способ коррекции процессов регенерации

Формула изобретения

Способ коррекции процессов регенерации, включающий введение лекарственного препарата, отличающийся тем, что в качестве лекарственного препарата вводят стволовые клетки периферической крови от одного донора не старше 25 лет, одной группы крови и одного пола с реципиентом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к способам коррекции процессов регенерации.

Известен способ коррекции процессов регенерации, согласно которому пациенту назначают этаден (Минина С.А., Громова Л.И., Лукошевичене Р.П. Этаден - инъекционный раствор производного пурина. // Хим.-фарм.журнал. - 1984. - №4. - С.504-506). Этаден способствует стимуляции репаративных процессов в эптелиальной и кроветворной тканях. Данный способ является прототипом изобретения.

Недостатком прототипа является то, что он использует регенерационный потенциал только собственных клеток, который значительно снижен у стареющих людей.

Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в разработке патогенетического способа стимуляции процессов регенерации.

Сущность изобретения заключается в достижении заявленного технического результата в способе коррекции процессов регенерации, включающем введение лекарственного препарата, в котором в качестве лекарственного препарата вводят стволовые клетки от одного донора не старше 25 лет, имеющего одинаковые пол и группу крови с реципиентом.

Ведение стволовых клеток может осуществляться путем многократной трансплантации костного мозга, или периферических стволовых клеток, или цельной крови до нормализации количества периферических стволовых клеток.

Вероятность развития онкологической патологии значительно повышается после 40 лет (Напалков Н.П., 1989); с этого же периода у людей наблюдается снижение пула плюрипотентных стволовых клеток, а также уменьшение циркулирующего в крови у мужчин тестостерона, получившее название частичного возрастного андрогенного дефицита (Partial androgen defishency of aging men (PADAM)) (Bremner W.J. et al., 1983; Gray A. et al., 1991; Тепляшин А.С.и др., 2005).

PADAM нарушает развитие андроген-зависимых клеток. Компенсаторно увеличиваются уровни 5 -дигидротестостерона, 17 -эстрадиола и других факторов, повышающих митотическую активность (Васильев Ю.М., 1997; Берштейн Л.М., 2000; Pechersky A.V. et al., 2002; Печерский А.В. и др., 2003).

Данные изменения оказывают существенное влияние на развитие рака предстательной железы, мочевого пузыря, прямой кишки и некоторых других органов (Femandez Е. et al., 1996; Лопаткин Н.А., 1998; Берштейн Л.М., 2000).

Однако причины нарушения процессов обновления тканей у людей старших возрастных групп (в частности, возрастных изменений в яичках, приводящих к снижению продукции тестостерона) остаются неясными и представляют значительный интерес для изучения.

Во взрослом организме из яйцеклетки и клеток зародыша млекопитающего (вплоть до 8-клеточной стадии) могут образовываться клетки любого типа. Активация яйцеклетки является этапом в реализации программы развития, постепенное развертывание которой приводит к образованию новой особи. Программа развития представляет собой строго определенную очередность биологических процессов, при которой каждый последующий этап инициируется предыдущим. Любое вмешательство в данный процесс от начала мейоза оогоний и сперматогоний до формирования взрослой особи будет приводить к нарушению сформированного эволюцией механизма. Так, нарушение вышеуказанной последовательности при введении ядра дифференцированной клетки в цитоплазму яйцеклетки после удаления ее собственного ядра (при клонировании) делает невозможным развитие полноценной особи.

Последующие деления клеток зародыша млекопитающего (после 8-клеточной стадии) сопровождаются началом их дифференцировки. Параллельно с развитием различных органов и тканей формируются структуры, ответственные за обновление их состава. К числу данных структур можно отнести образование плюрипотентных стволовых клеток. Плюрипотентные стволовые клетки образуются при реализации программы развития оплодотворенной яйцеклетки, являясь одним из направлений дифференцировки клеток зародыша (Alberts В. et al., 1994).

У позвоночных большинство популяций дифференцированных клеток подвержены обновлению - они все время погибают и замещаются новыми. В некоторых случаях новые дифференцированные клетки взрослого организма могут образовываться простым удвоением, при котором образуются две дочерние клетки того же типа (например, гепатоциты). В ряде тканей конечное состояние дифференцировки несовместимо с клеточным делением. Обновление клеток в таких тканях может происходить за счет клеток камбиальной зоны (например, базальные клетки эпидермиса, сперматогонии). Камбиальные клетки представляют собой специализированные клетки-предшественницы, которые могут делиться, но уже проявляют начальные признаки дифференцировки. При делении они дают потомство, часть которого продолжает дифференцировку, а часть остается низкодифференцированным.

Коммитированные клетки-предшественники и дифференцированные клетки, вступив на путь дифференцировки или завершив его, могут делиться ограниченное число раз (Alberts В. et al., 1994) и не в состоянии обеспечить регенерацию ткани на протяжении всего онтогенеза. Обновление тканей на протяжении такого длительного периода невозможно без участия специализированной системы, ответственной за регенерацию. Данная система представлена плюрипотентными стволовыми клетками, которые способны дифференцироваться во все типы соматических клеток и в линию половых клеток, а также обладают способностью к самообновлению на протяжении всей жизни организма. Популяция плюрипотентных стволовых клеток неоднородна: при преимущественной локализации плюрипотентных стволовых клеток в костном мозгу клетки с подобными характеристиками обнаруживаются по данным ряда авторов (Toma J.G. et al., 2001; Zuk P. A. et al., 2002; Тепляшин А.С.и др., 2005) и в других производных мезодермы: в жировой ткани, в мышцах, в сердце и в дерме. Возможно, такая пространственная организация системы позволяет ей наиболее эффективно обеспечивать процессы регенерации тканей, а также связана с возможностью взаимодополнения и взаимозамещения отдельных ее составляющих.

Данная структура имеет характерные для системы механизмы саморегуляции. Число плюрипотентных стволовых клеток и камбиальных клеток-предшественников, а также их соотношение с дифференцированными клетками регулируется макроорганизмом. Соотношение данных клеток определяется конкретными задачами репарации. В пролиферативном состоянии клетка содержит набор молекул, которые позволяют ей пройти точку рестрикции. Эти «разрешающие деление молекулы», определяющие пролиферативное состояние клетки, быстро разрушаются в период отсутствия сыворотки и значительно дольше синтезируются заново после ее добавления (Alberts В. et al., 1994). Данные факторы, обратимо управляющие пролиферацией и покоем, позволяют интегрировать клетку в целостный организм. Вне макроорганизма, без присутствия его постоянно меняющихся регуляторных факторов, плюрипотентные стволовые клетки подвержены гибели, что подтверждается значительными трудностями, возникающими при культивировании стволовых клеток "in vitro". С данных позиций создание постоянных линий эмбриональных стволовых клеток, не подверженных старению в культуре в отсутствие регулирующего влияния макроорганизма и утративших связь с ним, по-видимому, связано с определенными генетическими изменениями, приближающими данные клетки к злокачественным. Применение таких клеток в клинической практике может сопровождаться повышением риска развития канцерогенеза. Более того, попытки получения плюрипотентных стволовых клеток из эмбриональных клеток, запрограммированных на выполнение программы развития, будут сопровождаться закономерным образованием тератом, что и подтверждается целым рядом исследователей (Крылова Т.А. и др., 2005). Плюрипотентные стволовые клетки являются отдельной ветвью дифференцировки эмбриональных клеток, их формирование невозможно вне развивающегося эмбриона. Введу чрезвычайной сложности повторения последовательности действия регуляторных факторов программы развития любые попытки воспроизведения этих этапов «in vitro» для отдельно-взятых эмбриональных клеток представляются мало перспективными.

В отдельных случаях тератомы развиваются при культивировании сперматогоний при получении у них признаков стволовых клеток (Alberts В. et al., 1994). Спорадичность появления тератом, по-видимому, обусловлена трудностью изолированного выделения сперматогоний. Вероятно, состав культивируемых клеток гетерогенен и в нем нельзя исключить присутствия клеток, начавших мейотическое деление (сперматоцитов). Появление тератом свидетельствует о том, что программа развития запускается не с момента оплодотворения яйцеклетки, а с началом мейоза. Учитывая, что плюрипотентные стволовые клетки и сперматогонии представляют различные ветви дифференцировки клеток зародыша и предназначены для выполнения различных функций, получение полноценных стволовых клеток из сперматогонии маловероятно.

Базальная мембрана, подстилающая эпителиальный слой, не препятствует миграции через нее целого ряда клеток, включая макрофаги и клетки, обеспечивающие регенерацию. Клетки, сохраняющие связь с базальной мембраной, сохраняют контакт с подлежащей соединительной тканью, осуществляющей контроль над дифференцировкой эпителиальных клеток.

Учитывая, что в эксперименте диссоциированные клетки легче агрегируются с клетками своей ткани, плюрипотентные стволовые клетки, по-видимому, в большей степени будут агрегироваться с низкодифференцированными клетками-предшественниками камбиальной зоны, пополняя их состав. Последующая дифференцировка клеток камбиальной зоны будет способствовать замене старых клеток.

Вероятно, процесс дифференцировки стволовых клеток регламентируется программой развития: соответствующая ее часть инициируется клеточным окружением при миграции стволовых клеток. Каждая клетка многоклеточного организма содержит определенный набор поверхностных рецепторов, дающий ей возможность специфическим образом реагировать на комплементарный набор сигнальных молекул, а также позволяющий ей связываться определенным образом с другими клетками и внеклеточными матриксом. Данный набор рецепторов представляет «морфогенетический код», который определяет организацию клеток в тканях (Alberts В. et al., 1994). Строгая последовательность появления экспрессии рецепторов к клеточным ростовым факторам и, возможно, такая же строгая регламентация образования (аутокринно или паракринно) самих клеточных ростовых факторов на разных стадиях дифференцировки клеток подтверждает данный вывод. Примером может служить, представленное в монографии Roitt I. et al. (2000), чередование экспрессии рецепторов к различным ростовым факторам при дифференцировке Т- и В-лимфоцитов.

Универсальность механизма регенерации, осуществляемого посредством плюрипотентных стволовых клеток, подтверждается постепенным замещением клеток реципиента клетками донора при трансплантации периферических стволовых клеток у наблюдавшихся больных. Так, через один год после трансплантации, при сравнении образцов крови пациента и его ближайшего родственника (матери) материал был признан неродственным. Более того, при несовпадении группы крови у донора и реципиента до трансплантации через 1 год после трансплантации у всех реципиентов определялась группа крови донора. Аналогичные данные были получены при исследовании быстро регенерирующего буккального эпителия. В 6 случаях у обследованных больных через 1 год после трансплантации периферических стволовых клеток в составе буккального эпителия были выявлены два вида клеток, имеющих различный генотип. Из них в 5 случаях доля клеток буккального эпителия, принадлежащих противоположному реципиенту полу (полу донора) составляла от 50% до 80%. А в одном случае 100% клеток буккального эпителия имели генотип индивидуума, не являющегося родственным матери реципиента (табл.1).

Утверждение об универсальности механизма регенерации, осуществляемого посредством плюрипотентных стволовых клеток, подтверждают отдаленные результаты локального лучевого воздействия. Несмотря на атрофию камбиальных клеток процент необратимых поздних лучевых повреждений относительно небольшой. По данным В.М.Виноградова (2004) он не превышает 5%. Предотвратить необратимые изменения данной зоны может только восстановление ее камбиальных зон за счет миграции клеток, способных к соответствующей дифференцировке (стволовых клеток).

Формирование и регенерация тканей, осуществляемые путем миграции клеток, представляет собой более сложный механизм по сравнению с делением и удержанием в эпителиальном слое потомков клеток-основательниц. Формирование и регенерация тканей, осуществляемые путем миграции клеток, широко распространены в природе, включая различные этапы онтогенеза человека. Примером могут служить миксамебы (Dictyostelium discoideum) - эукариотические организмы, живущие в виде отдельных подвижных клеток. При голодании миксамебы вырабатывают хемотаксические вещества, привлекающие другие клетки, и превращаются в центры агрегации. Агрегация клеток завершается образованием многоклеточного червеобразного существа - плазмодия, в состав которого могут входить до 100000 миксамеб. Необходимо отметить, что плазмодий, являющийся переходной формой от одноклеточных к многоклеточным организмам, представляет собой химерную особь, состоящую из клеток с различным геномом. Другим примером являются клетки первичной мезенхимы земноводных, выходящих в полость бластулы и движущихся вдоль ее стенки, подтягиваясь на выпускаемых ими длинных тонких отростках - филоподиях. В зародышах позвоночных клетки нервного гребня мигрируют из эпителиальной (нервной) трубки и дифференцируются в ряд тканей, включая элементы периферической нервной системы. У ранних эмбрионов позвоночных все компоненты конечности (кроме эпидермиса) являются производными мигрирующих клеток. Прежде чем достигнуть места назначения и принять участие в формировании структур конечности, эти клетки должны совершить длительное путешествие по эмбриональной соединительной ткани. В основе миграции клеток лежит образование химического агента, привлекающего мигрирующие клетки путем хемотаксиса, и/или образование на поверхности клетки адгезивных молекул типа фибринонектина, обеспечивающих направленность миграции (Alberts В. et al., 1994).

