среду вносит существенный вклад в накопление биоаккумулируемых и не разлагаемых загрязняющих веществ, хорошо известен. Кожевенная индустрия классифицируется как «красная индустрия» (red industry) благодаря высокой загрязняющей способности ее твердых и жидких отходов. Она производит отходы, которые зачастую накапливаются в окружающей среде, несмотря на попытки контролировать этот процесс. Таким образом, окружающая нас среда находится под всевозрастающим давлением со стороны твердых и жидких отходов, производимых кожевенной индустрией.

Обработка и выделка кожи включает в себя применение разнообразных агрессивных химикатов, она также требует огромного количества воды, из которой около 90% сбрасывается в виде сточных вод. Сточные воды кожевенных заводов - это сложная смесь биогенных веществ кожсырья и большого разнообразия органических и неорганических химикатов, добавляемых в процессе дубления кожи. Химикаты, такие как сульфиды, сульфаты, кислоты, щелочи, отработанные галогено- или не галогенозамещенные органические растворители, а также хром, применяются при обработке и выделке кожи. Все эти соединения в той или иной форме присутствуют и в сточных водах, что приводит к общему увеличению содержания в сточных водах суммарных растворенных веществ (TDS), включающих в себя как органические, так и неорганические компоненты (М.Bosnic et al., 2000). Загрязняющие вещества сточных вод кожевенных заводов также включают гниющие органические материалы, сульфиды, соли и гидроксиды Са, Na, К и Cr, разнообразные фенольные соединения, органические кислоты, альдегиды, амины, консерванты и т.д. (Kadam, 1990; Ramanujam, R.A., 1995), которые также вносят вклад в уровень TDS в сточных водах. Многие из таких неорганических ионов и органических соединений являются биологически утилизируемыми. Однако некоторые из них остаются нереакционноспособными и вносят вклад в общую токсичность.

Использование хлорида натрия в процессе консервации (для хорошей сохранности) сырого (необработанного) материала обуславливает основной вклад в высокий уровень TDS в сточных водах кожевенных заводов. Большинство высококачественного кожсырья и кожи консервируется в процессе засаливания с использованием обычной соли в соотношении от 30 до 50% к массе невыделанной шкуры/кожи. Это наиболее распространенный процесс консервации, поскольку:

- консервация путем высушивания ограничивается жаркими странами, где соль и источники энергии являются дорогими;

- немедленная обработка кожсырья и мехов нуждается в источниках сырых материалов постоянного качества и количества;

- консервация путем замораживания кожсырья и кожи возможна только в тех странах, где энергия является дешевой и где скотобойные предприятия уже оснащены соответствующим холодильным оборудованием;

- другие консервирующие химикаты, применяемые для кратковременной консервации, не пригодны для длительной консервации.

Кроме процесса консервации, некоторое количество хлорида натрия также необходимо для процедур протравливания, предшествующих дублению. Другие этапы обработки на кожевенных заводах, а именно вымачивание, золение-обеззоливание, обработка растворами для размягчения и обезжиривание также вносят свой вклад в общее количество суммарных растворенных веществ, поскольку на каждой стадии сбрасываются сточные воды, содержащие такие неорганические компоненты, как сульфаты, сульфиды, карбонаты, бикарбонаты и кальций. Некоторые из органических компонентов, таких как пептидные фракции, дубильные вещества и фенольные соединения, также сбрасываются.

Органические фракции сточных вод кожевенных заводов и очищенных сточных вод, как правило, характеризуются по таким показателям, как «химическое потреблением кислорода» (COD, chemical oxygen demand) и «биохимическим потреблением кислорода» (BOD, biochemical oxygen demand). На сегодняшний день более подробные исследования органической составляющей сточных вод кожевенных заводов и их очистки все еще отсутствуют (Rudolf, 1997). Тем не менее, такой важный параметр, как содержание TDS, очень часто не оценивается. Преимущественно это происходит из-за отсутствия возможности применения эффективных технологий для удаления этого компонента загрязнения. Концентрация TDS в сточных водах кожевенных заводов может достигать 7000 мг/л, что вызывает беспокойство, которое обусловлено разнообразием проблем, причиной которых может явиться высокое содержание TDS.

Содержание TDS говорит о суммарном количестве как органических, так и неорганических соединений, которые в различных случаях могут сохраняться в неизменном виде и обеспечивать кумулятивный токсический эффект (Genschow et al, 1996). Основные компоненты неорганических растворенных твердых частиц включают в себя ионы кальция, магния, натрия, калия, бикарбонаты, сульфаты, хлориды и т.д. Растворенные неорганические твердые частицы важны для внутреннего баланса определенных водных организмов. Изменения в количестве растворенных твердых частиц могут быть губительными, поскольку концентрация TDS определяет перемещение воды в клетки и из клеток у водных организмов. Высокие концентрации TDS могут снизить чистоту и прозрачность воды, что приводит к ослаблению эффективности фотосинтеза и вместе с токсичными соединениями и тяжелыми металлами вызывает увеличение температуры воды. Во многих случаях это может быть губительным для множества водных организмов.

TDS не только изменяют качество воды, но также вносят вклад в ее загрязнение. Концентрация 2100 мг/л является допустимым пределом для TDS в воде согласно стандартам ЕРА. Тем не менее, данный предел не является достаточно строгим, если принять во внимание тот факт, что концентрация TDS более чем 1200 мг/л может являться токсичной как для водных систем, так и для человека. ЕРА устанавливает для питьевой воды верхний предел TDS в 500 мг/л. Следовательно, даже если допустимый уровень TDS в сточных водах достаточно высок, вода с указанными выше концентрациями TDS разрешена для сброса из-за того, что отсутствуют возможности применения подходящих методов для уменьшения содержания TDS. Очистка сточных вод приводит к удалению большинства суспендированных твердых частиц, большой доли растворенных органических соединений и азота, но не оказывает практически никакого эффекта на содержание TDS.

Наиболее доступные технологии уменьшения количества TDS включают в себя физико-химические методы очистки. К ним относятся, например, обратный осмос (RO, reverse osmosis), электродиализное реверсирование (EDR, electrodialysis reversal), заморозка и дистилляция (freezing & distillation) и ионный обмен (ion exchange).

А) Процесс обратного осмоса (RO) - это процесс мембранного разделения, при котором подающаяся вода протекает вдоль поверхности мембраны под давлением. Очищенная вода проникает через мембрану и собирается, в то время как концентрированная вода, содержащая растворенные и нерастворенные материалы, которые не проходят сквозь мембрану, сбрасывается либо в дренажную систему, либо на поверхность почвы, загрязняя, таким образом, также и почвенные воды. Применение данной технологии требует больших затрат на установку и содержание оборудования и в настоящее время используется только для удаления TDS из питьевой воды.

B) Электродиализное реверсирование (EDR) - в данном процессе полупроницаемая мембрана используется так, что ионы мигрируют сквозь мембрану из менее концентрированного раствора в более концентрированный раствор в результате притяжения ионов под воздействием прямого электрического тока. Данный процесс не пригоден для больших концентраций ионов определенных металлов и ограничен в приложении водой с концентрацией TDS менее чем 3000 мг/л и, кроме того, требует значительных энергетических затрат. Проблема избавления от накопленных твердых частиц также является отрицательным фактором для применения этого метода в случае сточных вод промышленных предприятий.

