способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции
Классы МПК: | G01N33/02 пищевых продуктов |
Автор(ы): | Шевцов Александр Анатольевич (RU), Алексеева Татьяна Васильевна (RU), Фролова Лариса Николаевна (RU), Черникова Екатерина Александровна (RU), Еременко Надежда Викторовна (RU) |
Патентообладатель(и): | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Воронежская государственная технологическая академия (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2007-12-03 публикация патента:
27.03.2009 |
Изобретение относится к масложировой промышленности. В качестве объекта исследования используют экстракт семян льна, для получения которого лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН=7,5 в соотношении 1:10 в течение 1 часа 30 минут, после чего отделяют центрифугированием при частоте вращения ротора 6000 мин-1 в течение 30 минут фильтрат, представляющий собой экстракт льна. Анализируют экстракт, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II), 0,2 мл перекиси водорода, при этом считают, что тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта, и чем выше максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, тем больше свободных радикалов в семенах льна. Изобретение позволяет разработать более точный и экспрессный способ, который способствует своевременному обнаружению процессов, вызывающих порчу семян льна при хранении. 1 ил., 1 табл.
Формула изобретения
Способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции, характеризующийся тем, что в качестве объекта исследования используют экстракт семян льна, для получения которого лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН=7,5 в соотношении 1:10 в течение 1 ч 30 мин, после чего отделяют центрифугированием при частоте вращения ротора 6000 мин-1 в течение 30 мин фильтрат, представляющий собой экстракт льна, и анализируют его, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II), 0,2 мл перекиси водорода, при этом считают, что тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта, и чем выше максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, тем больше свободных радикалов в семенах льна.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к способу оценки качества масличной культуры - льна, применяемого в медицинской, косметической, кондитерской отраслях и комбикормовой промышленности.
Известный способ оценки качества льна [ГОСТ 10582 - 76 «Семена льна масличного. Промышленное сырье. Технические условия»] является методом определения кислотного числа жира [ГОСТ Р 52466-2005. Зерно и продукты его переработки. Метод определения кислотного числа жира. М.: Стандартинформ, 2006], который характеризует количество свободных жирных кислот, образованных при реакции окисления.
Недостатками данного способа оценки качества семян льна являются невозможность определения главных инициаторов реакции цепного окисления липидов - свободных радикалов, которые обычными методами химического анализа не могут быть определены из-за их неустойчивости в биохимических системах, а также длительность проведения испытаний и высокий расхода дорогостоящих реактивов.
Наиболее близким по технической сущности и достигнутому эффекту является способ количественной оценки свободных радикалов в пшеничных зародышах методом хемилюминесценции [Патент РФ №2284027, МПК51 G01N 21/76, (2006.01)], предусматривающий приготовление экстракта пшеничных зародышей, для получения которого смешивали измельченный исследуемый образец с фосфатным буфером с рН=7,5, далее с сульфатом железа (II) и перекисью водорода, и определение интенсивности хемилюминесценции, светосуммы и тангенса угла наклона кинетической кривой. Метод хемилюминесценции перекисью водорода с сульфатом железа (II), применяющийся в количественной оценке свободных радикалов для выявления перекисного окисления липидов в пшеничных зародышах, основан на том, что в представленной системе происходит каталитическое разложение перекиси с ионами металла с переходной валентностью - двухвалентным железом по реакции Фентона; образующиеся при этом свободные радикалы (R , OH , RO , RO2 , О2 ) вступают в процесс инициации свободно-радикального окисления в исследуемом субстрате (пшеничных зародышей), рекомбинация радикалов RO2 приводит к образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света.
Недостатком этого способа является то, что его невозможно использовать для анализа семян льна.
Технической задачей изобретения является разработка способа количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции, позволяющего своевременно обнаружить процессы, вызывающие порчу семян льна при хранении.
Способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции характеризуется тем, что в качестве объекта исследования используют экстракт семян льна, для получения которого лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, перемешивают с фосфатным буфером с рН=7,5 в соотношении 1:10 в течение 1 часа 30 минут, после чего отделяют центрифугированием при частоте вращения ротора 6000 мин-1 в течение 30 минут фильтрат, представляющий собой экстракт льна, и анализируют его, для чего в измерительную кювету вносят 0,1 мл экстракта, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II), 0,2 мл перекиси водорода, при этом считают, что тангенс угла наклона кинетической кривой характеризует ингибирующую способность самого продукта, и чем выше максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, тем больше свободных радикалов в семенах льна.
Технический результат заключается в своевременном обнаружении процессов, вызывающих порчу семян льна при хранении методом хемилюминесценции.
На чертеже представлена типичная кинетическая кривая развития хемилюминесценции для семян льна, сопровождающей процесс свободно-радикального перекисного окисления липидов.