Хемотаксические факторы играют определяющую роль в миграции стволовых клеток (Roitt I., et al., 2000). В основе хемотаксиса лежит перемещение подвижных клеток в сторону более высоких концентраций питательных субстратов, например сахаров и аминокислот. По-видимому, в многоклеточном организме упомянутые питательные субстраты, определяющие направленность движения одноклеточных организмов в состоянии голодания, приобретают роль сигнальных молекул хемотаксиса. При образовании центра агрегации зона его влияния быстро расширяется, так как агрегирующиеся клетки не только отвечают на хемотаксический сигнал, но и сами начинают выделять аналогичные вещества. Преимущество такой системы передачи хемотаксического сигнала состоит в том, что по мере распространения из центра сигнал постоянно возобновляется, не ослабевая на большом расстоянии, его концентрация при этом все время меняется. В отличие от данной модели сигнал, распространяющийся только путем диффузии, постепенно ослабевает и носит постоянный характер. Клетки при своем передвижении улавливают пространственные градиенты различных веществ, воспринимая именно изменения концентрации хемоаттрактанта, а не его постоянную величину (Alberts В. et al., 1994). По данной причине многократная ретрансляция хемотаксического сигнала, сопровождаемая изменением его содержания в среде, представляется более эффективной.

Реакции естественного иммунитета инициируются рядом химических структур, в том числе концевыми сахарами мембранных гликопротеинов, содержащих концевую маннозу. В норме концевые сахара блокированы сиаловой кислотой, которая защищает клетки от фагоцитоза макрофагами. У старых клеток вследствие десиалирования клеточной поверхности нарушается защита концевых углеводных остатков мембранных гликоконъюгатов - на их поверхности появляется свободная манноза. Данные клетки становятся доступными для распознавания. При контакте макрофагов со старыми клетками происходит их активация и включение первой линии иммунной защиты - реакций естественного иммунитета. В их основе лежит филогенетически более древний процесс - воспаление (Ярилин А.А., 1999).

Элиминация макрофагами старых клеток может осуществляться как за счет фагоцитоза, так и посредством внеклеточного киллинга - контактной индукции апоптоза и передачей в клетки-мишени токсического материала. Ключевым фактором клеточно-опосредованного цитолиза является белок-перфорин. Перфорин проникает в мембрану клеток-мишеней при участии Са ⁺⁺ и формирует в ней поры для проникновения гранзимов, запускающих апоптоз. Некроз или апоптоз и последующий лизис клетки сопровождаются развитием демаркационного воспаления. Некротические процессы (некроз, апоптоз) происходят на протяжении всего онтогенеза как проявление нормальной жизнедеятельности организма. В организме постоянно происходят гибель и разрушение старых клеток с последующей регенерацией, что и обеспечивает нормальную его жизнедеятельность (Струков А.И., Серов В.В., 1993; Ярилин А.А., 1999).

Продукты инкреции макрофагов, активированных Т-клеток, а также эпителиальных и эндотелиальных клеток, клеток стромы кроветворных и лимфоидных органов очень важны для регуляции развития воспаления. Особое значение имеет инкреция клеточных факторов роста, колониестимулирующих и хемотаксических факторов, а также интерлейкинов (Ярилин А. А., 1999).

К наиболее известным клеточным факторам роста, регулирующим пролиферацию и дифференцировку клеток, относятся эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобные факторы роста I и II (IGF-I, IGF-II), трансформирующий фактор роста (TGF- ) и другие (Alberts В. Et al., 1994). При некрозе (или апоптозе) специфическая комбинация клеточных ростовых факторов способствует пролиферации фибробластов, пролиферации и дифференцировке низкодифференцированных клеток-предшественниц, а также поступающих стволовых клеток, способствующих восстановлению дефекта ткани (Ярилин А.А., 1999). Специфичность регуляции дифференцировки, осуществляемой клеточным окружением, заключается в строгой последовательности местного образования клеточных ростовых факторов и такой же строгой регламентацией последовательности экспрессии их рецепторов, определенных соответствующей частью программы развития. Инкреция клеточных ростовых факторов продолжается до полного восстановления поврежденной ткани.

Колониестимулирующие факторы служат мощными стимуляторами кроветворения, в том числе повышающими пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток костного мозга с их ускоренным переходом в кровоток, а хемотаксические факторы обеспечивают их направленную миграцию для регенерации поврежденного участка ткани.

Активированные макрофаги и моноциты в области воспаления выделяют IL-1 ( и формы), IL-6, фактор некроза опухолей- (TNF ). Фактор некроза опухолей- не только вызывает апоптоз клеток, но и способен активировать в клетках-мишенях липопротеиновую липазу, что может приводить к кахексии. В условиях воспаления эндотелиальные клетки и фибробласты выделяют IL-7, вызывающий экспрессию гена bcl-2. Экспрессия генов, повышающих устойчивость клеток к гибели по механизму апоптоза, позволяет клеткам сохраниться в условиях воздействия, высокоактивных продуктов, образующихся при воспалении (Ярилин А.А., 1999).

Молекулы главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex) - МНС I класса связывают и представляют на поверхности клетки пептидные фрагменты эндогенных белков. Формирование комплекса антигенного пептида с молекулой МНС I класса является непрерывно протекающим процессом. Из презентуемых пептидов 90% являются общими для большинства различных клеток организма (ввиду множества общих для всех клеток биохимических процессов и, соответственно, большого числа общих одинаковых белков (Alberts В. et al., 1994)) и 10% отличаются между ними (Ярилин А.А., 1999). По-видимому, большинство из отличающихся друг от друга пептидов различных клеток отражают ткане- и клеточно-специфичную информацию. Примечательно, что доля в их составе чужеродных пептидов, определяющих работу клеточного звена иммунной защиты, очень незначительна (около 1%).

Основная часть указанных пептидов происходит из сигнальных участков белков и самих молекул МНС I класса. Регулируя состав представляемых антигенов при процессинге в эндосомах, клетка определяет характер взаимодействия с другими клетками, несущими комплементарные рецепторы. Данный механизм способствует интеграции каждой отдельно взятой клетки в целостный организм. Закономерно, что ряд хемоаттрактантов, являющихся молекулами МНС I класса и обладающих ткане- и клеточно-специфичными свойствами, обеспечивают направленную миграцию стволовых клеток в строго определенные ткани, например, по данным I. Roitt, et al. (2000), в тимус.

Направленная миграция плюрипотентных стволовых клеток невозможна без образования специфических хеморецепторов. Их появлению должны предшествовать ряд промежуточных этапов. Первоначально необходимо связывание и доставка антигенов в лимфатические узлы или иные лимфоидные органы антигенпредставляющими клетками. Данный этап обусловлен появлением при десиалировании у старых и интенсивно пролиферирующих клеток гликопротеинов, содержащих концевую маннозу. Антигенпредставляющие клетки осуществляют эндоцитоз антигена. В эндосомах или лизосомах приводит расщепление белков до более мелких фрагментов (цельная молекула белка не может быть распознана Т-лимфоцитом без процессинга вспомогательными клетками). Эндосомы, содержащие пептидные антигены с везикулами, сливаются с эндосомами, содержащими «пустые» (не содержащие антигенного пептида) молекулы МНС II класса. В составе мембран эндосом сформировавшиеся тримерные комплексы молекул МНС II класса и антигенных пептидов выносятся на поверхность клеток. При процессинге антигена антигенпредставляющие клетки утрачивают способность связывать новые антигены; на их поверхности появляется экспрессия вспомогательных молекул CD 80/86, участвующих в представлении антигенного пептида Т-хелперам (Ярилин А.А., 1999).

Во вторичных лимфоидных органах лимфоциты прикрепляются к эндотелиальным клеткам посткапиллярных венул, протискиваются между эндотелиальными клетками и попадают через лимфатический узел в лимфатические сосуды (Alberts В. et al., 1994). Такая постоянная циркуляция обеспечивает встречу лимфоцитов с антигенпредставляющими клетками, а также при их посредничестве позволяет обеспечить контакты Т-хелперов с Т-киллерами и с плюрипотентными стволовыми клетками с формированием у них соответствующих рецепторов.

Число постоянно гибнущих собственных клеток значительно превосходит количество микроорганизмов, проникающих во внутреннюю среду организма. Примечательно, что молекулы МНС II класса преимущественно образуют комплексы с аутологичными пептидами (продуктами МНС I класса и другими белками): 90% из них являются общими для большинства различных клеток организма, 10% отличаются между собой и только 1% из числа последних составляют чужеродные антигены. Презентация 99% аутологичных пептидов молекулами МНС II класса (Alberts В. et al., 1994) свидетельствует о последующем формировании значительной доли комплементарных рецепторов именно к аутоантигенам.

Связывание Т-хелпера с комплексом антиген - молекула МНС II класса антигенпредставляющей клетки при участии вспомогательных молекул приводит к активации Т-хелпера. Основой Т-клеточного распознавания является иммунодоминантность - зависимость активации рецепторов Т-клеток от сродства антигенного пептида молекуле МНС (степени отличия антигена от собственных молекул организма). Через этот механизм реализуется Ir-1 генный контроль характера и интенсивности иммунного ответа на антигены. Преобладание аутоантигенов при образовании комплексов с молекулами МНС II класса свидетельствует о том, что Т-клеткам чаще приходится заниматься распознаванием «измененного своего» и значительно реже распознаванием «чужого» (Ярилин А.А., 1999).

По-видимому, распознавание Т-хелперами «измененного своего» может приводить к активированию не только Т-киллеров, но и плюрипотентных стволовых клеток (с образованием специфичных рецепторов для антигенов, презентуемых молекулами МНС I класса) для одновременной (с уничтожением измененных клеток) репарации поврежденного участка ткани. Соотношение видов активируемых клеток, возможно, определяется степенью отличия презентуемого антигена от собственных молекул.

Активация плюрипотентных стволовых клеток с образованием комплементарных рецепторов, по-видимому, также осуществляется через посредничество антигенпредставляющих клеток. Вероятность встречи Т-хелперов и плюрипотентных стволовых клеток (при их постоянной циркуляции через вторичные лимфоидные органы) с антигенпредставляющими клетками значительно выше по сравнению с возможностью возникновения контакта между ними самими. По аналогии с процессом активации цитотоксических Т-клеток следующим этапом должно быть оказание Т-хелперами (через Т-клеточный рецептор и молекулу МНС II класса с презентуемым антигеном при участии вспомогательных молекул и интерферона ) активирующего действия на антигенпредставляющую клетку. Активированная антигенпредставляющая клетка через молекулу МНС II класса с антигеном (по аналогии с взаимодействием с Т-клеточным рецептором цитотоксической Т-клетки) получает возможность связаться с рецептором плюприпотентной стволовой клеткой с последующим образованием тканеспецифического рецептора на ее поверхности. При этом цитотоксическая клетка и, по-видимому, плюприпотентная стволовая клетка приобретают вспомогательные молекулы адгезии и межклеточного взаимодействия (экспрессия молекул адгезии CD 2, CD 58, интегриновых рецепторов ICAM- 1 и других), обеспечивающих установление прочного контакта с клеткой-мишенью. Появление тканеспецифичных «хоминг-рецепторов» определяет пути миграции лимфоцитов (Ярилин А.А., 1999) и, возможно, стволовых клеток к местам воспаления, включая места гибели старых клеток. Т-супрессоры (T _s) могут регулировать данные процессы. Основными клетками-мишенями Т-супрессоров являются Т-хелперы.

Активирование Т-хелперами (Тh1) (при посредничестве антигенпредставляющих клеток) цитотоксических Т-клеток сопровождается паракринным и аутокринным образованием IL-2. Среди прочих функций, IL-2 способен предохранять активированные клетки от апоптоза. Соответственно, у активированных Т-киллеров появляется экспрессия гена bcl-2 и некоторых других аналогичных генов.