C) Заморозка и дистилляция может быть использована при наличии больших концентраций TDS, как в случае морской или соленой воды (более чем 3000 мг/л).

D) Ионный обмен: Данная технология основана на селективном ионном обмене между различными ионно-обменными матрицами. Однако область ее применения ограничивается водой с низкой концентрацией TDS.

Таким образом, биологические методы очистки являются крайне важными, так как они не оказывают неблагоприятного воздействия на окружающую среду, как это происходит в случае физико-химических процессов очистки (Bajpai et. al, 1994), которые также являются экономически обременительной индустрией из-за дорогостоящей инфраструктуры и расходов на содержание необходимого для их реализации оборудования. Кроме того, проблема накопления тех же компонентов в какой-либо другой форме, в каком-либо другом месте - это еще один решающий недостаток, который можно преодолеть, применяя биологические методы очистки.

Следовательно, наилучшим из возможных подходов для решения вышеупомянутой проблемы является разработка биологического метода уменьшения уровня содержания TDS.

Поскольку кожевенная индустрия утилизирует огромное количество воды и продуцирует значительные количества суммарных растворенных веществ, которые обуславливают устойчивую деградацию воды, это диктует срочную необходимость селекции и адаптации микроорганизмов, которые были бы способны уменьшать количество TDS в сточных водах кожевенных заводов (Kapoor et al, 1998, Kumar et al, 1998). Поэтому авторы данного изобретения придали особое значение необходимости изолировать из естественной среды бактерию, способную уменьшать уровень TDS в сточных водах. Первоначально изучался консорциум бактерий, но впоследствии было показано, что индивидуальный штамм бактерий также способен на это.

Сущность изобретения

Главная цель настоящего изобретения - изолировать бактериальный штамм для уменьшения содержания суммарных растворенных веществ (TDS) как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов.

Другая главная цель настоящего изобретения - изолировать различные бактерии для уменьшения содержания TDS как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов.

Кроме того, другая цель настоящего изобретения - разработка аэробного метода уменьшения содержания TDS в сточных водах кожевенных заводов с использованием бактериального штамма В5 (Accession № 5097).

Кроме того, другая цель настоящего изобретения - установление соотношения массы сточных вод к биомассе для получения наилучших показателей уменьшения уровня TDS.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение касается бактериального штамма, депонированного в международном депозитарии МТСС (Chandigarn, Индия) согласно Будапештскому соглашению под номером МТСС 5097, пригодного для уменьшения содержания суммарных растворенных веществ (TDS) как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов, способа приготовления инокулята настоящего штамма с целью уменьшения содержания TDS как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов, а также аэробного способа уменьшения содержания TDS в сточных водах кожевенных заводов с использованием настоящего штамма.

Штамм МТСС 5097 был выделен из активированного шестимесячного осадка из резервуара сточных вод кожевенного завода, расположенного в Индии. Депонированный штамм был идентифицирован как Exignobacterium s. Штамм представляет собой грампозитивные, палочковидные неподвижные бактерии. Указанный штамм не способен синтезировать цитохром С-оксидазу (оксидазонегативный) и способен образовывать кислоты из глицерина, целлобиозы, Д-маннозы, маннита, метил- -Д-глюкозида, амигдалина и арбутина. Штамм Exiguobacterium sp. (МТСС 5097), пригодный для уменьшения суммарного содержания растворенных твердых веществ (TDS) как в необработанных, так и в обработанных путем электрофлотации сточных водах кожевенного завода, был выделен с помощью способа, включающего стадии:

(а) обогащение почвы в стерильной колбе, содержащей почвенный экстракт и среду питательного бульона;

(b) выделение бактерий с использованием смеси почвенного экстракта и питательного агара;

(с) культивирование бактерий, выделенных на этапе (b) в определенных условиях;

(d) центрифугирование культур после достижения быстрого роста;

(е) сбор осадка бактерий и его растворение в фосфатном буфере;

(f) определение способности выделенных бактерий снижать TDS путем добавления осадка как отдельных бактерий, так и консорциума бактерий в сточных водах кожевенного завода и регистрация снижения TDS;

(g) отбор бактериальных штаммов, которые могут максимально снизить TDS в течение минимального времени;

(h) культивирование отобранных бактерий на агаровой питательной среде в определенных условиях до достижения стадии быстрого роста;

(i) центрифугирование культуры после достижения быстрого роста;

(j) сбор осадка бактерий и растворение в фосфатном буфере;

(k) уменьшение TDS в сточных водах кожевенного завода путем добавления осадка бактерий и регистрация снижения TDS.

Стадию (а) проводили в течение 72-96 часов при скорости перемешивания 100-120 об/мин и при температуре в диапазоне 35-37°С. Соотношение почвенного экстракта к питательной среде находилось в диапазоне 1:1-1:2. На стадии (с) бактерии культивировали при значении рН в диапазоне 6,8-7,2 и температуре в диапазоне 37±2°С в течение 16-24 часов. Питательный бульон содержал 5,0 г пепсинового гидролизата животной ткани, 5,0 г хлорида натрия, 1,5 г мясного экстракта, 1,5 г дрожжевого экстракта и приблизительно 0,2 мл Tween -80. Культуру, полученную на стадии (с), центрифугировали после достижения быстрого роста, что определяется с помощью измерения оптической плотности, которая достигает диапазона 1,5-2,0. Почву для выделения получали из трубопровода установки для обработки стоков кожевенного завода, расположенного в Индии. Обогащение почвы проводили в колбе автоклава, в которую вводят 5-7 г свежей почвы, содержащей 100-110 мл почвенного экстракта, 50 мкл Candid В и основную карбонатную среду. Почвенный экстракт получали путем центрифугирования стерилизованной почвенной смеси со скоростью 4000 об/мин в течение 20 мин. Стерилизованную почвенную смесь получали путем смешивания высушенной почвы с дистиллированной водой в соотношении 1:3 и обработки смеси в автоклаве под давлением около 105 кПа (15 фунт/кв.дюйм) в течение 1 часа. Выделенные бактериальные штаммы культивировали при определенных условиях среды, температуры, рН и источника углерода. Культуры центрифугировали со скоростью 5000-7000 об/мин при температуре 1-4°С в течение 20 мин после достижения быстрого роста, что определяли по величине оптической плотности около 1,5. Осадок бактерий после центрифугирования промывали 0,05 М фосфатным буфером, рН 6,8. Для отбора штаммов, эффективно снижающих содержание растворенных твердых веществ в сточных водах кожевенного завода, у всех полученных бактериальных штаммов и их консорциумов проверяли способность уменьшать содержание TDS в сточных водах кожевенного завода в течение заданного времени.

В другом воплощении данного изобретения, в котором способ приготовления инокулята настоящего штамма имеет целью уменьшение содержания TDS как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов, вышеупомянутый метод включает следующие стадии:

a) изолирование штамма;

b) культивирование штамма на питательной среде с агаром, содержащей почвенный экстракт и питательный агар с целью получения чистой культуры;

c) инокуляцию штамма в питательный бульон с целью получения закваски;

d) инкубацию закваски примерно при 37°С в течение приблизительно 16-18 часов и предпочтительно при перемешивании со скоростью 100 об/мин;

e) инокуляцию питательного бульона закваской до тех пор, пока оптическая плотность культуры не достигнет значения 1,0;

f) сбор клеток из культуры с целью получения осадка;

g) промывание осадка путем его растворения в 0,05 М фосфатном буфере, рН 6,8;

h) центрифугирование с целью получения промытого осадка;

i) растворение промытого осадка в минимальном количестве сточных вод и

j) гомогенизацию растворенного осадка с целью получения фракции клеток, способных снижать уровень TDS в сточных водах кожевенных заводов.

