иммуноглобулин человека противосибиреязвенный для внутривенного введения

Формула изобретения

Иммуноглобулин человека противосибиреязвенный для внутривенного введения, представляющий собой 5,0±0,5% гамма-глобулин, содержащий 100% IgG с титром антител к ПА в ИФА не менее 1:1600, полученный из плазмы крови доноров, иммунизированных комбинированной сибиреязвенной вакциной, содержащей антитела к ПА сибиреязвенного микроба в титре не менее 1:400 по результатам ИФА.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинским иммунобиологическим сывороточным препаратам, используемым для экстренной профилактики и лечения сибиреязвенной инфекции у людей.

Одним из известных сывороточных препаратов для внутривенного введения является иммуноглобулин человека нормальный (Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов. /Под ред. С.Г.Дзагурова, Ф.Ф.Резепова. - М., Медицина, 1975, 223 с.; Руководство по вакцинному и сывороточному делу. /Под ред. П.Н.Бургасова. - М., Медицина, 1978, 440 с.). Данный препарат используется для лечения тяжелых токсических форм бактериальных и вирусных инфекций, а также послеоперационных осложнений, сопровождающихся септицемией. Активным компонентом его являются иммуноглобулины, обладающие активностью антител различной специфичности. Препарат обладает неспецифической активностью, проявляющейся в повышении общей резистентности организма. Однако использование данного препарата для лечения сибирской язвы неэффективно.

Известен глобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий и сухой, выпускаемый Научно-исследовательским институтом микробиологии МО РФ (г.Киров), представляющий собой 8-10% раствор иммуноактивных - и -глобулиновых фракций гипериммунной лошадиной противосибиреязвенной сыворотки (Патент РФ №2214836 «Глобулин противосибиреязвенный лошадиный сухой»).

Недостатком вышеуказанного препарата, прежде всего, является его гетерогенность. Белки, входящие в его состав, обладают выраженными антигенными свойствами для человека. Введение данного препарата в организм человека может сопровождаться сенсибилизирующим действием сывороточных белков (сывороточная болезнь, анафилактический шок), что требует предварительного определения индивидуальной чувствительности организма к белкам данного препарата путем постановки специальной внутрикожной пробы.

К причинам, препятствующим достижению полноценного результата для экстренной профилактики и лечения, относится то, что при введении глобулина противосибиреязвенного лошадиного в мышцу адсорбция препарата происходит медленно, уровень антител в крови реципиента достигает максимума только на 3...6 сутки, и до 30% введенного препарата «утилизируется» в месте введения. Кроме того, создаваемый данным препаратом пассивный иммунитет носит кратковременный характер, длительность его составляет 1...2 недели. Кратковременность иммунитета обуславливается, главным образом, образованием антител к белкам введенной сыворотки, являющейся для организма чужеродным антигеном. По этой же причине после повторного введения препарата длительность пребывания антител в организме еще больше уменьшается в результате действия ранее образовавшихся антител к белкам введенного препарата.

Задачей настоящего изобретения является получение готовой лекарственной формы иммуноглобулина человека противосибиреязвенного жидкого и сухого для внутривенного введения.

Решение поставленной задачи достигается тем, что глобулин для внутривенного введения содержит специфически активные белки гомологичного происхождения.

Новый препарат представляет собой 5,0±0,5% гамма-глобулин, содержащий не менее 95% IgG с титром антител к протективному антигену (ПА) в ИФА не менее 1:1600, полученный из плазмы крови доноров, иммунизированных комбинированной сибиреязвенной вакциной, содержащих антитела к ПА сибиреязвенного микроба в титре не менее 1:400 по результатам ИФА.

Выделение белковой фракции IgG состоит из следующих этапов:

1. Отбор доноров, проверенных на отсутствие антител к вирусам иммунодефицита человека и гепатитов, и их последующая иммунизация комбинированной сибиреязвенной вакциной.

2. Забор плазмы крови доноров через 20...22 дня после иммунизации методом прерывистого двойного плазмафереза и определение специфической активности образцов плазмы (титра антител к ПА сибиреязвенного микроба) методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

3. Отбор, по результатам ИФА, образцов плазмы, содержащих антитела к ПА сибиреязвенного микроба в титре 1:400 и выше.

4. Получение концентрата иммуноглобулина G по схеме, составленной на основе 6-го метода Cohn и 9-го метода Cohn - Onkley (Наставление по применению ботулинических сывороток типов В, С, Е, F, очищенных методом пептического переваривания, концентрированных. Утв. МЗ СССР 09.12.1983 г.).

5. Приготовление внутривенной формы иммуноглобулина путем кислотно-ферментативного гидролиза.

Белковая фракция IgG, выделенная из плазмы крови доноров, иммунизированных комбинированной сибиреязвенной вакциной, является гомологичной, нереактогенной для человеческого организма и обладает специфической активностью к ПА сибиреязвенного микроба.

Проведенный анализ, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Сущность изобретения заключается в получении готовой лекарственной формы иммуноглобулина человека противосибиреязвенного, представляющей собой специфически активную белковую фракцию, выделенную из плазмы крови доноров, предварительно иммунизированных комбинированной сибиреязвенной вакциной СТИ-1, проверенных на отсутствие антител к вирусам иммунодефицита человека и гепатитов, содержащую специфические антитела.

Возможность практического осуществления заявляемого изобретения подтверждается следующим примером.