Параллельно, на Т-лимфоцитах и на атигенпредставляющих клетках появляется экспрессия Fas-рецептора, через который в клетку поступает сигнал, индуцирующий апоптоз. Все перечисленные изменения в экспрессии мембранных молекул характерны для формирующихся Т-клеток памяти, представляющих собой разновидность эффекторных Т-клеток. Баланс экспрессии Bcl-2 и экспрессии Fas-рецептора определяет судьбу клеток: быструю гибель эффекторных клеток после выполнения функций или продолжительный срок жизни клеток памяти. Существенно, что для поддержания экспрессии гена bcl-2 клеткам требуется повторный контакт со специфическим антигеном. Например, Т-клетки памяти быстро гибнут в среде, не содержащей соответствующий антиген (Ярилин А.А., 1999).

По-видимому, экспрессия гена bcl-2 также позволяет предотвратить развитие апоптоза у мигрирующих в область регенерации после опосредованного антигенпредставляющими клетками контакта с Т-хелперами стволовых клеток. Экспрессия гена bcl-2 позволяет высокочувствительным к неблагоприятным условиям среды стволовым клеткам выжить в условиях воздействия высокоактивных продуктов (активные формы азота и кислорода, TNF- , INF- и другие), образующихся, в частности, при гибели старых клеток и развитии сопутствующего воспаления.

В соответствии с теорией клональной селекции каждая стволовая клетка коммитированная к выработке одного определенного антиген-специфического хеморецептора, должна образовывать семейство или клон клеток, имеющих одинаковую антигенную специфичность, аналогично клеткам иммунологической памяти. Для плюрипотентных стволовых клеток это шаг к унипотенции. В данном случае даже одиночная антигенная детерминанта будет, как правило, активировать много клонов, каждый из которых будет иметь поверхностные рецепторы, обладающие своим особым, индивидуальным сродством к данной детерминанте (Alberts В. et al., 1994).

По-видимому, при применении препаратов, приготовленных из различных тканей животных, у человека присутствует хотя бы несколько клонов стволовых клеток, несущих комплементарные рецепторы к общим фрагментам тканеспецифичных пептидов ксеногенных препаратов. Связывание антигена с рецептором приводит к интенсивной пролиферации соответствующего клона стволовых клеток. Направленная миграция стволовых клеток в ткани, клетки которых содержат комплементарные их рецепторам тканеспецифичные пептиды в комплексе с молекулами МНС I класса, будет способствовать стимуляции регенерации данных тканей. Возможно, параллельно описанному выше процессу тканеспецифичные аллогенные или ксеногенные пептиды могут активировать стволовые клетки, несущие рецепторы к общим антигенам. Так, в опыте на крысах с перекрестным кровообращением повреждение печени у одной из них приводит к стимуляции процессов регенерации печени у обоих животных (Alberts В. et al., 1994); целый ряд широко применяемых препаратов из различных тканей животных (печени, предстательной железы, хряща, роговицы и других) стимулирует регенерацию соответствующих тканей у человека (Машковский М.Д., 2002).

Образование хемоаттрактантов, в числе которых выступают антигены МНС I класса, и формирование у плюрипотентных стволовых клеток комплементарных им рецепторов (через представление аутоантигенов молекулами МНС II класса) представляется наиболее подходящим объяснением направленной миграции плюрипотентных стволовых клеток к определенным клеткам и тканям.

Участие плюрипотентных стволовых клеток и возможное посредничество антигенпредставляющих клеток и Т-хелперов/Т-супрессоров в комплексе с молекулами МНС I класса/II класса позволяют предполагать, что именно иммунная система ответственна за регенерацию тканей организма. Значительное преобладание аутоантигенов (99%) среди пептидов, представляемых молекулами МНС II класса, а также существенное преобладание субпопуляции CD4⁺-лимфоцитов (хелперов) над CD8⁺-киллерами в крови и в лимфе показывает, что участие в процессах регенерации является важнейшей (а может быть, и ведущей) функцией иммунной системы.

Вероятно, после трансплантации какого-либо аллогенного (или, теоретически, ксеногенного) органа начинается постепенное замещение донорских клеток стволовыми клетками реципиента с последующей их дифференцировкой. В данном случае клеточное окружение донорского органа осуществляет направление дифференцировки поступающих стволовых клеток. Представленная модель может оказаться более простой по сравнению с попытками выращивания тканей "in vitro". Об интенсивности замещения клеток донорского органа клетками реципиента приблизительно можно судить по скорости обновления тканей в нормальных условиях. Например, скорость обновления костной ткани составляет около 10% в год (Alberts В. et al, 1994).

Заселение тимуса стволовыми клетками необходимо не только для последующего образования Т-клеток, но и для поддержания нормального функционального состояния эпителия тимуса - для формирования эпителиального ретикулума и кортико-медуллярной структуры тимуса в онтогенезе (Ярилин А.А., 1999).

Эпителиальные клетки тимуса составляют микроокружение развивающихся тимоцитов и служат источниками сигналов, генерируемых при прямых клеточных контактах. В основе этих контактов лежит взаимодействие молекул МНС II класса эпителиальных клеток и рецепторов Т-клеток, а также участие вспомогательных молекул. Молекулы МНС II класса играют ведущую роль у эпителиальных клеток в процессе положительной селекции тимоцитов, а у макрофагов и дендритных клеток в отрицательной селекции тимоцитов (Ярилин А.А., 1999). В процессе данных контактов клетки микроокружения тимуса передают Т-лимфоцитам информацию об антигенах собственных тканей, а также, по-видимому, формируют у них тип ответных реакций на презентуемые антигены. Последнее имеет большое значение при отличии антигенов пораженной вирусом клетки или чужеродной ткани (с активацией в большей степени Т-киллеров) от аутоантигенов погибших старых клеток (с последующей активацией плюрипотентных стволовых клеток с образованием у них тканеспецифичных рецепторов для направленной миграции и восстановления тканей).

Постоянное обновление собственных клеток тимуса за счет стволовых клеток с последующей передачей информации от новообразованных клеток микроокружения тимуса Т-лимфоцитам и их последующая селекция позволяет постоянно обновлять данные о собственных антигенах у Т-лимфоцитов. Ввиду эволюции генома - его постепенного усложнения и совершенствования вследствие разнообразных генетических рекомбинаций (Alberts В. et al, 1994) (и, соответственно, изменений в составе аутоантигенов), данный механизм обеспечивает на протяжении онтогенеза соответствующие синхронные изменения иммунной системы, а также позволяет сохранить единство происходящих изменений для большинства тканей организма (за счет их одновременного обновления клетками с новыми характеристиками).

При трансплантации аллогенных плюрипотентных стволовых клеток эпителиальные клетки микроокружения тимуса будут формироваться, в том числе, и из трансплантируемых клеток. Соответственно, в процессе обучения Т-лимфоциты дополнительно начнут воспринимать в качестве «своих» антигены донора. Данная закономерность, по-видимому, определяет развитие иммунологической толерантности, развивающейся по данным ряда авторов (Alberts В. et al., 1994), при трансплантации тканей или органов после предварительного переливании крови (или трансплантации плюрипотентных стволовых клеток/костного мозга) от единого донора, а также после предварительной трансплантации клеток зародыша в эксперименте.

Переливание крови (или трансплантация стволовых клеток/костного мозга, или клеток зародыша), по-видимому, приводит к формированию химерной особи. Данная особь, в частности, будет обладать двумя типами плюрипотентных стволовых клеток с двумя различными генотипами. Последующая миграция стволовых клеток двух видов в тимус и обновление его собственных клеток микроокружения приведет к формированию Т-лимфоцитов, воспринимающих антигены собственного организма и антигены донора как «свои». Теоретически химерному реципиенту могут быть пересажены от исходного донора любые ткани или органы без риска последующего отторжения.

Представление о бессмертии плюрипотентной стволовой клетки - ее способности к неограниченному числу делений - является в определенной степени условным. Пролиферативное поведение клеток на протяжении онтогенеза управляется долговременными внутриклеточными программами. Взаимоотношения между долговременными и кратковременными механизмами контроля определяются, по-видимому, программой развития, реализуемой через клеточные факторы роста, колониестимулирующие факторы, продукты, образованные при экспрессии протоонкогенов и другие факторы. Так, от различного сочетания колониестимулирующих факторов зависит скорость клеточного деления и число делений, необходимых плюрипотентной стволовой клетке перед началом дифференцировки. Вероятность перехода в состояние покоя (G₀) увеличивается с числом клеточных делений. У многоклеточных организмов клетки многих типов переходят в состояние G₀ в результате окончательной дифференцировки, теряя способность делиться независимо от внешних стимулов (Alberts В. Et al., 1994). С возрастом количество клеток, которые по данным маркирования могут быть отнесены к плюрипотентным стволовым клеткам, постепенно уменьшается (Тепляшин А.С.и др., 2005). Наличие долговременных внутриклеточных программ свидетельствует в пользу того, что программа развития не только приводит к формированию взрослой особи, но и определяет ее развитие на протяжении всего онтогенеза.

Для поддержания нормального состояния в организме каждую секунду должно образовываться несколько миллионов новых клеток (Alberts В. et al., 1994). Одновременно каждую секунду происходит некроз (или апоптоз) такого же количества старых клеток, приводящий к множеству локальных участков воспаления. У лиц старших возрастных групп некротизированные старые клетки не возмещаются адекватным количеством низкодифференцированных клеток-предшественниц (или стволовых клеток), что делает невозможным завершение процесса регенерации. Учитывая, что плотность клеточной популяции прямо пропорциональна концентрации факторов роста в среде, у данной категории лиц компенсаторно увеличивается образование клеточных ростовых факторов (для стимуляции пролиферации низкодифференцированных клеток камбиальных зон) и увеличивается образование колониестимулирующих факторов (для стимуляции пролиферации плюрипотентных стволовых клеток). Продукция данных факторов для оказания наибольшего стимулирующего воздействия на пролиферацию клеток становится максимальной. Соответственно, у лиц старших возрастных групп отмечается повышение экспрессии факторов пролиферации (Ki67 и др.) в большинстве тканей (Печерский А.В. и др., 2005), а также повышение доли коммитированных форм стволовых клеток костного мозга (Тепляшин А.С. и др., 2005).

Повышенная продукция ростовых факторов у людей старших возрастных групп не приводит к образованию адекватного количества клеток-предшественниц, обеспечивающих замену погибших старых клеток. Более того, с возрастом количество клеток камбиальных зон только уменьшается. Соответственно, данная стимуляция с увеличением возраста усиливается и становится постоянной.

Данные изменения закономерно сопровождаются развитием постоянно-повышенной экспрессии генов соответствующих ростовых факторов и их рецепторов; происходит трансформация протоонкогенов, ответственных в нормальных условиях за деление клеток в ответ на действие ростовых факторов, в онкогены. Например, онкоген erbB начинает кодировать урезанный вариант рецептора эпидермального фактора роста (EGF). Данный рецептор теряет EGF-связывающий наружный домен, но сохраняет внутриклеточный домен с тирозин-специфической протеинкиназной активностью. Клетки с такими дефектными рецепторами ведут себя так, как будто на них постоянно действует сигнал эпидермального фактора роста к пролиферации (Alberts В. et al., 1994).

Необходимо отметить, что компенсаторная трансформация протоонкогенов в онкогены при длительном отсутствии эффекта на регулирующий сигнал является частным примером общей закономерности реагирования организма в подобных условиях. Так, при наличии в течение длительного периода стеноза почечной артерии происходит гипертрофия клеток юкстагломерулярного аппарата (с увеличением в них количества инкретирующих гранул), сопровождаемая максимальным образованием ренина; продукция гормона становится нерегулируемой. О сопутствующих генетических изменениях свидетельствует сохранение высокой интенсивности продукции ренина трансформированными клетками после устранения стеноза (Тареева И.Е., 1995).

Эпидермальный ростовой фактор (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобные факторы роста I и II (IGF-I, IGF-II), а также ряд других факторов обладают выраженной митотической активностью и являются промоторными факторами канцерогенеза (Берштейн Л.М., 2000). Постоянно повышенные уровни клеточных ростовых факторов, стимулирующих пролиферацию камбиальных клеток, блокирование развития апоптоза (обусловленное экспрессией гена bcl-2 у коммитированных после активации Т-хелперами стволовых клеток, а также у образующихся в процессе их дифференцировки клеток камбиальных зон), трансформация протоонкогенов в онкогены могут приводить к метаплазии (а в последующем и к малигнизации).

Метаплазия носит непрямой характер и начинается с размножения измененных под действием вышеуказанных факторов камбиальных клеток, дифференцирующихся в новый тип эпителия (например, в ороговевающий плоский, вместо призматического) (Струков А.И., Серов В.В., 1993). Аналогично клональной селекции лимфоцитов каждая измененная недифференцированная камбиальная клетка образует семейство, дающее начало метаплазированным клеткам.