В другом воплощении настоящего изобретения, где штамм выращивается на среде с агаром при примерно 37±2°С в течение примерно 16-24 часов.

В другом воплощении настоящего изобретения, где питательный бульон содержит около 5,0 г пепсинового перевара животных тканей (пептон), около 5,0 г хлорида натрия, около 1,5 г мясного экстракта, около 1,5 г дрожжевого экстракта и около 0,2 мл детергента Tween-80.

В другом воплощении настоящего изобретения конечная культура центрифугируется приблизительно при 6000 об/мин в течение около 20 минут при примерно 4°С.

В другом воплощении настоящего изобретения конечный осадок промывается посредством растворения в фосфатном (PO₄ ^-3) буфере с концентрацией 0,05 М и рН 6,8.

Другим воплощением настоящего изобретения является аэробный метод уменьшения количества TDS в сточных водах кожевенных заводов с использованием бактериального штамма, имеющего Accession № .5097 по пункту 1 формулы изобретения, где вышеуказанный метод включает следующие шаги:

a) инокуляцию сточных вод с целью получения суспензии клеток;

b) инкубацию суспензии клеток при примерно 37°С при вращении со скоростью приблизительно 100 об/мин;

c) оценку уровней TDS с использованием модифицированного АРНА метода.

В другом воплощении настоящего изобретения соотношение массы сточных вод к биомассе изменяется в пределах от 1:3 до 3:1.

В другом воплощении настоящего изобретения соотношение массы сточных вод к биомассе составляет около 1:1.

В другом воплощении настоящего изобретения сточные воды кожевенных заводов являются необработанными и электрофлотированными сточными водами кожевенных заводов.

В другом воплощении настоящего изобретения данный штамм демонстрирует процент уменьшения TDS в необработанных сточных водах кожевенных заводов около 8,5% при продолжительности времени инкубации около 24 часов.

В другом воплощении настоящего изобретения, где данный штамм демонстрирует процент уменьшения TDS в необработанных сточных водах кожевенных заводов около 8,3% при продолжительности времени инкубации около 48 часов.

В другом воплощении настоящего изобретения, где данный штамм демонстрирует процент уменьшения TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов около 11,1% при продолжительности времени инкубации около 24 часов.

В другом воплощении настоящего изобретения, где данный штамм демонстрирует процент уменьшения TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов около 10,7% при продолжительности времени инкубации около 48 часов.

В другом воплощении настоящего изобретения рН сточных вод составлял около 7,0.

Штамм настоящего Приложения депонирован в Международном депозитарии (International Depository). Его номер депонирования МТСС 5097. Депозитарий в настоящем Приложении называется Microbial Type Culture Collection (MTCC) в Chandigarh, INDIA. Недавно ему был присвоен статус Международного депозитария (International Depository) согласно Будапештскому соглашению (Budapest Treaty).

Как описано в предварительном патенте, в первоначальных экспериментах бактериальный консорциум был способен уменьшать уровень TDS в сточных водах кожевенных заводов приблизительно на 16% за пятнадцать дней. Однако с целью уменьшения времени инкубации были предприняты дальнейшие исследования. Это привело к приблизительно 11%-ому уменьшению уровня TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов и к приблизительно 8%-ому уменьшению - в необработанных сточных водах в течение 48 часов инкубации с использованием одного изолированного бактериального штамма, что определенно лучше, нежели необходимый ранее 15-дневный период инкубации в случае консорциума бактерий. Поэтому в полностью детализированном патенте представлены результаты, полученные при использовании индивидуального изолята бактерий, так как они определенно лучше, нежели те, что были получены с использованием бактериального консорциума.

Данное изобретение предусматривает новый аэробный биологический процесс, пригодный для уменьшения содержания TDS как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов. Также оно предусматривает бактериальный штамм, изолированный из специфического места (почвы), которое было обогащено такими солями, как сульфаты, карбонаты, хлориды, нитраты и т.д. Данный открытый изолят значительно уменьшает уровни TDS как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов. Данное изобретение также предусматривает модифицированный стандартный метод анализа содержания TDS.

Данное изобретение предусматривает новый аэробный биологический процесс, пригодный для уменьшения уровней TDS в сточных водах кожевенных заводов и модифицированный метод анализа TDS. Также оно представляет аэробный бактериальный изолят, способный значительно снижать содержание TDS как в электрофлотированных, так и в необработанных сточных водах кожевенных заводов.

Данное изобретение предусматривает новый аэробный биологический процесс, пригодный для уменьшения содержания TDS в сточных водах кожевенных заводов с использованием бактериального изолята и модифицированного метода анализа TDS.

Бактериальный изолят, являющийся предметом настоящего изобретения, пригоден для уменьшения уровней TDS в сточных водах кожевенных заводов.

Бактериальный изолят, являющийся предметом настоящего изобретения, был изолирован из почвы, полученной из высушенных сбрасываемых отходов из сооружений по очистке сточных вод кожевенных заводов.

5 г свежесобранной почвы из указанного выше места инокулируется в обогащающую среду. Обогащающая среда готовится путем добавления к 200 мл почвенного экстракта 1,3 г сухого питательного бульона (NB, Nutrient Broth), 67 мкл Candid В и автоклавирования при давлении 15 фунтов (Ibs) в течение 20 минут при 121°С.

Почвенный экстракт готовится из твердых отходов, собранных из разных мест. 1 кг твердых отходов высушивается при 50°С в течение 48 часов до тех пор, пока сохранится их очень незначительная влажность, подобная влажности садовой почвы.

400 г высушенных твердых отходов из каждого места автоклавируется в 960 мл чистой дистиллированной воды в течение 1 часа при давлении 15 фунтов (Ibs). После автоклавирования проба центрифугируется при 5000 об/мин в течение 10 минут при 5°С. Супернатант (почвенный экстракт) собирается и хранится в стерильных контейнерах для приготовления среды для выделения бактерий.

Готовится серия разведений обогащенных почвенных проб в N₂HPO₄-NaH₂ PO₄ буфере (рН 6,8, 0,05 М). По 100 мкл каждого соответствующего разведения несколькими сериями рассевают на чашки Петри, содержащие разные концентрации почвенного экстракта и питательного агара. Полученные таким образом чашки Петри инкубируют при 37±2°С в течение 16-24 часов в перевернутом положении.

Одиночные колонии скалывают с чашки и переносят на новую чашку, содержащую такую же среду. Этот шаг повторяют до тех пор, пока не будут получены чистые колонии.