Пример

В реактор загружают иммунную плазму с титром антител 1:400 в объеме 40 л, 53% этиловым спиртом, охлажденным до минус 12°С, проводят осаждение фракции крови - фибриногена, являющегося «бросовым» осадком. Осажденный фибриноген выделяют из реакционной смеси центрифугированием на суперцентрифуге СГО-100 при скорости вращения ротора 15000 об/мин. Получают центрифугат I в количестве 45 л (1,13 л/л плазмы).

Центрифугат I возвращают в реактор, где 53% этиловым спиртом, охлажденным до температуры минус 12°С, проводят осаждение фракции иммуноглобулинов. Осадок выделяют из реакционной смеси центрифугированием на суперцентрифуге СГО-100 при скорости вращения ротора 15000 об/мин. Получают 1,7 кг осадка фракции II+III с титром антител к возбудителю сибирской язвы в разведении 1:400.

Полученный осадок «выпрессовывают» при температуре минус 25°С для удаления свободного этилового спирта.

В дальнейшем проводят фракционирование осадка фракции II+III (иммуноглобулинов).

Для этого проводят отмывку осадка от низкомолекулярных белков. Осадок растворяют 5% этиловым спиртом, приготовленным на 0,85% растворе хлористого натрия. Полученную суспензию охлаждают в реакторах до минус (1,5...2)°С, осаждение (отмывку) проводят 50% этиловым спиртом.

Затем осуществляют осаждение бета-глобулинов и липоидов.

Для этого реакционную смесь после длительного выстаивания пропускают через суперцентрифугу СГО. Полученный осадок (фракция иммуноглобулинов) вновь растворяют в 0,014 М растворе хлористого натрия и охлаждают в реакторе до температуры +0,1-0,2°С. Концентрацию водородных ионов доводят до 4,95...4,98 ед. рН.

Осаждение бета-глобулинов и липоидов проводят 50% этиловым спиртом (скорость подачи в начале осаждения 20 л/час, в конце осаждения - 12 л/час), охлажденным до минус 16°С. Концентрацию водородных ионов при этом устанавливают на уровне 5,22 ед. рН. После длительного перемешивания и «выстаивания» смесь центрифугируют на суперцентрифуге СГО, полученный осадок бета-глобулинов и липоидов актируют и получают 1,3 кг осадка.

Дополнительное удаление липоидов проводят подщелачиванием растворов до значений 5,56 ед. рН 1М раствором натрия двууглекислого с одновременным повышением температуры с минус 5...6 до минус 4,5°С. После перемешивания смесь центрифугируют, полученные осадки липоидов актируют и получают 0,08 кг осадка.

Осаждение гамма-глобулиновой фракции проводят 50% этиловым спиртом в присутствии натрия хлористого и натрия двууглекислого при концентрации водородных ионов 6,97 ед. рН в начале осаждения, 7,2 ед. рН - в конце осаждения и при температуре смеси в конце осаждения минус 9,5°С.

После 15-часового выстаивания и перемешивания смесь центрифугируют.

В результате центрифугирования получают осадок гамма-глобулиновой фракции весом 0,6 кг (выход с 1 л плазмы - 1,5 г/л).

На завершающем этапе проводят удаление из осадка технологического этилового спирта, который составляет 70% веса осадка и имеет крепость 40°.

Для этого используют фильтры «Biomax-30» установки «Pellicon-2» (фирма «Millihore» США). Полное удаление этилового спирта достигается 5-кратным разведением осадка водой для инъекций и проведением пяти циклов ультрафильтрации через фильтры «Biomax-30».

Ультрафильтрация позволяет, одновременно с удалением спирта из раствора, провести концентрирование белка. В данном случае белок концентрируется с 1,8% в начале ультрафильтрации до 11,5% - в конце.

В дальнейшем устанавливают содержание белка в растворе 5,0±0,5%, рН 7,0±0,5, иммуноглобулин подвергают стерилизующей фильтрации и разливают по флаконам.

Полученный таким образом иммуноглобулин человека противосибиреязвенный для внутривенного введения является гомологичным и практически нереактогенным для человеческого организма препаратом, выгодно отличающимся от глобулина противосибиреязвенного лошадиного объемом безопасной для введения дозы, скоростью возникновения и длительностью создаваемого пассивного иммунитета до 30 суток. Препарат позволяет эффективно и более безопасно проводить экстренную профилактику и лечение больных сибиреязвенной инфекцией различной степени тяжести.

Основные показатели качества иммуноглобулина человека противосибиреязвенного для внутривенного введения представлены в таблице.

Основные показатели качества иммуноглобулина человека противосибиреязвенного для внутривенного введения
Наименование показателя качества	Иммуноглобулин человека противосибиреязвенный
Подлинность	Выявляются только белки сыворотки крови человека, белки животного происхождения отсутствуют
Прозрачность, ед. опт. плотн.	0,01
Цветность, ед.	0,017
Содержание белка, %	5,4
Электрофоретическая однородность	100% -глобулин человека
Стерильность	стерилен
Пирогенность	непирогенен
Токсичность	нетоксичен
рН, ед. рН	6,65
Титр антител к ПА в ИФА, ед. титра	Не менее 1:1600
Фракционный состав в иммуноэлектрофорезе	Интенсивная дуга IgG человека и одна дополнительная дуга
Индекс превентивных свойств, отн. ед.	0,5
Содержание хлоридов, %	0,9
Содержание глюкозы, %	0,54
Содержание гликокола, %	0,63
Молекулярные параметры	Димеры IgG человека - 3,3% Мономеры - 84,9% Фрагменты - 11,8%
Антикомплементарная активность	0 ед. СН50 комплемента на 1 мг белка