Увеличение дефицита плюрипотентных стволовых клеток и соответствующее уменьшение числа камбиальных клеток тканей у лиц старших возрастных групп сопровождается повышением интенсивности образования клеточных ростовых факторов и развитием экспрессии все большего числа онкогенов, приводящих к появлению новых, в большей степени измененных, недифференцированных камбиальных клеток. Ввиду масштабности вышеуказанных изменений, развивающихся в подавляющем числе тканей, с возрастом риск канцерогенеза повышается. В данных условиях развитие злокачественной опухоли - предопределенный процесс. Конкретная локализация опухоли и время ее появление будут определяться отдельными инициирующими факторами и индивидуальными особенностями индивидуума. Представленное заключение подтверждается данными А.И.Струкова и В.В.Серова (1993) о возможности возникновения опухоли в любой ткани и в любом органе.

Таким образом, злокачественный рост эпителия обусловлен длительной повышенной стимуляцией митотической активности недифференцированных клеток камбиальных зон вследствие недостаточности количества последних. Несмотря на увеличение компенсаторной стимуляции, недостаточность камбиальных клеток с увеличением возраста прогрессирует.

Вероятно, одного деления злокачественных клеток недостаточно для обеспечения прогрессирования роста опухоли. Стволовые клетки, постоянно пополняющие клеточный состав камбиальной зоны, по-видимому, продолжают поступать в зону с измененными камбиальными клетками (метаплазированными или раковыми), трансформируясь в них под влиянием клеточного окружения. Данные ряда авторов (Струков А.И., Серов В.В., 1993; Alberts В. et al., 1994) о начале интенсивного роста опухоли после наступления ее васкуляризации, позволяющей значительно увеличить поступление в данную область стволовых клеток, а также выявление среди клеток злокачественных опухолей стволовых клеток и клеток-предшественников подтверждают данное заключение.

Злокачественная трансформация камбиальных клеток, повышающая число их делений, направлена на компенсацию хронической недостаточности камбиальных клеток и плюрипотентных стволовых клеток у лиц старших возрастных групп. Подтверждает данное заключение появление сходства злокачественных клеток со стволовыми клетками, например появление у них эмбриональных антигенов (Струков А.И., Серов В.В., 1993).

Рассмотренные факторы, образующиеся при гибели старых клеток и развивающемся при этом воспалении, по-видимому, не только приводят к злокачественной трансформации клеток, но и определяют дальнейший рост опухоли. Так, по периферии опухоли сохраняется зона перифокального (демаркационного) воспаления. В числе прочих клеток в этой зоне располагаются макрофаги, выполняющие роль местных регуляторов воспаления (Струков А.И., Серов В.В., 1993; Серов В.В., Пауков B.C., 1995). Аналогично остеокластам (образующимся из моноцитов и являющихся разновидностью макрофагов), разрушающим костный матрикс при обновлении костной ткани (Alberts В. et al., 1994), макрофаги зоны перифокального воспаления, выделяя гидролитические ферменты, лизируют окружающие ткани (разрушают эндотелий, базальные мембраны, фибронектин, коллаген, эластин, костный матрикс и другие структуры), освобождая место для опухолевых клеток. Накопление цитокинов, обладающих ростовой активностью в отношении клеток эндотелия (сосудистый ростовой фактор и другие, выделяемые макрофагами), обусловливает их пролиферацию и формирование новых сосудов - ангиогенез. В свою очередь, эндотелий в условиях воспаления продуцирует IL-1, фактор роста фибробластов и тромбоцитарный фактор роста, усиливающие пролиферацию, а также IL-7, вызывающий экспрессию гена bcl-2. Экспрессия гена bcl-2, повышая устойчивость клеток к гибели по механизму апоптоза, экранирует эндотелий от высокоактивных продуктов, образующихся при воспалении (Ярилин А.А., 1999).

Важным компонентом воспаления является некроз, развивающийся вследствие тромбоза сосудов вокруг воспаленного участка тканей. Адаптивные изменения эндотелия в области воспаления сопровождаются внутри- и внесосудистым свертыванием фибриногена и образованием тромбоцитарного тромба. На поверхности активированного эндотелия, тромбоцитов и лейкоцитов экспрессируются и адгезируют факторы свертывания, приводящие к образованию фибрина (Alberts В. et al., 1994; Серов В. В., Пауков B.C., 1995). Соответственно, опухоли часто подвержены некрозу и изъязвлению (Струков А. И., Серов В. В., 1993).

Во время митоза клетки округляются и утрачивают прочную связь друг с другом (за счет уменьшения клеточной адгезивности и потере фокальных контактов), что серьезно нарушает целостность ткани, состоящей из таких клеток (Alberts В. et al., 1994). По данной причине метастазирование быстрее наступает у опухолей с наибольшей интенсивностью деления злокачественных клеток. Направленность метастазирования злокачественных клеток (Струков А.И., Серов В.В., 1993) определяется соответствующими тканеспецифичными рецепторами на их поверхности. Данное положение свидетельствует в пользу того, что злокачественные клетки, восполняя дефицит плюрипотентных стволовых и камбиальных клеток, приобретя сходство с плюрипотентными стволовыми клетками, при метастазировании повторяют путь и механизмы миграции стволовых клеток. Образованию специфических рецепторов на поверхности опухолевых клеток должны предшествовать связывание Т-хелперов с комплексами антиген (продукты МНС и другие пептиды погибших клеток) - молекула МНС II класса на поверхности антигенпредставляющих клеток во вторичных лимфоидных органах, активация Т-хелперов и последующее (при посредничестве антигенпредставляющих клеток) взаимодействие Т-хелперов с опухолевыми клетками.

По-видимому, активирование Т-хелперами злокачественных клеток с образованием тканеспецифичных рецепторов на их поверхности (комплементарных специфичным антигенам молекул МНС I класса старых и погибших клеток) сопровождается началом распознавания их как «своих» при одновременном (с помощью Т-супрессоров) подавлении ответа цитотоксических клеток на опухолевые антигены. Данные процессы могут приводить к развитию несостоятельности иммунного ответа при опухолях. Появление «хоминг-рецепторов» определяет пути миграции злокачественных клеток в определенную зону воспаления на месте гибели старых клеток. Преобладание гибели старых клеток над процессами регенерации в большинстве тканей лиц старших возрастных групп и соответствующее появление тканеспецифичных хемоаттрактантов (в качестве которых выступают молекулы МНС I класса) определяют потенциальные области метастазирования. В соответствии с теорией клональной селекции каждая злокачественная клетка, коммитированная к выработке одного определенного антигенспецифического хеморецептора, должна образовывать семейство или клон клеток, имеющих одинаковую антигенную специфичность.

Для контакта злокачественных клеток с Т-хелперами необходима их постоянная циркуляция через вторичные лимфоидные органы. Опухолевые клетки прикрепляются к эндотелиальным клеткам посткапиллярных венул, протискиваются между ними и попадают через лимфатический узел в лимфатические сосуды и далее через соответствующие группы лимфатических узлов и сосудов в грудной проток, по которому возвращаются в кровь. По-видимому, данная циркуляция, происходит постоянно, приводя к диссеминации опухоли.

Аналогичным образом, длительно протекающий воспалительный процесс может привести к злокачественной трансформации тканей. Длительное действие факторов альтерации, гибель большого числа клеток, ответная стимуляция пролиферации камбиальных клеток за счет повышения образования клеточных ростовых факторов, а также блокирование развития апоптоза становятся основными патогенетическими факторами злокачественной трансформации. Злокачественное перерождение хронических язв желудка, слизистой полости рта (при хроническом прикусе) и другие примеры (Напалков, 1989) подтверждают данное заключение.

В условиях преобладания гибели старых клеток над процессами регенерации у лиц старших возрастных групп, по-видимому, стимулируется образование как плюрипотентных стволовых клеток костного мозга, так и образование стволовых клеток жировой и некоторых других видов тканей. Возможно, что появление липом в ряде органов, в норме не содержащих адипоциты (например, образование липом почек), обусловлено компенсаторной миграцией столовых клеток, а также их коммитированных форм, из жировой ткани. Трансформация в адипоциты родственных им фибробластов (Alberts В. Et al., 1994), по-видимому, привела бы к жировому перерождению тканей (как, например, при метаболическом синдроме). Вовлечение жировой ткани в процессы компенсации приводит к увеличению ее массы (Печерский А.В. и др., 2006).

При повреждении клеточные факторы роста, действуя в различных комбинациях, избирательно регулируют пролиферацию и дифференцировку каждого из многочисленных типов клеток высших животных (Alberts В. et al., 1994). В условиях недостаточности количества плюрипотентных стволовых клеток и, соответственно, камбиальных клеток в области некроза (или апоптоза) и невозможности завершения регенерации данного участка ткани уровни клеточных ростовых факторов будут возрастать, вызывая интенсивную пролиферацию фибробластов. В данных условиях количество фибробластов будет значительно преобладать над количеством камбиальных клеток, приводя к образованию рубца. Соотношение камбиальных клеток и фибробластов определяет выраженность образования рубцовой ткани. При миграции адекватного числа стволовых клеток и формировании достаточного количества камбиальных клеток, по-видимому, участок некроза (или апоптоза) может полностью восстановиться без развития фиброзной ткани.

Данное заключение подтверждают полученные данные. У лиц старших возрастных групп вследствие нарушения процесса регенерации наблюдалось достоверное снижение толщины сосочкового и сетчатого слоев дермы, уменьшение размеров волосяных фолликулов, среднего количества камбиальных эпителиальных клеток матрикса волосяной луковицы и эндотелиальных клеток кровеносных капилляров. Ввиду интенсивной стимуляции клеточными ростовыми факторами среднее количество фибробластов у лиц старших возрастных групп было повышенным, а часть волосяных фолликулов была замещена рубцовой тканью (табл.2).

Системность происходящих у лиц старших возрастных групп изменений подтверждается развитием атрофии и фиброзных изменений в других тканях и органах. В частности, у мужчин отмечается атрофия яичек, проявляющаяся в развитии фиброза базальной мембраны канальцев яичек, уменьшением количества клеток Лейдига и другими изменениями. Атрофия развивается и в других эндокринных органах, например, отмечается уменьшение размеров гипофиза (Дедов И.И., Калинченко С.Ю., 2006). Инволютивные изменения стареющей почки выражаются в снижении ее массы и объема, прогрессировании накопления соединительнотканных компонентов. После 40 лет в течение каждого последующего десятилетия происходит склерозирование около 10% нефронов (Тареева И.Е., 1995).

Возрастная инволюция тимуса сопровождается снижением его массы, а также замещением эпителиального компартмента соединительной тканью и производными фибробластов - адипоцитами. После 50-60 лет отмечается снижение количества в крови и в органах Т-клеток (в большей степени Т-хелперов). Возрастное снижение Т-хелперов может негативно отразиться на формировании тканеспецифичных рецепторов плюрипотентных стволовых клеток и, соответственно, на процессе регенерации. Среди популяций тимоцитов наиболее сильно убывает численность незрелых кортикальных CD4⁺CD8 ⁺. Тем не менее, в тимус продолжают постоянно поступать костномозговые предшественники и из тимуса продолжают эмигрировать зрелые Т-клетки, хотя интенсивность этого процесса снижается (Ярилин А.А., 1999). Возрастное снижение плюрипотентных стволовых клеток негативно сказывается не только на заселении тимуса лимфоидными элементами, но и на поддержании нормального функционального состояния эпителия тимуса - на формировании эпителиального ретикулума и кортико-медуллярной структуры тимуса.

Нервная ткань имеет ряд особенностей. В отличие от нейронов, которые после дифференцировки делиться не могут, большая часть глиальных клеток сохраняют эту способность на протяжении всей жизни (Alberts В. et al., 1994). Как дифференцированные клетки они имеют ограниченное число делений и, соответственно, нуждаются в пополнении своего состава на протяжении онтогенеза. По-видимому, возрастное снижение плюрипотентных стволовых клеток также будет приводить к нарушению процесса обновления данных клеток с активизацией макрофагов (микроглии).

Во время эмбрионального развития незрелые нейроны не образовавшие аксона и дендритов мигрируют из места своего рождения по радиальным глиальным клеткам. В коре головного мозга нейроны располагаются слоями в соответствии с последовательностью их миграции. Клетки, образовавшиеся позднее, мигрируют дальше клеток, образовавшихся раньше. Радиальные глиальные клетки направляют миграцию нейронов и сохраняются в большинстве областей головного и спинного мозга до конца периода развития. После закладки основных нервных структур они исчезают и в зрелой нервной системе почти нигде не сохраняются (Alberts В. et al., 1994).