Упомянутый выше бактериальный изолят инокулируется при помощи стерильной нихромовой петли в 15-20 мл стерильного питательного бульона (NB), содержащего (на 1 литр) 5,0 г пептона, 5,0 г хлорида натрия, 1,5 г мясного экстракта, 1,5 г дрожжевого экстракта и 0,2 мл Tween-80. Культуру инкубируют при 37°С в течение примерно 16-18 часов на термостатированной качалке. Для слабого перемешивания на термостатированной качалке поддерживается определенный режим, предпочтительно 100 об/мин. После достижения достаточного роста культуры бульон хранится при 4°С до дальнейшего использования. В 250 мл стерильного NB инокулируют 20 мкл приготовленной ранее начальной культуры. Колбу инкубируют при 37°С, 100 об/мин в течение 16-18 часов до тех пор, пока оптическая плотность (при 650 нм) не достигнет значения 1,0.

Клетки собираются центрифугированием при подходящих оборотах, предпочтительно при 6000 об/мин в течение 20 минут. Полученный в результате осадок дважды промывают путем его растворения в минимальном объеме фосфатного буфера, 0,05 М, рН 6,8 и центрифугирования при тех же условиях. В ходе центрифугирования поддерживается температура 4°С. Полученный таким образом осадок промывают в минимальном объеме соответствующих сточных вод и центрифугируют с целью минимизировать шанс попадания буферных солей в пробу, нивелируя, таким образом, шанс какого-либо увеличения за их счет количества суммарных растворенных веществ. Полученные таким образом осадки затем ресуспендируют в минимальном объеме соответствующих сточных вод, перемешивая на мешалке Vortex для получения гомогенной суспензии, и используют для уменьшения количества TDS в сточных водах кожевенных заводов.

В настоящем изобретении очищают как необработанные, так и электрофлотированные сточные воды с целью уменьшения содержания в них TDS. Для постановки эксперимента по уменьшению содержания TDS 250 мл пробы сточных вод отбирают в коническую колбу с завинчивающейся крышкой. Инокулят добавляют к пробе сточных вод после проверки рН сточных вод, который предпочтительно должен быть равен примерно 7,0. Для сравнения используют контрольную колбу, в которую инокулят не добавляется. Колбы инкубируют при 37°С, 100 об/мин в течение 24 часов.

Для оценки снижения уровней TDS были произведены модификации стандартного АРНА метода. Для проведения анализа отбирается и обрабатывается приблизительно 70 мл пробы. Отобранные пробы центрифугируют в сухих и чистых центрифужных пробирках (промытых троекратно дистиллированной водой) при 7000 об/мин в течение 20 минут, предпочтительно при 4°С. Супернатант отбирают незамедлительно в чистые и сухие контейнеры, предварительно промытые троекратно дистиллированной водой. Затем супернатант фильтруют через 0.45 мкм мембранный фильтр (Millipore). Затем отмеряют 25 мл с помощью чистого и предварительно промытого мерного цилиндра и переносят в чистый, высушенный и предварительно взвешенный лабораторный стакан. Мерный цилиндр затем троекратно промывают 20 мл дистиллированной воды и воду также переносят в стакан, содержащий пробу. Такая же процедура повторяется для обработки всех проб. Стаканы затем высушивают в сухожаровом шкафу при 180±2°С. После высушивания стаканы переносят в вакуумный осушитель и остужаются в течение примерно от 45 минут до одного часа до достижения комнатной температуры и затем взвешиваются.

Концентрация TDS (мг/л) рассчитывается с применением следующей формулы:

TDS(мг/л)=(А-В)/объем пробы,

где

А - конечный вес стакана с высушенным фильтратом

В - начальный вес стакана без пробы.

Данное изобретение в дальнейшем предусматривает процесс приготовления инокулята указанного бактериального изолята ( № МТСС 5097) и его использование для уменьшения содержания TDS как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов, который включает:

a) выделение бактериального изолята из почвы, полученной из высушенных сбрасываемых отходов из сооружений по очистке сточных вод кожевенных заводов;

b) культивирование данного бактериального изолята на питательной среде с агаром, содержащей различные концентрации почвенного экстракта, приготовленного из образцов почвы, собранных для получения чистой культуры;

c) инокуляцию указанным выше бактериальным изолятом питательного бульона, содержащего 0,01% Tween 80, с целью получения первичной культуры;

d) культивирование указанного выше бактериального изолята для получения необходимой биомассы путем инокуляции свежей среды определенной аликвотой питательного бульона первичной культурой и инкубирования этой среды при 37°С, 100 об/мин в течение 16-18 часов;

e) центрифугирование полученной в результате культуры, после достижения последней оптической плотности 1,0, для получения осадка, промывку собранного осадка посредством его растворения в фосфатном буфере, 0,05 М, рН 6,8, повторное центрифугирование осадка;

f) сбор осадка, полученного на стадии (е), его промывка посредством растворения в 10 мл соответствующих сточных вод и повторное центрифугирование с целью получения клеточного осадка для экспериментов по очистке;

g) растворение полученного выше осадка в минимальном объеме соответствующих сточных вод и гомогенизация посредством перемешивания на мешалке Vortex для получения суспензии клеток;

h) инокуляцию соответствующих аликвот сточных вод кожевенных заводов суспензиями клеток, полученными на стадии (g), для уменьшения содержания TDS в данных аликвотах, что осуществляется параллельно с контрольными колбами, содержащими пробы сточных вод без добавления каких-либо инокулятов;

i) инкубацию колб, приготовленных на стадии (h) при 37°С, 100 об/мин в течение 24 часов;

j) отбор проб в виде в 70 мл аликвот из указанных выше колб и их инкубация для определения уровней TDS;

k) анализ количества TDS в указанных выше пробах с использованием модифицированного АРНА метода, как описано в пункте (l);

l) центрифугирование указанных выше проб при 8000 об/мин в течение 20 минут и фильтрация супернатанта через 0,45 мкм мембранный фильтр (Milipore) с последующим использованием данного фильтрата для определения сухого веса;

m) анализ эффективности удаления TDS с помощью описанного выше бактериального изолята посредством сравнения уровня TDS в экспериментальных пробах с уровне TDS в контрольных пробах по прошествии 24 часов.

В воплощении настоящего изобретения бактериальный изолят выделялся из почвы, полученной из высушенных сбрасываемых отходов из сооружений по очистке сточных вод кожевенных заводов, путем его выращивания на определенной среде.

В другом воплощении настоящего изобретения указанным выше бактериальным изолятом инокулируется питательный бульон, содержащий 0,01% Tween 80, с целью получения первичной культуры.

В другом воплощении настоящего изобретения культура бактериального изолята готовится путем инокуляции питательного бульона первичной культурой.

В другом воплощении настоящего изобретения инкубация бактериального штамма проводится при слабом перемешивании при 100 об/мин.

В воплощении настоящего изобретения выращивание инкубируемой бактериальной культуры проводится при температуре 37°С в течение 16-18 часов.

В другом воплощении настоящего изобретения указанный выше бактериальный изолят после достижения значения оптической плотности, близкого к 1,0, центрифугировали при определенных оборотах, предпочтительно 6000 об/мин в течение примерно 20 минут при 4°С.

В последующем воплощении настоящего изобретения полученный в результате осадок промывается посредством его растворения в минимальном количестве фосфатного буфера, 0,05 М, рН 6,8, повторно центрифугируется при тех же условиях. В ходе центрифугирования поддерживается температура в 4°С.