Способ осуществляют следующим образом. При приготовлении исследуемого образца лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, затем просеивают через сито и смешивают с фосфатным буфером (рН=7,5) в соотношении 1:10 и встряхивают в течение 1 часа 30 мин. Затем центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения ротора 6000 мин-1. Фильтрат, представляющий собой экстракт семян льна, анализируют на биохемилюминометре БХЛ-07. Для этого в измерительную кювету вносят 0,1 мл исследуемого образца, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II). Затем быстро вносят 0,2 мл перекиси водорода и переводят кювету в измерительное положение. В течение 40 секунд регистрируют показания хемилюминесценции. На информационной карте высвечивается чертеже, где показаны максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (Imax ), светосумма S(t) и тангенс угла ( ) наклона кинетической кривой.
Для оценки свободно-радикального окисления в пробе наиболее значимыми являются параметры I max - максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (мВ) - характеризует перекисные процессы в продукте. Чем выше показатель Imax, тем больше свободных радикалов в продукте и интенсивнее перекисное окисление липидов. Параметр tg - тангенс угла наклона кинетической кривой - характеризует ингибирующую способность самого продукта. Чем больше этот показатель, тем выше ингибирующая способность продукта. Параметр S - светосумма (мВ·сек) - площадь под кинетической кривой развития хемилюминесценции, коррелирует с показателями Imax и tg .
Способ поясняется следующим примером.
Пример
Семена льна с влажностью 12,1% заложили на опытное хранение при температуре 15°С и относительной влажности воздуха 75%. Каждые 10 дней проверяли показатель кислотного числа продукта по стандартной методике и показатели хемилюминесценции, определяющиеся по методике следующим образом: при приготовлении исследуемого образца лен измельчают до размера частиц 0,01-0,5 мм, затем просеивают через сито и смешивают с фосфатным буфером (рН=7,5) в соотношении 1:10 и встряхивают в течение 1 часа 30 мин. Затем центрифугируют в течение 30 минут при частоте вращения ротора 6000 мин -1. Фильтрат, представляющий собой экстракт семян льна, анализируют на биохемилюминометре БХЛ-07. Для этого в измерительную кювету вносят 0,1 мл исследуемого образца, 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл раствора сульфата железа (II). Затем быстро вносят 0,2 мл перекиси водорода и переводят кювету в измерительное положение. В течение 40 секунд регистрируют показания хемилюминесценции. На информационной карте высвечивается чертеже, где показаны максимальное значение интенсивности хемилюминесценции (Imax ), светосумма S(t) и тангенс угла ( ) наклона кинетической кривой.
Каждый опыт проводили в 4-5-кратной повторности. Результаты исследований представлены в таблице.
Время хранения, сут | Показатели качества | |||
Кислотное число, мг КОН/г | Imax,(мВ) | tg | S,(мВ·сек) | |
Начало | 0,3 | 1,282 | 0,732 | 12,552 |
10 | 0,95 | 1,543 | 0,634 | 13,795 |
20 | 2,26 | 2,151 | 0,521 | 14,325 |
30 | 4,47 | 2,842 | 0,432 | 18,297 |
40 | 7,54 | 3,931 | 0,354 | 20,324 |
50 | 8,63 | 4,723 | 0,295 | 25,126 |
При изучении изменения традиционного показателя качества семян льна установлено, что кислотное число постоянно росло, и к концу второго месяца его значение увеличилось в холодильнике на 8,33 мг КОН/г. Причем в течение первого месяца наблюдался интенсивный рост кислотного числа, т.е. за первые 30 суток значение кислотного числа увеличилось на 4,17 мг КОН/г, за следующие 20 суток - на 4,16 мг КОН/г.
Заложенный на хранение продукт исследовали на приборе биохемилюминометре БХЛ-07 для определения интенсивности перекисного окисления в семенах льна и их ингибирующей способности. При хранении семян льна интенсивность перекисного окисления (Imax) на начало составила 1,282 мВ, за полтора месяца хранения она увеличилась до 4,723 мВ. Ингибирующая способность продукта (tg ) за тот же период хранения снизилась с 0,732 до 0,295. Значение S увеличилось с 12,552 до 25,126 мВ·сек. За первые 30 суток хранения значение Imax увеличилось на 1,560 мВ, в то время как ингибирующая способность tg снизилась на 0,300, а значение S выросло на 5,745 мВ·сек; в период с 30 суток по 60 сутки интенсивность перекисного окисления выросла на 1,881 мВ, значение S - на 6,829 мВ·сек, a tg уменьшился на 0,137.
Таким образом, предложенный способ количественной оценки свободных радикалов в семенах льна методом хемилюминесценции является более точным, экспрессным и позволяет своевременно обнаружить процессы, вызывающие порчу продукта при хранении.
Класс G01N33/02 пищевых продуктов