Масса и объем головного мозга у человека после рождения до окончательного формирования увеличивается в несколько раз. В частности, толщина коры к моменту рождения составляет всего 20% от толщины коры окончательно сформированного головного мозга (Клоссовский Б.Н. и др., 1977). По-видимому, постнатальное развитие центральной нервной системы также связано с миграцией стволовых клеток. Возможно, в целях обновления структур центральной нервной системы миграция стволовых клеток сохраняется на протяжении всего онтогенеза. В этом случае фрагменты погибших нейронов (несущие, в частности, специфичные для определенной клетки молекулы МНС I типа) могут стать хемоаттрактантами, позволяющими мигрировавшим и начавшим дифференцировку стволовым клеткам восстановить прежние связи погибших нейронов. Принимая во внимание общность злокачественных и плюрипотентных стволовых клеток, косвенным подтверждением обновления структур центральной нервной системы за счет миграции стволовых клеток служит метастазирование в головной мозг злокачественных опухолей других локализаций.

Необходимо отметить, что возрастные изменения головного мозга во многом аналогичны возрастным изменениям других органов. Старческое (предстарческое) слабоумие связано с прогрессирующей атрофией мозга. Заболевание обусловлено церебральным амилоидозом, выявляемым в 100% случаев. Заболевание часто сопровождается атеросклерозом и диабетом II типа, в значительной степени инициируемых возрастным снижением продукции половых гормонов (Печерский А.В. и др., 2003; Печерский А.В. и др., 2006). Как и в вышеописанных примерах возрастных изменений, ведущая роль в патогенезе амилоидоза принадлежит активации макрофагов, которые, в свою очередь, активируют целый ряд клеток, включая фибробласты и эндотелиоциты. Активация перечисленных клеток сопровождается продукцией белка фибрилл амилоида. Рассасывание амилоида (амилоидоклазия) встречается крайне редко (ввиду отсутствия методов, способных вызвать обратное развитие процессов, которые привели к заболеванию) при локальных формах амилоидоза и обусловлено фагоцитарной активностью макрофагов (Струков А.И., Серов В.В., 1993).

Уменьшение интенсивности процессов обновления тканей эндокринных органов негативно отражается на их функции. Наблюдается снижение уровня ряда инкретируемых гормонов (тестостерона, соматотропного гормона и других) (Дедов И.И., Калинченко С.Ю., 2006). Снижение продукции тестостерона приводит к появлению так называемого частичного возрастного андрогенного дефицита (PADAM) и в значительной степени инициирует развитие метаболического синдрома (X - синдрома) (Печерский А.В. и др., 2003; Печерский А.В. и др., 2006). В то же время высокие компенсаторные возможности центральной нервной системы обеспечивают сохранение стереотипных реакций его структур. Так, увеличение уровня соматотропного гормона при повышении образования эстрогенов в норме (Lavin, 1999) сохраняется у лиц старших возрастных групп, несмотря на уменьшение размеров гипофиза. После проведения орхидэктомии у мужчин по поводу рака предстательной железы сопутствующее повышение эстрона сопровождается увеличением уровня соматотропного гормона (Печерский А.В. и др., 2003).

Возрастное снижение продукции тестостерона оказывает существенное влияние на факторы внеклеточной среды, регулирующие клеточное старение. У клеток нормальных мышиных эмбрионов (способных в соответствующих условиях делится без признаков старения) при добавлении сыворотки крови пожилой особи развивается апоптоз (Alberts В. Et al., 1994). Одними из ведущих индукторов апоптоза являются глюкокортикоиды и фактор некороза опухоли (TNF- ), (Ярилин А.А., 1999); их уровни повышаются при PADAM (Печерский А.В. и др., 2003; Печерский А.В. и др., 2006).

Са⁺⁺ принимает участие в активации фагоцитирующих клеток, в перфоринзависимом механизме цитолиза, в образовании оксида азота (в значительной степени определяющего бактерицидную активность фагоцитов). Mg⁺⁺ участвует в альтернативной активации комплемента (Ярилин А.А., 1999). Повышение уровней Са⁺⁺ и Mg⁺⁺ в сыворотке крови у больных PADAM можно рассматривать как составную часть ответа иммунной системы на повышение пролиферативной активности (Печерский А.В. и др., 2003; Печерский А.В. и др., 2006) и увеличение числа старых клеток.

Са⁺⁺ и Mg ⁺⁺ принимают участие в дифференцировке клеток и пространственной организации тканей, влияя на механизмы межклеточной адгезии (Alberts В. Et al., 1994). Данные функции имеют большое значение в условиях повышенной стимуляции клеток камбиальных зон у людей старших возрастных групп.

PADAM нарушает развитие клеток, имеющих андрогенные рецепторы. Для восполнения недостаточности митогенного действия тестостерона формируется целый комплекс компенсаторно-приспособительных реакций, затрагивающих эндокринный, паракринный и аутокринный уровни (Васильев Ю.М., 1997; Берштейн Л.М., 2000; Печерский А.В. и др., 2003). Данные компенсаторные изменения выражаются в усилении инкреции клеточных факторов роста (bFGF, IGF-1, EGF и других), повышении ароматазной, 5 -редуктазной активности, увеличении уровня эндокринных активаторов деления (соматотропного гормона, инсулина), витамина D (Печерский А.В. и др., 2003) и других факторов. Повышение активности 5 -редуктазы и ароматазы приводит к увеличению синтеза 5 -дигидротестостерона и эстрогенов (Pechersky A.V. et al., 2002; Печерский А.В. и др., 2003). Эстрогены индуцируют интенсивный митогенез в тканях, содержащих специфические рецепторы (Burrows H., Horning E., 1952). 5 -Дигидротестостерон и тестостерон, связываясь с одним и тем же внутриклеточным рецептором (Lavin N., 1999), стимулируют пролиферативную активность клеток (Зазеров В.Г., Северин Е.С., 1998).

Развивающиеся компенсаторно-приспособительные реакции при снижении продукции тестостерона направлены на повышение митотической активности клеток и подавление апоптоза, а их выраженность пропорциональна степени снижения уровня тестостерона (Pechersky A.V. et al., 2002; Печерский А.В. и др., 2003; Печерский А.В. и др., 2005).

При возрастном снижении продукции тестостерона в наиболее неблагоприятной ситуации оказываются андрогензависимые клетки: повышение уровня промоторных факторов канцерогенеза в плазме крови дополняют нарушения развития клеток при прохождении андрогензависимого этапа (Печерский А.В. и др., 2005). Соответственно, доля рака предстательной железы составляет значительную часть от всех онкологических заболеваний у мужчин старших возрастных групп (Пушкарь Д.Ю., 2002). По этой же причине у больных раком предстательной железы при первичном обследовании чаще выявляется андрогензависимая опухоль (Моисеенко В.М. и др., 2004), образованная из клеток, злокачественная трансформация которых наступила на андрогензависимом этапе.

Данные изменения дополняют процессы, сопровождающие гибель старых клеток у лиц старших возрастных групп, повышая риск развития канцерогенеза.

При частичном возрастном андрогенном дефиците нарушается развитие андрогензависимых клеток, морфологически проявляющееся атрофией данных клеток (Лопаткин Н.А., 1998; Ryde C.M. et al., 1992; Sporn M.B., 1996; Берштейн Л.М., 2000; Печерский А.В. и др., 2005). Проведенное исследование выявило андрогенные рецепторы в коже теменной области у мужчин (в эпидермисе, в дерме (у фибробластов), в волосяном фолликуле и в потовых железах) (табл.3). Соответственно, у обследованных лиц старших возрастных групп были выявлены изменения в развитии андрогензависимых тканей и отдельных клеток: уменьшение толщины сосочкового и сетчатого слоев дермы, среднего количества камбиальных эпителиальных клеток матрикса волосяной луковицы, размеров волосяных фолликулов и большей части фибробластов сосочка волоса, появление деформированных и гиперхромных ядер у фибробластов (свидетельствующие о дегенеративных изменениях клеток) (табл.2). У мужчин старших возрастных групп также было меньше включений меланина в андрогензависимых клетках базального слоя. Полученные данные позволяют утверждать, что возрастное уменьшение пула плюрипотентных стволовых клеток и последующее снижение образования половых гормонов являются основными причинами развития возрастных изменений кожи, а также алопеции и седины.

Как показало проведенное исследование, стволовые клетки у мужчин имеют андрогенные рецепторы и, соответственно, являются андрогензависимыми. Возрастное снижение продукции половых гормонов негативно сказывается на развитии и пролиферации зависимых от их уровня плюрипотентных стволовых клеток, что является дополнительным негативным фактором, способствующим уменьшению их количества. Последующее нарушение регенерации тканей гонад (яичек у мужчин с уменьшением клеток Лейдига, инкретирующих тестостерон) свидетельствует о формировании порочного круга с феноменом взаимного отягощения.

Рецепторный аппарат, воспринимающий сигнал, и инкретирующие клетки и ткани представляют единую взаимозависимую систему (Kettyle W.M., Arky R.A., 2001). Распад рецепторов и замена их новыми происходит непрерывно. При отсутствии лиганда или при снижении его содержания время полужизни соответствующего рецептора увеличивается (Alberts В. et al., 1994). Закономерно у лиц старших возрастных групп по сравнению с контрольной группой было выявлено увеличение экспрессии андрогенных рецепторов эпидермиса, дермы (фибробластов), волосяных фолликулов и потовых желез, подтверждающее наличие у них андрогенного дефицита (табл.3). Повышение экспрессии андрогенных рецепторов дополняет эффект компенсаторного увеличения 5 -редуктазной и ароматазной активности, наблюдаемый при снижении уровня тестостерона (Pechersky A.V. et al., 2002; Печерский А.В. и др., 2003).

Фибробласты принимают участие в формировании специализированной архитектоники соединительной ткани, соответствующей ее локальным функциям. За счет деятельности фибробластов образуется межклеточный матрикс, содержащий коллаген I типа и III типа. Из этих типов коллагена состоит большинство видов соединительной ткани. По мере созревания соединительной ткани соотношение меняется в сторону I типа. Основу незрелых аргирофильных коллагеновых волокон составляет коллаген III типа (Серов В.В., Пауков B.C., 1995). Соответственно, у лиц старших возрастных групп при увеличении уровня клеточных ростовых факторов и, соответственно, повышении стимуляции пролиферации фибробластов в большинстве видов соединительной ткани начинает преобладать коллаген III типа. Превалирование коллагена III типа Эттингер А.П. и соавт. (2006) выявили при исследовании кожи у пациентов старших возрастных групп с послеоперационными вентральными грыжами.

Повышение уровней ФНО , продуктов дыхательного взрыва и переокисления, нарушение обновления фибробластов за счет миграции достаточного количества стволовых клеток, а также снижение продукции тестостерона, негативно влияющие на развитие андрогензависимых фибробластов, приводят к нарушению структуры соединительной ткани и процессов обновления ее компонентов у лиц старших возрастных групп. Соответственно, у обследованных лиц старших возрастных групп по сравнению с контрольной группой коллагеновые и эластические волокна имели более тонкий и разветвленный вид: наблюдалось уменьшение толщины и увеличение количества их косых и косопоперечных сечений (табл.2). Снижение прочностных характеристик соединительной ткани способствует развитию грыж различных локализаций, аневризм сосудов и других заболеваний. Изменение структуры межклеточного матрикса нарушает процессы передачи сигнала и условий для миграции клеток.

Сделанные выводы подтверждаются течением ряда известных заболеваний. Сокращение числа делений клеток у больных с синдромом преждевременного старения - синдромом Вернера, выявляемое при культивировании, по-видимому, приводит к недостаточности камбиальных и плюрипотентных стволовых клеток. В ответ на отсутствие образования адекватного количества плюрипотентных стволовых клеток для восполнения некротизированных старых клеток компенсаторно увеличивается образование целого ряда клеточных факторов роста, включая фактор роста фибробластов. Показательно, что фибробласты, взятые у больных с синдромом Вернера, оказываются нечувствительны к фактору роста фибробластов и некоторым другим ростовым факторам (Alberts В. Et al., 1994). Ввиду того что десенситизация соответствующих рецепторов клеток-мишеней развивается при длительном воздействии соответствующего стимула, десенситизация рецепторов фактора роста фибробластов является следствием повышения его уровня в течение длительного периода.

Принимая во внимание то, что при хемотаксисе клетки реагируют не на постоянную величину, а на изменение концентрации хемоаттрактанта в среде (Alberts В. et al., 1994), постоянно повышенные уровни хемотаксических факторов, выделяемые макрофагами в месте некроза (или апоптоза) старых клеток, приводят к десенситизации соответствующих рецепторов стволовых клеток, препятствуя их поступлению в данную область.