В последующем воплощении настоящего изобретения полученный таким образом осадок промывается посредством его растворения в 10 мл сточных вод и центрифугируется в тех же условиях, что и ранее.

В воплощении настоящего изобретения полученный в результате осадок растворяется в минимальном объеме сточных вод и перемешивается на мешалке Vortex для получения гомогенной суспензии.

В одном из воплощений настоящего изобретения клеточная суспензия, полученная на предыдущей стадии, используется для инокуляции проб сточных вод для уменьшения содержания TDS.

Данное изобретение также предусматривает метод уменьшения уровней TDS в пробах как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных вод кожевенных заводов.

В другом воплощении настоящего изобретения колбы, содержащие представленные выше инокуляты, инкубируют при 37°С и 120 об/мин в течение 24 часов.

В другом воплощении настоящего изобретения количество TDS в указанных выше пробах анализируется с использованием модифицированного АРНА метода, как описано в следующем воплощении.

В последующем воплощении настоящего изобретения указанные выше пробы центрифугируются при 8000 об/мин в течение 20 минут.

В другом воплощении настоящего изобретения супернатант фильтруется через 0,45 мкм мембранный фильтр (Milipore) и в последующем используется для определения сухого веса.

В последующем воплощении настоящего изобретения уменьшение уровней суммарных растворенных веществ оценивается по прошествии периода в 24 часа.

Как описано в предварительном патенте, в первоначальных экспериментах бактериальный консорциум был способен уменьшать уровни TDS в сточных водах кожевенных заводов приблизительно на 16% за период в пятнадцать дней. Однако с целью уменьшить время инкубации были предприняты дальнейшие исследования. Это привело к приблизительно 11%-ому уменьшению уровней TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов и к приблизительно 8%-ому уменьшению в необработанных сточных водах за период в 48 часов с использованием одиночного изолированного бактериального штамма, что определенно лучше, нежели необходимый ранее 15-дневный период инкубации в случае консорциума бактерий. Поэтому в полностью детализированном патенте были представлены результаты, полученные при использовании индивидуального изолята бактерий, так как они определенно лучше, нежели те, что были получены с использованием бактериального консорциума.

Штамм настоящего Приложения депонирован в Международном депозитарии (International Depository). Его номер депонирования МТСС 5097. Депозитарий в настоящем Приложении называется Microbial Type Culture Collection (MTCC) в Chandigarh, INDIA. Недавно ему был присвоен статус Международного депозитария (International Depository) согласно Будапештскому соглашению (Budapest Treaty).

Представленное выше изобретение подтверждается с помощью нескольких примеров. Эти примеры служат исключительно иллюстрацией и не должны толковаться как исчерпывающие (либо ограничивающие) область применения настоящего изобретения.

Пример I

Бактерии были выделены как из необработанных, так и из электрофлотированных сточных вод из «общих очистных сооружений» (Common Effluent Treatment Plant) кожевенного завода. Значение рН сточных вод было проверено и составляло 7.0±0.2 для необработанных сточных вод и 8.3±0.2 для электрофлотированных сточных вод, которые были нейтрализованы 1N HCl. Различные среды, использованные для выделения, были следующими:

Среда А: Фильтрованная и автоклавированная сточная вода с агаром была использована в качестве среды. Сточно-водные агаровые чашки Петри были приготовлены с использованием 2% агара.

Среда В. Галофильная среда: Состав использовавшейся галофильной среды с различными концентрациями NaCl, а именно 1%, 2,5%, 5% и 10% был следующим (г/л):

KCl	2 г
MgSO4·7H 2O	20 г
Цитрат натрия	3 г
Дрожжевой экстракт (Oxoid)	10 г
Гидролизат казеина	7,5 г
FeCl2 ·4H2O	36 мг
MnCl 2·4H2O	0,36 мг
рН	7,0±0,2
Agar	2%

Была приготовлена серия разведений посредством последовательных разбавлений обогащенного инокулята до степени разведения 10^-12. Серия разведений была приготовлена путем инокуляции 1 мл обогащенного инокулята в 9 мл аликвоту NaH₂PO₄-Na₂HPO ₄ буфера (рН 6,8, 0,05 М) в первой пробирке, перемешивания и последующего отбора по 1 мл из данной пробирки и растворения его в следующей пробирке с 9 мл фосфатного буфера до тех пор, пока не было достигнуто разведение

10^-12 .

По 100 мкл из каждого разведения было рассеяно, раскапано и нанесено штрихом с помощью микробиологической петли на три чашки Петри с различной питательной средой с агаром. Полученные таким образом чашки инкубировали при 37±2°С в течение 16-24 часов в перевернутом положении.

Колонии, имеющие отчетливую морфологию, были отмечены, сколоты и посеяны на чашки с соответствующей средой для получения чистой культуры. Чистые культуры поддерживали на соответствующем скошенном агаре и агаровых столбиках, храня при 4°С для последующего использования в экспериментах.

Пятнадцать морфологически различных бактериальных изолятов были отобраны и были приготовлены их первичные культуры. Одна капля с микробиологической петли каждой культуры была инокулирована в стерильные аликвоты питательного бульона, перемешана и проинкубирована при 37°С, 120 об/мин в течение 16-18 часов. У данных первичных культур проверялась оптическая плотность при 650 нм, после чего они хранились при 4°С до дальнейшего использования. Рабочие культуры были приготовлены для проверки их способности уменьшать количество суммарных растворенных веществ в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов. 100 мл аликвоты стерильного NB были инокулированы 100 мкл соответствующих первичных культур и инкубировались при 37°С, 120 об/мин в течение 16-18 часов. Начальная и конечная оптическая плотность при 650 нм была записана. Культуры с оптической плотностью (OD ₆₅₀), равной 2,0, были взяты в тех же пропорциях, что и в составе консорциума, и смешаны вместе. Полученная в результате бактериальная суспензия была отцентрифугирована при 7000 об/мин в течение 20 минут при 4°С. Полученные осадки были дважды промыты с использованием стерильного фосфатного буфера (Na ₂HPO₄-NaH₂PO₄, рН 6,8, 0,05 М) и растворены в небольшом объеме того же буфера. Эта суспензия была в дальнейшем использована для эксперимента по оценке способности к очистке, в соотношении 1:1, то есть 100 мл проба сточных вод очищалось при помощи осадка, полученного из 100 мл культуральной среды.

Эксперименты по уменьшению содержания TDS проводились в пробах электрофлотированных сточных вод, содержащих смесь культур, в конических колбах для термостатируемой качалки при 37°С и 120 об/мин в течение периода в пятнадцать дней. Контрольные пробирки, без какого-либо дополнительного инокулята, были также проинкубированы и результаты сравнивались с этими пробами. Содержание TDS анализировалось через пятнадцать дней согласно стандартной процедуре, указанной в АРНА. Увеличение в уровнях TDS наблюдалось при увеличении удельной доли биомассы, что могло происходить из-за прохождения бактерий через GFC фильтр (размер пор 1,2 мкм), что вносит, таким образом, вклад в вес полученного остатка (таблица 1). Поэтому во всех следующих экспериментах применялся модифицированный метод анализа.

Пример II

Бактериальный консорциум был снова приготовлен и использован для проверки его эффективности в уменьшении содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов, с использованием модифицированной версии стандартного АРНА метода, как описано далее. Индивидуальные бактерии, входящие в состав консорциума, были выращены в аликвотах NB до O.D.₆₅₀ , равной 1,0. Обработка бактериального консорциума была проведена по той же схеме, что и в Примере I. 100 мл аликвоты проб были обработаны полученным консорциумом в соотношении 1:1. Анализ уровней TDS был проведен по прошествию периода в 15 дней с использованием модифицированного стандартного АРНА метода, как описано ниже.

Соответствующие аликвоты проб были отобраны и отцентрифугированы при 7000 об/мин в течение 20 минут. После чего супернатант фильтровался сквозь 0.45 мкм мембранный фильтр (Millipore). Затем объем фильтрата отмеряли с помощью чистого и предварительно промытого мерного цилиндра и переносили в чистый предварительно взвешенный лабораторный стакан. Перед переносом пробы, лабораторный стакан промывали троекратно дистиллированной водой, прожаривали в течение ночи при 180°С и предварительно взвешивали. Стаканы, содержащие пробы, затем высушивали в течение ночи в сухожаровом шкафу при 180°С. После высушивания стаканы остужали до комнатной температуры и взвешивали с целью определения массы оставшегося вещества. Затем были посчитаны точные количества TDS и выражены в мг/л (таблица 2). Максимальное уменьшение содержания TDS, около 4%, было зафиксировано в электрофлотированных пробах по прошествии периода в пятнадцать дней.

Пример III

Поскольку уменьшение содержания TDS было крайне небольшим даже по прошествии 15 дней, бактерии были выделены из промывочных вод стадии золения. Бактерии высевали на чашки с питательной средой на основе агара, используя метод разведений, описанный в Примере I. Изоляты поддерживали на соответствующем скошенном агаре и агаровых столбиках, храня при 4°С для последующего использования.

С использованием данных бактериальных изолятов, таким же образом, как это описано в Примере I, было создано три различных консорциума и оценена их эффективность в уменьшении содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов. Уровни TDS в пробах были проанализированы при помощи модифицированного метода анализа уровней TDS, как описано в Примере II. Уменьшение на 13-16% наблюдалось по прошествии 15 дней.

Пример IV

Индивидуальные бактерии, входящие в состав консорциума, использованного в примере III, были смешаны по-другому, с целью образовать другой консорциум, как это описано ранее, и проверены на их способность к уменьшению количества TDS как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов. Предыдущий консорциум демонстрировал 13-16% уменьшение содержания TDS по прошествии 15 дней. Таким образом, имея целью уменьшить время инкубации и также определить, можно ли достичь лучшей производительности путем перегруппировок нового консорциума. Эксперименты параллельно с контрольными экспериментами проводились по той же схеме, как это описано в Примере III, и анализ поводился по прошествии пяти дней. Уменьшение вплоть до 8,0% наблюдалось в случае электрофлотированных проб (таблица 4б) и до 5,0% в необработанных сточных водах (таблица 4а).

Пример V

Консорциумы, дающие более 7,0% уменьшения содержания TDS и более 4,5%, были отобраны, и изоляты входящих в их состав бактерий проверялись индивидуально. Индивидуальные бактериальные осадки приготавливались в соответствии с процедурой, описанной в Примере II. Однако промывка клеток проводилась посредством первой промывки фосфатным буфером (0,05 М, рН 6,8) и конечной промывки путем суспендирования растворенного в фосфатном буфере осадка в 10 мл соответствующих сточных вод. Суспензия затем центрифугировалась при 7000 об/мин в течение 20 минут, и полученные таким образом клетки растворяли в минимальном количестве сточных вод для использования при инокуляции соответствующих аликвот как необработанных, так и электрофлотированных сточных вод кожевенных заводов.

Уменьшение до 9,0% при применении изолята ЕТ7 в электрофлотированных пробах (таблица 5б) и до 7,0% в необработанных сточных водах (таблица 5а) наблюдалось по прошествии периода в 5 дней.

Пример VI

С целью дальнейшего повышения эффективности уменьшения содержания TDS было решено изолировать бактерии из различных проб, взятых из различных мест (участков) очистных сооружений сточных вод кожевенных заводов. Были отобраны сухие отходы из восьми разных мест, в которых собираются сточные воды в процессе переработки кожсырья до кожи. Места были следующими:

Место А: сбрасываемые отходы (место сброса отстоявшихся отходов и других отходов очистных сооружений сточных вод).

Место В: отходы используемых ранее резервуаров (место, которое ранее использовалось для сбора сточных вод от процессов хромового дубления, окрашивания и золения).

Место С: отходы очистки от извести (место сбора сточных вод и твердых отходов после очистки от извести кожсырья).

Место D: общие отходы (резервуар, где собирались сточные воды и твердые отходы от всех процессов обработки кожсырья, а именно от хромового дубления, окрашивания и процесса очистки от извести).

Место Е: отходы процесса хромового дубления (место сбора сточных вод процесса хромового дубления).

Место F: отстойник (очистные сооружения сточных вод кожевенного завода).

Место G: отходы окрашивания (резервуар сбора сточных вод процесса окрашивания кожсырья).

Место Н: Отходы процессов окрашивания и хромового дубления (резервуар сбора сточных вод процесса хромового дубления и окрашивания кожсырья).

Экстракт был приготовлен из 1 кг твердых отходов, собранных в каждом из мест, которые были высушены при 50°С в течение 48 часов до тех пор, пока влажность не достигла незначительных значений, сравнимых с влажностью садовой почвы. 400 г каждых из упомянутых выше твердых отходов было проавтоклавировано с 960 мл однократно дистиллированной воды в течение 1 часа при 15 psi. После автоклавирования пробы были отцентрифугированы при 6000 об/мин в течение 10 минут при 5°С. Супернатанты (почвенные экстракты) были собраны и хранились в стерильных контейнерах для приготовления различных сред.

Обогащающая среда была приготовлена путем добавления в 200 мл соответствующего экстракта из каждого места 1,3 г NB и 67 мкл Candid В, проавтоклавирована при давлении 15 фунтов в течение 20 минут при 121°С. 5 г свежесобранной почвы из соответствующих мест было добавлено и среда инкубировалась при 37°С и 120 об/мин в течение 48 часов.

Были приготовлены серии разведений обогащенных почвенных проб в Na₂HPO₄-NaH₂ PO₄ буфере (рН 6,8, 0,05 М). 100 мкл из каждого соответствующего разведения в двух повторах были рассеяны на чашки Петри с различной концентрацией экстракта и питательного бульона из соответствующего места (Среда А: питательный агар, Среда В: почвенный экстракт (200 мл) +1,3 г NB с 2% агаром, Среда С: почвенный экстракт с 2% агаром). Полученные таким образом чашки инкубируются при 37±2°С в течение 16-24 часов в перевернутом положении.

Колонии, имеющие отчетливую морфологию, были отмечены, сколоты и посеяны на чашки с соответствующей средой для получения чистой культуры. Чистые культуры поддерживали на соответствующем скошенном агаре и агаровых столбиках, храня при 4°С для последующего использования в экспериментах.

136 бактериальных культур было получено, и планировалось проверить их консорциумы на эффективность в уменьшении содержания TDS как в электрофлотированных, так и в необработанных сточных водах кожевенных заводов.