Соответственно, у больных с синдромом Вернера нарушения регенерации тканей носят системный характер. Атрофические изменения ряда эндокринных желез сопровождаются развитием их недостаточности (гипогонадизмом и другой патологии). Гипогонадизм способствует развитию остеопороза (Печерский А.В. и др., 2006), а атрофия хрящевой ткани приводит к развитию артритов. В результате у больных наблюдается ограничение подвижности суставов. Повышение промоторных факторов канцерогенеза, гормональный дисбаланс сопровождаются высоким риском развития онкологических заболеваний. Снижение количества камбиальных клеток - волосяных фолликулов, усугубляется гипогонадизмом. Уменьшение образования тестостерона негативно отражается на развитии андрогензависимых клеток кожи, включая клетки волосяного фолликула. Нарушается синтез пигмента клетками волосяной луковицы. У больных появляются преждевременное поседение и диффузная алопеция. Атрофические изменения кожи являются характерным проявление данного синдрома. Недостаточность стероидных гормонов сопровождается повышением образования их предшественника - холестерина. Активизация факторов клеточного иммунитета в ответ на повышение митотической активности способствует прогрессированию атеросклероза (Печерский А.В. и др., 2006). Данные патологические процессы характерны для клинического течения синдрома Вернера (Кряжева С.С., 1976).

Избирательное поражение Т-хелперов при СПИДе, по-видимому, препятствует образованию специфических рецепторов у плюрипотентных стволовых клеток. Информация антигенпредставляющих клеток, несущих комплекс антиген (в том числе пептиды погибших клеток) - молекула МНС II класса не считывается и не преобразуется в соответствующий рецептор плюрипотентных стволовых клеток к хемоаттрактанту, представленному компонентами молекул МНС I класса. Вероятно, в данных условиях большая часть плюрипотентных стволовых клеток, не имея тканеспецифичных рецепторов, остается невостребованной и в последующем погибает. Аналогично лицам старших возрастных групп у больных СПИДом нарушается процесс пополнения клеточного состава камбиальных зон, что вносит дополнительный негативный вклад в развитие истощения, деменции и опухолей.

Восстановление пула плюрипотентных стволовых клеток у лиц старших возрастных групп будет способствовать достаточному их поступлению в камбиальные зоны с последующим возмещением старых некротизированных клеток адекватным количеством коммутированных клеток. По-видимому, за этим последует обратное развитие описанных выше патологических процессов. Положительная клиническая динамика у онкологических больных при трансплантации культивированных собственных плюрипотентных стволовых клеток или при проведении терапии с использованием колониестимулирующих факторов подтверждает данное заключение (Константинова М.М., 2004).

Для обеспечения непрерывно происходящего процесса обновления тканей у лиц старших возрастных групп требуется постоянное поддержание нормальной численности пула плюрипотентных стволовых клеток. Культивирование собственных плюрипотентных стволовых клеток пациента с последующей их трансплантацией мало перспективно. При данном способе трансплантируемые клетки не обладают пролиферативным преимуществом перед остальными плюрипотентными стволовыми клетками пациента (они все соответствуют одному и тому же возрастному этапу программы развития). Использование данного метода ограничивается сложностью выполнения (затрудняющее его многократное применение), а также временным характером увеличения количества плюрипотентных стволовых клеток в периферической крови после трансплантации.

Использование фармакологических препаратов колониестимулирующих факторов, а также препаратов, стимулирующих образование колониестимулирующих факторов макрофагами (препараты, содержащие микробные липополисахариды, аутогемотерапия (применение банок) и другие способы) целесообразно только при постоянном их применении. Назначение данной терапии отдельными курсами не сможет обеспечить постоянства нормальной численности пула плюрипотентных стволовых клеток. Более того, плюрипотентные стволовые клетки у лиц старших возрастных групп постоянно испытывают повышенную стимуляцию за счет избыточного образования макрофагами колониестимулирующих факторов. Дополнительная стимуляция пролиферации ускорит истощение их пула, что потребует увеличения дозы применяемых препаратов в процессе терапии. На определенном этапе данная терапия станет неэффективной.

Также малоперспективной представляется искусственная трансформация клеток (относящихся к другим направлениям дифференцировки) в плюрипотентные стволовые клетки. Данные клетки образуются, минуя многостадийный путь дифференцировки от клеток зародыша до плюрипотентных стволовых клеток, строго определенный программой развития. По данной причине они не могут быть полноценной альтернативой плюрипотентным стволовым клеткам. Более того, их применение может увеличить риск развития онкологических заболеваний.

Потенциальная возможность обновления эпителиальных клеток тимуса (осуществляющих обучение Т-лимфоцитов) за счет трансплантации аллогенных стволовых клеток с последующим восприятием их тканеспецифичных антигенов иммунной системой реципиента как «свое» позволяет считать трансплантацию аллогенных плюрипотентных стволовых клеток наиболее перспективным способом поддержания нормальной численности пула плюрипотентных стволовых клеток у лиц старших возрастных групп. После трансплантации плюрипотентные стволовые клетки образуют свой пул, который принимает участие в обновлении подавляющего числа тканей организма. Индивидуум становится химерой.

Необходимо отметить, что химеризм широко распространен в живой природе: благодаря химеризму стало возможным возникновение многоклеточных организмов путем объединения одноклеточных форм. Захват эукариотической клеткой прокариотической клетки привел к появлению митохондрий - органелл прокариотических клеток, имеющих свою собственную ДНК (Alberts В. et al., 1994). Возникновение резус-конфликта при рождении Rh⁺ ребенка у Rh^- матери свидетельствует о попадании клеток крови ребенка в кровь матери при родах (Roitt I., et al., 2000). По-видимому, кроме эритроцитов в кровь матери попадают все компоненты крови ребенка, включая плюрипотентные стволовые клетки, что будет приводить к химеризму матери. Ввиду распространенности химеризма в естественных условиях искусственное формирование химерной особи может быть использовано для решения целого ряда практических задач, стоящих перед медициной.

Эффективность трансплантации аллогенных плюрипотентных стволовых клеток лицам старших возрастных групп будет зависеть от разницы между возрастом донора и возрастом реципиента. В данном случае принципиальное значение имеет этап долгосрочной внутриклеточной программы, на котором находятся клетки донора и клетки реципиента. Наличие долгосрочных внутриклеточных программ плюрипотентных стволовых клеток, определяющих их пролиферативный потенциал (их способность поддерживать необходимую численность собственного пула), существенно отличает плюрипотентные стволовые клетки лиц молодого возраста от соответсвующих клеток лиц старших возрастных групп.

Для трансплантации плюрипотентных стволовых клеток, по-видимому, может использоваться костный мозг, периферические плюрипотентные стволовые клетки или цельная кровь (в которой всегда находится определенное количество плюрипотентных стволовых клеток). С технической точки зрения переливание цельной крови представляется более простым и доступным методом. Учитывая развитие в последующем иммунологической толерантности трансплантация данных сред может быть выполнена многократно до получения нормализации численности пула плюрипотентных стволовых клеток.

С данных позиций переливание донорской пуповинной крови, в клетках которой подавлена экспрессия всех обычных антигенов МНС I класса, за исключением HLA-G (что позволяет предотвратить опасность отторжения плаценты и плода, обладающих генами отца) (Roitt I. et al., 2000), дает мало преимуществ. Более того, количество пуповинной крови одного донора, как правило, недостаточно для формирования необходимого по численности пула плюрипотентных стволовых клеток у реципиента. Проведение последующих трансплантаций костного мозга (или плюрипотентных стволовых клеток, или цельной крови) от данного лица не представляется возможным ввиду этических и юридических ограничений, связанных с его возрастом.

При существенной разнице в возрасте между донором и реципиентом пролиферативный потенциал плюрипотентных стволовых клеток донора будет существенно превосходить аналогичный показатель реципиента. Это приведет к доминированию пула плюрипотентных стволовых клеток донора в ответ на образование колониестимулирующих факторов реципиента, а также к постепенному обновлению за счет него подавляющего числа клеток тканей реципиента. Соответственно, в данных условиях оптимальным является использование для трансплантации плюрипотентных стволовых клеток от одного донора (или, что менее желательно, от ограниченного числа доноров).

Участие трансплантированных плюрипотентных стволовых клеток в обновлении подавляющего числа тканей организма, включая ткани эндокринных органов, требует учета целого ряда дополнительных факторов. Трансплантация костного мозга, или периферических стволовых клеток, или цельной крови от донора одного пола реципиенту другого пола может оказать негативное влияние на регуляцию половых гормонов. При увеличении образования гормонов противоположного пола повышается риск развития различных сердечно-сосудистых заболеваний. Соседство клеток от индивидуумов разных полов в одной ткани, вероятно, также будет сопровождаться различными реакциями несовместимости. Аналогичные реакции несовместимости, по-видимому, могут возникнуть при трансплантации костного мозга или периферических стволовых клеток от донора реципиенту, имеющих различные группы крови.

Различия, связанные с полом и группами крови появились на ранних этапах эволюции. Формирование всех регуляторных систем организма человека в процессе филогенеза происходило с учетом данных факторов. Так, антигены системы 0АВ присутствуют не только на эритроцитах, но и на многих других клетках человека, а также экспрессируются большим числом микроорганизмов. Антигены системы 0АВ локализованы в углеводной части гликопротеинов. Структура этих углеводов, как и углеводов, определяющих близкую систему групп крови - Льюис, зависит от экспрессии генов, определяющих активность ферментов, транспортирующих терминальные сахара при синтезе олигосахаридных молекул (Roitt I. et al., 2000). По этой причине трансплантация плюрипотентных стволовых клеток в составе периферических стволовых клеток, или костного мозга, или цельной крови, должна осуществляться от донора реципиенту одного пола, имеющих одинаковую группу крови.

Нарушение процесса обновления эндокринных органов приводит к развитию гормонального дисбаланса, оказывающего существенное влияние на факторы внеклеточной среды, регулирующие клеточное старение. Для повышения эффективности трансплантации плюрипотентных стволовых клеток пациенты нуждаются в соответствующей коррекции. В частности, при возрастном снижении продукции тестостерона, приводящего к увеличению уровней таких индукторов апоптоза, как глюкокортикоиды, фактор некороза опухоли (TNF- ), активные формы кислорода и азота (Печерский А.В. и др., 2003; Печерский А.В. и др., 2006), показано предварительное назначение пациентам андрогензаместительной терапии.

Уменьшение процента замещенных клеток у пациентки с развившейся реакцией «трансплантат против хозяина» по сравнению с данными других представленных пациентов без зарегистрированных осложнений (табл.1) свидетельствует о негативном влиянии реакций несовместимости на процесс обновления тканей стволовыми клетками. По аналогии с синдромом Вернера нарушение процесса обновления тканей может иметь ряд осложнений, включая развитие катаракты.

Возможно, формирование химерного индивидуума через трансплантацию ему костного мозга, или периферических стволовых клеток, или цельной крови с последующим развитием у него иммунологической толерантности позволит пересаживать ему любые ткани или органы от первичного донора.

Трансплантация аллогенных органов или тканей без предварительного формирования химеризма у реципиента будет сопровождаться постепенным замещением клеток донорского органа стволовыми клетками реципиента с последующей их дифференцировкой. Исключить параллельное вовлечение в процесс дифференцировки камбиальных клеток трансплантируемого донорского органа можно предварительным применением цитостатических препаратов. Ускорению процесса замещения клеток донорского органа стволовыми клетками реципиента будет способствовать проведение курсов с использованием препаратов колониестимулирующих факторов, а также применение препаратов, содержащих ксеногенные хемоаттрактанты пересаженных органов или тканей (для обеспечения направленности их миграции). Для улучшения миграции стволовых клеток перспективно использование препаратов гиалуроновой кислоты. Гиалуроновая кислота представляет одну из групп гикозамингликанов. Притягивая воду и тем самым вызывая набухание межклеточного матрикса, гиалуроновая кислота облегчает миграцию клеток, способствуя регенерации (Alberts В. Et al., 1994).

При повреждении ткани, по-видимому, одного прекращения действия повреждающего агента и удаления некротизированных клеток (наример, за счет применения протеолитических ферментов) недостаточно. Существенно улучшить регенерацию и уменьшить выраженность рубцевания поврежденной ткани можно за счет стимуляции образования дополнительного количества плюрипотентных стволовых клеток при использовании колониестимулирующих факторов или применения препаратов, инициирующих образование колониестимулирующих факторов макрофагами (лекарственные средства, содержащие микробные липополисахариды, аутогемотерапия (применение банок)). Данный эффект может быть дополнен использованием препаратов, обеспечивающих направленную миграцию стволовых клеток в область повреждения (препараты, содержащие ксеногенные хемоаттрактанты поврежденного органа или ткани), а также назначением гиалуроновой кислоты, улучшающей миграцию стволовых клеток по межклеточному пространству.