Консорциумы готовили по той же схеме, что описана в предыдущем примере, и инокулировали в соотношении сточные воды:биомасса=1:1, как описано в Примере I. Пробы были проанализированы с использованием модифицированного метода анализа содержания TDS, как описано в Примере II, по прошествии периода в 48 часов.

Уменьшение до 9,0% в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов (таблица 6б) и до 7,0% в необработанных сточных водах (таблица 6а) кожевенных заводов наблюдались через 48 часов, что сравнимо с аналогичным уменьшением, наблюдавшимся по прошествии периода в 5 дней, как показано в Примерах IV и V.

Пример VII

Существует гипотеза о том, что бактерии, растущие в местах, богатых хлоридами, сульфатами и нитратами, могут быть лучшими разрушителями компонентов, входящих в состав TDS. Вот почему пробы почв были отобраны в местах, богатых упомянутыми выше солями, и бактерии были изолированы из упомянутых выше проб с использованием различных культуральных сред.

Обогащение бактериальной пробы проводилось в следующих культуральных средах (состав на литр):

Среда А: Состав среды А является следующим:

Раствор А:	980 мл
Раствор В:	10 мл
Раствор С:	10 мл

Раствор А (на 1000 мл дистиллированной воды) содержит в себе KNO₃ (5,0 г), (NH₄)₂SO₄ (1,0 г), К₂HPO₄·3Н₂O (0,87 г), KH ₂PO₄ (0,54 г) и глюкоза (4,0 г). Раствор В: был приготовлен путем добавления 2 г на 100 мл MgSo₄ ·7H₂O и Раствор С был приготовлен посредством растворения следующих солей на 100 мл 0,1 N HCl; а именно CaCl ₂·2H₂O (0,2 г), FeSO₄ 7Н ₂О (0,1 г), MnSO₄ H₂O (0,05 г), CuSO ₄·5H₂O (0,01 г), Na₂MoO ₄·2H₂O (0,01 г). Все указанные выше растворы были проавтоклавированы при 121°С при давлении 15 psi в течение 15 минут и охлаждены до 25°С. Все они были смешаны и использованы как для обогащения, так и для изолирования бактерий.

Среда В: Данная среда была приготовлена с использованием NaCl различной процентности, а именно 1,0, 2,5, 5,0, 10,0 и 12,5. Другие компоненты были (на литр дистиллированной воды); MgCl ₂ 6Н₂О (50,0 г), K₂SO₄ (5,0 г), CaCl₂ 6Н₂О (0,2 г), триптон (5,0 г) и дрожжевой экстракт (5,0 г). Среда была проавтоклавирована при 121°С при давлении 15 psi в течение 15 минут и охлаждена до 25°С и использована как для обогащения, так и для изолирования бактерий.

Среда С: Среда на основе питательного бульона, содержащая (на литр дистиллированной воды) 5,0 г пептона, 5.0 г хлорида натрия, 1.5 г мясного экстракта, 1.5 г дрожжевого экстракта и 0.2 мл Tween-80, была приготовлена, проавтоклавирована и использована как для обогащения, так и для изолирования бактерий.

Обогащение проводилось при 37°С в течение 7 дней. Изоляция была произведена, как описывалось ранее, и полученные чистые культуры хранились при 4°С для использования.

Изолированные бактерии выращивались индивидуально и собирались в консорциумы, как это описано ранее, и использовались для проверки их эффективности в уменьшении содержания TDS как в электрофлотированных, так и в необработанных сточных водах кожевенных заводов. Анализ содержания TDS проводили с использованием модифицированного метода анализа содержания TDS, как описано в Примере II, по прошествии периода в 48 часов (таблица 7а и 7б).

Выявлено уменьшение до 9,3% в электрофлотированных сточных водах в случае применения консорциума EDK2 и до 5,5% в необработанных сточных водах в случае применения консорциумов RDK3 и RDK5.

Пример VIII

Индивидуальные бактерии, составляющие наиболее лучшим образом работающие бактериальные консорциумы в Примере VI, были проверены на их способность уменьшать количество TDS как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов. Бактериальные осадки для инокуляции в экспериментах по очистке были получены по схеме, описанной в предыдущих примерах. Было установлено соотношение 1:1 между сточными водами и биомассой, и проанализированы уровни TDS по прошествии периода в 48 часов с использованием модифицированного метода анализа содержания TDS, как описано в Примере II.

Уменьшение около 10,3% в электрофлотированных сточных пробах (таблица 8б) было выявлено в случае применения изолята МТСС 5097, по прошествии периода в 48 часов.

Пример IX

Имея целью определить, какое содержание биомассы даст наилучшие результаты, бактерии, дающие результат более 6,0% в необработанных сточных водах кожевенных заводов и более 9,0% в электрофлотированных сточных водах, были повторно протестированы на соответствующих пробах сточных вод с различными соотношениями сточные воды:биомасса, а именно 1:0,5 и 1:1. Индивидуальные бактерии были выращены по ранее описанной методике, и клетки были собраны при конечном значении O.D.₆₅₀, равном 1,5.

Соответствующие аликвоты проб для анализа содержания TDS были отобраны в нулевом времени и по прошествии 24 часов. Было обнаружено, что соотношение сточные воды:биомасса, равное 1:1, демонстрирует лучшие результаты по сравнению с соотношением 1:0,5. Кроме того, увеличение O.D культуры до 1,5 приводит к процентному уменьшению до 11,1 в электрофлотированных и 8,1 в необработанных сточных водах, при использовании изолята бактерий МТСС 5097.