По-видимому, перспективным способом лечения больных с различными наследственными заболеваниями, включая синдром Вернера, могла бы стать трансплантация им костного мозга, или периферических стволовых клеток, или цельной крови от здоровых доноров одного с реципиентами пола, имеющих одинаковую с ними группу крови после предварительного проведенного кондиционирования.

Таким образом, плюрипотентные стволовые клетки являются универсальным механизмом регенерации, сформированным в процессе эволюции. Возрастное снижение количества плюрипотентных стволовых клеток нарушает процессы обновления тканей, включая ткани эндокринных органов. Развивающийся гормональный дисбаланс усугубляет происходящие изменения. Взаимное отягощение развивающихся патологических процессов приводит к формированию порочного круга. Соответственно, у людей старших возрастных групп повышается риск развития онкологических заболеваний, прогрессируют атрофические и склеротические процессы в подавляющем числе тканей, нарастают деструктивные изменения соединительной ткани (с уменьшением ее прочностных характеристик). Перспективным способом обратного развития данных патологических процессов может стать трансплантация аллогенных плюрипотентных стволовых клеток.

Клинические примеры

Клинический пример 1. Проведено исследование 7 больных, которым проводилась трансплантация донорских периферических стволовых клеток в связи с острым миелобластным лейкозом, хроническим миелолейкозом и миелодиспластическим синдромом. Предварительно всем больным проводилось кондиционирование. Подбор донора осуществлялся на основании системы гистосовместимости HLA. Возраст больных составил от 8 до 28 лет. Исследование проводилось через 1 год после трансплантации. У пациентов и их ближайших родственников (мать) производился забор венозной крови, а также дополнительно у пациентов брался соскоб букального эпителия. У пациентов проводилось определение группы крови и резус-фактора, осуществлялось сравнительное исследование крови и клеток буккального эпителия пациентов с кровью ближайшего родственника (матери) на предмет подтверждения кровного родства. Определялась экспрессия рецепторов андрогенов (AR) в 5 образцах периферических стволовых клеток доноров-мужчин.

При исследовании использовались следующие методы.

Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Образцы крови и буккального эпителия по 300 мкл центрифугировали при 12 тыс. об.мин, 7 мин осадок переносили в пластиковые пробирки и растворяли в 1 мл буфера (10 мМ трис-HCl рН 10.5, 1 мМ ЭДТА, 0.15 М NaCl). К полученным суспензиям добавляли додецилсульфат Na до 0.5% и через 20 минут - протеиназу К (до 200 мкг/мл), помещали в термостат (+55°С) на 3,5-4 часа.

Депротеинизацию проводили фенольным способом: добавляя в равном объеме к суспензии фенол, затем фенол:хлороформ (1:1), хлороформ; после каждого добавления производили постоянное встряхивание и центрифугирование при 8 тыс. об.мин, 7 мин.

К полученному после 3-го центрифугирования надосадку прибавляли 1/10 часть от объема 1 М NaCl и 2,5 объема дважды перегнанного этилового спирта и оставляли на ночь при - 30°С. ДНК, "выпавшую" в виде нитей белого цвета, центрифугировали при 12 тыс. об.мин в течение 10 минут. Дважды промывали осадок ДНК 70% этиловым спиртом и сушили при комнатной температуре (15 ч) и затем растворяли в ТЕ буфере.

Генетическая идентификация выделенных ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПНР проводили на программируемом термоциклере "Perkin Elmer" ("Cetus", США), используя стандартные олигопраймеры, синтезированные твердофазным методом на объединении "Литех" (Москва). Реакционная смесь для амплификации объемом 25 мкл включала: 15 нМ каждого олигопраймера, 67 мМ трис-HCl рН 8.8 при +25°С, 16.6 мМ (NH₄)SO₄, 6.7 mM MgCl₂, 6.7 мкМ ЭДТА, 10 мМ 2 меркаптоэтанола, 170 мкг/мл БСА и смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу Thermus thermophilis (1 ед/мкл) (Институт ядерной физики АН России, Гатчина и фирмы Promega, США). После денатурации (10 мин, 94°С) проводили по 30 циклов амплификации для каждой тест-системы: D1S80 -94°С - 1 мин, 65°С - 1 мин, 72°С - 4 мин; аро В - -94°С -1 мин, 58°С - 1 мин, 72°С - 3 мин; для тест-системы анонимного локуса 21 хромосомы (UT975) - 94°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 2 мин; D12S391 - 94°С -30 с, 56°С - 30 с, 72°С - 30 с; для vWF9 - 10 и WA31-32 - 32 цикла в режиме - 94°С - 40 с, 48°С - 40 с, 72°С - 1 мин; для ТН01, PLA2A, IFNAR - 32 цикла в режиме - 94°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 2 мин). Для тест-систем F13A01, LPL, CSF1PO, ТРОХ, (Promega, США) условия проведения ПЦР указаны в инструкции по использованию наборов фирмы. Для контроля специфичности в реакцию вводили образцы ДНК с известными генотипами по исследуемым локусам (маркерным системам), а также контрольные пробы, содержащие смесь реагентов без ДНК. После амплификации к аликвотам реакционной смеси (1-3 мкл) добавляли буфер для окрашивания и разделяли вертикальным электрофорезом в 6%-ном полиакриламидном геле (210×150×1 мм), окрашивали этидиум бромидом и фотографировали под ультрафиолетовым светом. Для идентификации аллелей использовали соответствующие для данных локусов аллельные стандарты ("лэддеры"), а также маркер "pGEM" с известным размером фрагментов ДНК. Проявление выявило на фотопленках картину результатов амплификации (геномные "профили"), состоящую из полос (аллелей) различной интенсивности и расположения.

Иммуногистохимические исследования. Определение рецепторов андрогенов (AR) проводилось одноэтапным методом с демаскировкой антигена (методом высокотемпературной обработки ткани) на парафиновых срезах с использованием диагностических наборов фирмы Novocastra Laboratories Ltd (Великобритания).

Через один год после трансплантации периферических стволовых клеток при сравнении образцов крови реципиента и его ближайшего родственника (матери) материал был признан неродственным (табл.1). При трансплантации периферических стволовых клеток от доноров, имеющих отличную от реципиентов группу крови, через 1 год у всех реципиентов определялась группа крови донора. У реципиентов через 1 год после трансплантации периферических стволовых клеток в 6 случаях в составе буккального эпителия были выявлены два вида клеток, имеющих различный генотип. У данных больных доля клеток буккального эпителия, принадлежащих противоположному реципиенту полу (полу донора), составила от 50% до 80%. В одном случае 100% клеток буккального эпителия имели генотип индивидуума, не являющегося родственным матери реципиента. Исключение составил случай с развившейся у пациента (женщины) реакцией «трансплантат против хозяина», в котором доля клеток буккального эпителия с мужским генотипом (полом донора) составила только 20%.

При гистохимическом исследовании периферических стволовых клеток доноров-мужчин выявлена экспрессия андрогенных рецепторов.

Выявление в буккальном эпителии клеток двух различных генотипов, а также неродственный характер крови реципиента и его матери через 1 год после трансплантации периферических плюрипотентных стволовых клеток подтверждает постепенное замещение клеток реципиента плюрипотентными стволовыми клетками донора. Выявленная закономерность свидетельствует об универсальности механизма регенерации, осуществляемого посредством плюрипотентных стволовых клеток.

Как показало проведенное исследование, стволовые клетки у мужчин имеют андрогенные рецепторы и, соответственно, являются андрогензависимыми. Возрастное снижение продукции половых гормонов негативно сказывается на развитии и пролиферации зависимых от их уровня плюрипотентных стволовых клеток, что является дополнительным негативным фактором, способствующим уменьшению их количества.

Клинический пример 2. Проведено исследование 5 лиц мужского пола основной подгруппы и 5 лиц мужского пола контрольной подгруппы. Возраст обследованных основной подгруппы составил от 50 до 75 лет. Критериями включения в основную подгруппу служил возраст старше 50 лет и принадлежность к мужскому полу. Контрольную группу составили 5 лиц мужского пола в возрасте от 17 до 25 лет. Критериями включения в контрольную подгруппу был возраст от 16 до 29 лет и принадлежность к мужскому полу. Все лица, составившие основную и контрольную подгруппы исследования, умерли вследствие травматических повреждений. Все представители данных подгрупп имели правильное телосложение и нормальное развитие вторичных половых признаков. У лиц основной и контрольной подгрупп были получены по 1 образцу кожи теменной части головы. Образцы тканей фиксировались в 9% растворе формальдегида. Забор материала проводился в период, составлявший менее 1 суток после наступления смерти. В гистологических срезах кожи лиц молодого возраста и лиц старших возрастных групп методом микроскопического описания оценивалась его общая структура, степень развития коллагеновых и эластических волокон. В 10-ти произвольно выбранных участках кожи каждого из обследованных лиц определялась средняя толщина сосочкового и сетчатого слоев дермы, толщина коллагеновых и эластических волокон, а также количество поперечных и косопоперечных сечений коллагеновых и эластических волокон на площади 100 мкм². У всех обследованных лиц в каждом из 10-ти измерений на площади 1000 мкм ² (1 мм²) в волосяных фолликулах (при срезе через среднюю часть основания сосочков) подсчитывалось количество эндотелиальных клеток кровеносных капилляров и фибробластов сосочка волоса, а также количество камбиальных эпителиальных клеток матрикса волосяной луковицы. В эпидермисе, в дерме, в волосяном фолликуле, в потовых железах определялась экспрессия рецепторов андрогенов (AR).

При исследовании использовались следующие методы.

Морфологическое исследование. Кусочки кожи фиксировали в 9% растворе нейтрального формальдегида, проводили через спирты и заливали в парафин по стандартной методике приготовления гистологических препаратов (Меркулов Г. А., 1961). Срезы толщиной 5 мкм окрашивали обзорными красителями (гематоксилином и эозином), а также для выявления коллагеновых и эластических волокон, соответственно, по Ван-Гизон и фукселином. Производилась съемка гистологических препаратов с использованием камеры (320 KPixel) и микроскопа Laboval.

Иммуногистохимические исследования. Определение рецепторов андрогенов (AR) проводилось одноэтапным методом с демаскировкой антигена (методом высокотемпературной обработки ткани) на парафиновых срезах с использованием диагностических наборов фирмы Novocastra Laboratories Ltd (Великобритания). Результаты идентификации AR оценивались полуколичественным методом Histochemical score (Jonat et al, 1986).

Статистический анализ. Статистический анализ проводился методом сравнения двух групп с использованием критерия Стьюдента. Все данные в тексте и таблицах представлены в форме средних значений и стандартных отклонений (М± ). Также указаны значения критерия Стьюдента (t) (Glantz, 1999).

Средние размеры сосочкового и сетчатого слоев дермы у мужчин старших возрастных групп (основная подгруппа второй группы исследования) были меньше по сравнению с аналогичными показателями у лиц молодого возраста (контрольная подгруппа второй группы исследования) соответственно в 3,1 и в 2,0 раза (табл.2). Толщина коллагеновых и эластических волокон дермы у мужчин старших возрастных групп отличалась высокой вариабельностью - коллагеновые и эластические волокна у них имели более тонкий и разветвленный вид (в отличие от молодых мужчин, у которых данные волокна выглядели одинаково широкими). У мужчин старших возрастных групп средняя толщина коллагеновых и эластических волокон в 1,5 и 2,1 раза была меньше по сравнению с мужчинами молодого возраста, а среднее количество их косых и косопоперечных сечений на 100 мкм ² соответственно в 1,5 и 2,5 раза была больше.

У мужчин старших возрастных групп на площади 1000 мкм ² (1 мм²) в волосяных фолликулах по сравнению с мужчинами молодого возраста количество эндотелиальных клеток кровеносных капилляров сосочка волоса было меньше в 2,3, а фибробластов, наоборот, больше в 1,3 раза. У лиц старших возрастных групп волосяные фолликулы были меньше, некоторые из них были замещены «рубцовой» тканью, большая часть фибробластов сосочка волоса была также меньше, имела деформированные и гиперхромные ядра (как проявление дегенеративных изменениях клеток).

Среднее количество камбиальных эпителиальных клеток матрикса волосяной луковицы, представленных базальным слоем эпителия (связанного основанием с сосочком) и промежуточным слоем (расположенным над ним), у мужчин старших возрастных групп в коже теменной области было меньше в 1,5 раза по сравнению с контрольной подгруппой. У мужчин старших возрастных групп также было меньше включений меланина в клетках базального слоя.

Значения Histochemical score AR кожи теменной области у мужчин старших возрастных групп превышали аналогичные показатели молодых мужчин контрольной подгруппы: эпидермиса в 2,7 раза, дермы (фибробласты) в 1,3 раза, волосяного фолликула в 2,1 раза и потовых желез в 2,0 раза (табл.3).