Таблица 1 Процент уменьшения содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов различными бактериальными консорциумами, приготовленными из бактериальных изолятов из сточных вод кожевенных заводов (анализ стандартным АРНА методом)
Проба	% уменьшения за 15 дней
Т1	0.03
Т2	-1,2
Т3	-2,6
Т4	0,1
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 2 Процент уменьшения содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов различными бактериальными консорциумами (модифицированный АРНА метод)
Проба	% уменьшения за 15 дней
Т1	4,9
Т2	4,7
Т3	3,1
Т4	0,7
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 3 Процент уменьшения содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов различными бактериальными консорциумами, приготовленными из бактериальных изолятов из сточных вод процесса золения
Проба	% уменьшения за 15 дней
Р1	13,1
Р2	15,8
Р3	13,9
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 4а Процент уменьшения содержания TDS в необработанных сточных водах кожевенных заводов с использованием различных бактериальных консорциумов, созданных путем сочетания из консорциумов P1, P2 и Р3
Проба	24 часа	48 часов	120 часов
RTC1	2,4	2,9	4,0
RTC2	2,6	3,9	4,5
RTC3	2,6	2,8	4,7
RTC4	3,0	3,99	4,0
RTC5	3,6	3,8	4,1
RTC6	3,1	3,5	4,4
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 4б Процент уменьшения содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов с использованием различных бактериальных консорциумов, созданных путем сочетания из консорциумов Р1, P2 и Р3
Проба	24 часа	48 часов	120 часов
ЕТС1	3,6	5,98	6,6
ЕТС2	5,1	5,6	7.3
ЕТС3	2,5	4,4	6,4
ЕТС4	4,1	5,7	6,6
ЕТС5	3,0	5,0	5,8
ЕТС6	3,9	4,3	7,5
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 5а Процент уменьшения содержания TDS в необработанных сточных водах кожевенных заводов с использованием индивидуальных бактериальных штаммов и модифицированной процедуры промывания осадков
Пробы	24 часа	48 часов	72 часа	98 часов	120 часов
RT1	2,0	3,8	3,7	5,5	6,2
RT2	3,4	4,3	5,4	6,8	6,9
RT3	4,3	4,7	5,1	6,3	6,6
RT4	3,2	3,3	4,6	5,5	7,2
RT5	2,9	3,8	4,0	5,5	5,7
RT6	3,8	4,5	4,6	6,2	6,5
RT7	2,1	4,9	4,9	4,9	5,5
RT8	2,7	4,9	5,7	6,2	6,5
RT9	4,2	5,0	5,1	5,2	5,2
RT10	4,2	4,7	5,3	5,7	6,6
RT11	2,1	3,3	3,9	4,3	4,4
RT12	2,8	3,4	5,7	5,7	5,7
RT13	4,2	4,4	4,5	5,7	5,7
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 5б Процент уменьшения содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов с использованием индивидуальных бактериальных штаммов и модифицированной процедуры промывания осадков
Пробы	24 часа	48 часов	72 часа	98 часов	120 часов
ЕТ1	3,0	3,2	4,6	4,7	7,4
ЕТ2	4,2	5,0	5,7	6,4	8,4
ЕТ3	3,5	5,3	5,4	5,9	8,6
ЕТ4	3,5	3,9	3,96	4,7	7,2
ЕТ5	4,1	4,6	5,3	6,0	8,5
ЕТ6	2,4	2,8	4,5	4,8	7,5
ЕТ7	6,7	7,2	7,9	8,6	8,97
ЕТ8	3,8	6,2	6,6	7,3	7,9
ЕТ9	4,7	5,3	5,9	6,6	6,8
ЕТ10	5,0	6,0	6,1	6,2	6,3
ЕТ11	4,9	5,5	6,0	6,2	6,6
ЕТ12	5,1	5,8	6,3	7,7	7,7
ЕТ13	5,1	5,3	5,9	6,3	6,5
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 6а Процент уменьшения содержания TDS в необработанных сточных водах кожевенных заводов с использованием различных консорциумов из различных мест кожевенных заводов
Проба	% уменьшения за 24 часа	% уменьшения за 48 часов
RC1	2,8	3,8
RC2	0,7	3,96
RC3	4,97	7,3
RC4	3,79	5,1
RC5	3,79	6,4
RC6	2,7	2,9
RC7	1,2	2,3
RC8	3,5	3,7
RC9	2,9	3,1
RC10	3,6	3,7
RC11	3,5	3,9
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 6б Процент уменьшения содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов с использованием различных консорциумов из различных мест кожевенных заводов
Проба	% уменьшения за 24 часа	% уменьшения за 48 часов
ЕС1	5,5	7,9
ЕС2	4,3	5,8
ЕСЗ	4,3	8.9
ЕС4	5,6	8,9
ЕС5	6,5	7,9
ЕС6	4,9	5,2
ЕС7	6,2	7,99
ЕС8	2,3	2,7
ЕС9	2,4	2,0
ЕС10	2,7	2,6
EC11	2,7	2,2
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 7а Процент уменьшения содержания TDS в необработанных сточных водах кожевенных заводов с использованием различных консорциумов, приготовленными из бактериальных изолятов из мест богатых хлоридами, сульфатами и нитратами
Проба	% уменьшения за 24 часа	% уменьшения за 48 часов
RDK1	0,6	5,0
RDK2	0,3	4,3
RDK3	1,0	5,5
RDK4	0,6	1,95
RDK5	4,7	5,5
RDK6	2,2	2,4
RDK7	1,2	2,5
RDK8	1,7	1,9
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 7б Процент уменьшения содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов с использованием различных консорциумов, приготовленными из бактериальных изолятов из мест богатых хлоридами, сульфатами и нитратами
Проба	% уменьшения за 24 часа	% уменьшения за 48 часов
EDK1	2,3	8,9
EDK2	2,7	9,3
EDK3	2,98	8,6
EDK4	1,0	1,4
EDK5	2,7	8,2
EDK6	1,0	1,9
EDK7	1,6	2,2
EDK8	1,0	2,2
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица - 8а Процент уменьшения содержания TDS в необработанных сточных водах кожевенных заводов с использованием индивидуальных бактериальных изолятов.
Проба	% уменьшения за 24 часа	% уменьшения за 48 часов
RB2	5,5	7,6
RB4	4,1	6,1
RB5 (MTCC 5097)	7,2	8,0
RB10	2,2	4,6
RB11	0,8	4,5
RB12	0,2	2,2
RB13	0,1	3,1
RB14	1,6	3,4
RB15	2,0	3,6
RB16	2,8	3,2
RB17	0,5	3,1
RB18	1,9	4,8
RB19	2,7	4,5
RB20	1,3	1,95
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 8б Процент уменьшения содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов с использованием индивидуальных бактериальных изолятов.
Проба	% уменьшения за 24 часа	% уменьшения за 48 часов
ЕВ2	5,1	9,1
ЕВ4	5,3	9,3
ЕВ5 (МТСС 5097)	8,9	10,3
ЕВ10	5,4	5,7
ЕВ11	7,4	8,2
ЕВ12	4,9	7,0
ЕВ13	4,2	7,6
ЕВ14	5,1	8,7
ЕВ15	7,6	8,2
ЕВ16	5,3	5,6
ЕВ17	7,7	7,8
ЕВ18	7,3	7,6
ЕВ19	6,3	7,8
ЕВ20	5,98	7,7
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Таблица 9а Процент уменьшения содержания TDS в необработанных сточных водах кожевенных заводов с использованием различных количеств биомассы
Проба	Процентное уменьшение за 24 часа
1:0,5	1:1
RB1	5,67	7,1
RB2	4,94	7,5
RB3	4,38	7,3
RB4	1,05	5,4
RB5 (МТСС 5097)	0,40	8,1
RB6	2,20	8,0
RB7	2,50	7,94
RB8	0,57	3,97
RB9	0,80	5,0
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±-0,2%

Таблица 9б Процент уменьшения содержания TDS в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов с использованием различных количеств биомассы
Проба	Процентное уменьшение за 24 часа
1:0,5	1:1
ЕВ1	4,9	4,21
ЕВ2	4,5	4,54
ЕВ3	4,8	6,0
ЕВ4	4,2	5,6
Е В5 (МТСС 5097)	5,5	11,1
ЕВ6	5,6	5,3
ЕВ7	6,2	7,3
ЕВ8	4,0	6,5
ЕВ9	4,9	5,9
Все значения являются усредненными по повторам экспериментов со стандартным отклонением (SD) ±0,2%

Преимущества настоящего изобретения.

1. Изолированная бактерия способна уменьшать уровни TDS в сточных водах кожевенных заводов воспроизводимым образом.

2. Выделенная из природной среды бактерия не является патогенной и может выращиваться на обычном питательном бульоне без каких-либо значительных экономических затрат.

3. Данный тип бактериального уменьшения содержания TDS как в необработанных, так и в электрофлотированных сточных водах кожевенных заводов является новым.