Отсутствие лиганда или снижение его содержания увеличивает время полужизни соответствующего рецептора (Alberts В. et al., 1994). Увеличение экспрессии андрогенных рецепторов эпидермиса, дермы (фибробластов), волосяных фолликулов и потовых желез, выявленное у лиц старших возрастных групп по сравнению с контрольной группой, подтверждает наличие у них андрогенного дефицита (табл.3).

При частичном возрастном андрогенном дефиците нарушается развитие андрогензависимых клеток, морфологически проявляющееся атрофией данных клеток (Лопаткин Н.А., 1998; Ryde C.M. et al., 1992; Sporn M.B., 1996; Берштейн Л.М., 2000; Печерский А.В. и др., 2005). Данное положение подтверждается выявленными изменениями кожи теменной области у мужчин старших возрастных групп, несущей андрогенные рецепторы (в эпидермисе, в дерме (у фибробластов), в волосяном фолликуле и в потовых железах) (табл.3): уменьшением толщины сосочкового и сетчатого слоев дермы, среднего количества камбиальных эпителиальных клеток матрикса волосяной луковицы, размеров волосяных фолликулов и большей части фибробластов сосочка волоса, появлением деформированных и гиперхромных ядер у фибробластов (свидетельствующих о дегенеративных изменениях клеток) (табл.2). У мужчин старших возрастных групп также было меньше включений меланина в андрогензависимых клетках базального слоя. Полученные данные позволяют утверждать, что возрастное уменьшение пула плюрипотентных стволовых клеток и последующее снижение образования половых гормонов являются основными причинами развития возрастных изменений кожи, а также алопеции и седины.

Достоверное снижение толщины сосочкового и сетчатого слоев дермы, уменьшение размеров волосяных фолликулов, среднего количества камбиальных эпителиальных клеток матрикса волосяной луковицы и эндотелиальных клеток кровеносных капилляров свидетельствуют о нарушении процесса регенерации у лиц старших возрастных групп. Повышение у лиц старших возрастных групп среднего количества фибробластов, а также замещение части волосяных фолликулов рубцовой тканью подтверждают наличие интенсивной стимуляции фибробластов клеточными ростовыми факторами (табл.2) вследствие недостаточности количества плюрипотентных стволовых клеток и, соответственно, камбиальных клеток в области некроза (или апоптоза) и невозможности завершения регенерации ткани. В данных условиях значительное преобладание количества фибробластов над количеством камбиальных клеток приводит к образованию рубца.

Список литературы

Берштейн Л.М. 2000. Гормональный канцерогенез. СПб.: Наука. 200 с.

Винградов В.М. 2004. Радиобиологические основы возникновения лучевых повреждений и их классификация; под ред. В.М.Моисеенко, А.Ф.Урманчеевой, К.П.Хансона. СПб.: Издательство Н-Л. 704 с.

Дедов И.И., Калинченко С.Ю. 2006. Возрастной андрогенный дефицит у мужчин. М.: Практическая медицина. 240 с.

Васильев Ю.М. 1997. Социальное поведение нормальных клеток и антисоциальное поведение опухолевых клеток. Сорос, образовательный журнал. 4: 17-22.

Зазеров В.Г., Северин Е.С. 1998. Молекулярные механизмы онкогенеза предстательной железы. Вестник РАМН. 5: 29-35.

Клосовский Б.Н., Кононова Е.П., Филимонов И.Н. и др. 1977. Головной мозг. Большая медицинская энциклопедия. М.: Советская энциклопедия. Т. 6. 632 с.

Константинова М.М. 2004. Принципы и методы оценки эффективности лекарственной терапии и качества жизни больных злокачественными опухолями; под ред. В.М.Моисеенко, А.Ф.Урманчеевой, К.П.Хансона. СПб.: Издательство Н-Л. 704 с.

Крылова Т.А., Зенин В.В., Михайлова Н.А. и др. 2005. Постоянные линии эмбриональных стволовых клеток человека. Цитология. 47(2): 121-129.

Кряжева С.С. 1976. Вернера синдром. Большая медицинская энциклопедия. Т.4. 576 с.

Лопаткин Н.А. 1998. Руководство по урологии. М.: Медицина. Т. 3. 672 с.

Машковский М.Д., 2002. Лекарственные средства. М.: Новая волна. Т. 2. 608 с.

Меркулов Г.А. 1961. Курс патологогистологической техники. Л.: МедГиз. 346 с.

Моисеенко В.М., Урмачеева А.Ф., Хансон К.П. 2004. Лекции по фундаментальной и клинической онкологии. СПб.: Издательство Н-Л. 704 с.

Напалков Н.П. 1989. Общая онкология. Л.: Медицина. 647 с.

Печерский А.В., Семиглазов В.Ф., Лоран В.Ф. и др. 2003. Изменение уровня цитокинов у пациентов с раком предстательной железы после орхидэктомии. TERRA MEDICA nova, специальный выпуск «Лабораторная диагностика». 2: 26-30.

Печерский А.В., Семиглазов В.Ф., Комяков Б.К. и др. 2005. Изменение экспрессии рецепторов стероидных гормонов при развитии частичного возрастного андрогенного дефицита (PADAM). Цитология. 47(4): 311-317.

Печерский А.В., Семиглазов В.Ф., Мазуров В.И. и др. 2006. Влияние частичного возрастного андрогенного дефицита на развитие метаболического синдрома. Лабораторная диагностика. 4: 12-19.

Пушкарь Д.Ю. 2004. Радикальная простатэктомия. - М.: Медпресс-информ, 168 с.

Серое В.В., Пауков B.C. 1995. Воспаление. М.: Медицина. 640 с.

Струков А.И., Серов В.В. 1993. Патологическая анатомия. М.: Медицина. 688 с.

Тареева И.Е. 1995. Нефрология. М.: Медицина. (1). 496 с.

Тепляшин А.С., Коржикова С.В., Шарифуллина С.З. и др. 2005. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани. Цитология. 47(2): 130-135.

Эттингер А.П., Ступин В.А., Нестеренко Ю.А. и др. 2006. Материалы юбилейной конференции «Актуальные вопросы геронтологии». С.51.

Ярилин А.А. 1999. Основы иммунологии. М.: Медицина. 608 с.

Alberts В., Bray D., Lewis J. et al. 1994. Molecular biology of the cell. (1). 517 p. (2). 539 p.(3). 504 p.

Bremner W.J., Vitietto М. V., Prinz P.N. 1983. Loss of circadian rhythmicity in blood testosterone levels with aging in normal men. Clin. Endocrin. Metab. 56: 1278-1281.

Burrows H., Homing E. 1952. Oestrogens and neoplasia. Sprifield. Illinois.: Charles C. Thomas Publ. 189 p.

Fernandez E., La Vecchia C., D'Avanzo B., Franceschi S., Parazinni F. 1996. Oral contraceptives, hormone replacement therapy and the risk of colorectal cancer. Brit.J.Cancer. 73: 1431-1435.

Glantz S.A. 1999. Primer of biostatistics. Moscow: Practica. 459 p.

Gray A., Feldman H.A., McKinlay J.B., Longcope C. 1991. Age, disease and changing sex-hormone levels in middle-aged men: Results of the Massachusetts male aging study, Clin. Endocinol. 73 (2): 1016-1025.

Jonat W., Maass H., Stegner H.E. 1986. Immunohistochemical measurement of estrogen receptors in breast cancer tissue samples. Cancer Res. 46: 4296-4298.

Kettyle W.M., Arky R.A., 2001. Endocrine pathophysiology. St. Petersburg: Nevsky Dialect. 336 с.

Lavin N. 1999. Endocrinology. Moscow: Practica. 1128 p.

Pechersky A.V., Semiglazov V.F., Mazurov V.I., Karpischenko A.I., Mikhailichenko V. V., Udintsev A. V. 2002. Androgen administration in middle-aged and ageing men: effects of oral testosterone undecanoate on dihydrotestosterone, estradiol and prostate volume. International Journal of Andrology. 25: 119-125.

Roitt I., Brostoff J., Male D. 2000. Immunology. Moscow: Mir. 582 p.

Ryde C. M., Nicholls J. E., Dowsett M. 1992. Steroid and growth factor modulation of aromatase activity in MCF7 and Т 47D breast carcinoma cell lines. Cancer Res. 52:1411-1415.

Sporn M. B. 1996. The war on cancer. Lancet. 347: 1377-1381.

Toma J.G., Akhavan M., Fernandes K.J. et al. 2001. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3: 778-784.

Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et al. 2002. Human adipose tissue is source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13: 4279-4295.

Таблица 1
Результаты исследования у пациентов через 1 год после трансплантации периферических стволовых клеток, осуществленной после предварительно проведенного кондиционирования
Пациент	Диагноз	Вид трансплантата	Группа крови донора	Группа крови реципиента до трансплантации	Группа крови реципиента после трансплантации	Сравнение крови пациента и крови его матери по генетическим показателям	Генетическое исследование буккального соскоба пациента	Течение после трансплантационного периода
Б., женщина	Хр. миелолейкоз	Периферические стволовые клетки	A (II) Rh (+)	В (III) Rh (+)	А (II) Rh (+)	Родство исключено	Смесь образцов: 50% мужского и 50% женского	Осложнений нет
X, мужчина	Хр. миелолейкоз	Периферические стволовые клетки	0(1) Rh (+)	AB (IV) Rh (+)	АВ (IV) Rh (+)	Родство исключено	Образец: 100% мужской При сравнении с кровью матери - родство исключено	Осложнений нет
Б., мужчина	Острый миелобластный лейкоз	Периферические стволовые клетки	A (II)Rh (+)	В (III) Rh (+)	А (II) Rh (+)	Родство исключено	Смесь образцов: 75% мужского и 25% мужского	Осложнений нет
М., женщина	Острый миелобластный лейкоз	Периферические стволовые клетки	AB(TV) Rh (+)	AB(IV) Rh (+)	AB(IV) Rh(+)	Родство исключено	Смесь образцов: 80% женского и 20% мужского	Реакция «Трансплантат- против хозяина»
Б., женщина	Острый миелобластный лейкоз	Периферические стволовые клетки	О (I) Rh (+)	O (I) Rh (-)	O (I) Rh (+)	Родство исключено	Смесь образцов: 80% мужского и 20% женского	Осложнений нет
М, женщина	Миелодиспластический синдром	Периферические стволовые клетки	A(II)Rh (+)	O(I) Rh(+)	A(II) Rh (+)	Родство исключено	Смесь образцов; 50% мужского и 50% женского	Осложнений нет
Ш., женщина	Хр. миелолейкоз	Периферические стволовые клетки	A(II)Rh (+)	А(II) Rh(+)	А(II) Rh (+)	Родство исключено	Смесь образцов: 50% мужского и 50% женского	Осложнений нет

Таблица 2
Гистологические показатели кожи теменной части головы у мужчин старших возрастных групп (n=5) и мужчин молодого возраста (n=5)
	Толщина сосочкового слоя дермы	Толщина сетчатого слоя дермы	К-во камбиальных эпителиальных клеток волосяных луковиц в 1000 мкм2	К-во эндотельных клеток волосяных сосочков в 1000 мкм 2	К-во фибробластов волосяных сосочков в 1000 мкм2	К-во сечений коллагеновых волокон кожи в 100 мкм2	К-во сечений эластических волокон кожи в 100 мкм2	Толщина коллагеновых волокон кожи	Толщина эластических волокон кожи
Мужчины старших возрастных групп, ± ,	0,114±0,03	1,74±0,16	196,4±28,2	13,0±3,7	62,2±2,0	24,2±4,3	61,8±5,0	4,84±0,3	0,92±0,04
Мужчины молодого возраста, ± ,	0,358±0,03	3,58±0,19	290,2±14,9	29,2±11,6	47,0±3,5	16±1,5	24,4±2,4	7,46±0,3	2,06±0,05
t	11,632	16,263	6,575	2,980	-8,454	-4,083	-15,068	12,142	40,305
р	р<0,05	р<0,001	р<0,001	р<0,05	р<0,001	р<0,005	р<0,001	р<0,001	р<0,001

Таблица 3
Экспрессия андрогенных рецепторов кожи теменной части головы у мужчин старших возрастных групп (n=5) и мужчин молодого возраста (n=5) (Histochemical score)
	AR-эпидермиса	AR-дермы (фибробласты)	AR-волосяного фолликула	AR-потовых желез
Мужчины старших возрастных групп, ± ,	170±54,1	231±30,7	150±39,5	157±25,6
Мужчины молодого возраста, ± ,	62±54,3	185±36,0	71±57,3	76±61,1
t	-3,150	-2,171	-2,538	-2,734
р	р<0,05	р>0,05	р<0,05	р<0,05