способ диагностики аспиринорезистентности у больных ишемической болезнью сердца

Формула изобретения

Способ диагностики аспиринорезистентности у больных ишемической болезнью сердца, заключающийся в определении резистентности тромбоцитов к аспирину, отличающийся тем, что до начала терапии аспирином в тромбоцитах периферической крови больных определяют активность реакций НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ, после чего вычисляют коэффициент кофакторного обмена тромбоцитов (ККОТ) по формуле ККОТ=ИОР/ИВН, где ИОР представляет собой отношение уровней активности НАДФ- и НАДФН-зависимых реакций глутаматдегидрогеназы (т.е. ИОР=НАДФ-ГДГ/НАДФН-ГДГ), а ИВН представляет собой отношение уровня активности НАДН-зависимой реакции глутаматдегидрогеназы к уровню активности НАД-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (т.е. ИВН=НАДН-ГДГ/НАД-ЛДГ), и при значении ККОТ выше 0,3 прогнозируют аспиринорезистентность, а при значении ККОТ, равном или меньше 0,3, - чувствительность к аспирину.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии. Может быть использовано при лечении больных ишемической болезнью сердца (ИБС).

Известен способ определения аспиринорезистентности (АР) посредством агрегатометрии тромбоцитов, при котором АР выявляют через 2-3 дня и через 5 дней после начала приема аспирина [1]. В случае АР пациенту назначают другой препарат. Диагностическая ценность известного способа ограничена, так как метод не позволяет диагностировать АР до начала лечения препаратом.

Задачей изобретения является разработка достоверного способа диагностики аспиринорезистентности у больных ИБС до начала лечения аспирином.

Поставленная задача решается тем, что до начала терапии аспирином в тромбоцитах периферической крови больных ИБС определяют показатели активности реакций НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ, после чего вычисляют коэффициент кофакторного обмена тромбоцитов (ККОТ) по формуле ККОТ=ИОР/ИВН. ИОР представляет собой отношение уровней активности НАДФ- и НАДФН-зависимых реакций глутаматдегидрогеназы, т.е. ИОР=НАДФ-ГДГ/НАДФН-ГДГ. ИВН представляет собой отношение уровня активности НАДН-зависимой реакции глутаматдегидрогеназы к уровню активности НАД-зависимой реакции лактатдегидрогеназы, т.е. ИВН=НАДН-ГДГ/НАД-ЛДГ. При значении ККОТ выше 0,3 прогнозируют аспиринорезистентность, а при значении ККОТ, равном или меньше 0,3, - чувствительность больного к аспирину.

Значение 0,3 получено на основании сопоставления значений ККОТ у больных ИБС до начала терапии аспирином с оценкой аспиринорезистентности этих больных.

Известно, что у больных ИБС при исследовании показателей гемостаза выявляется гиперфункциональное состояние тромбоцитов и изменения плазменного звена. Данные нарушения значительно ухудшают прогноз заболевания и осложняют лечение. Ключевую роль в системе гемостаза играют тромбоциты. Именно эти клетки создают основу клеточного звена системы гемостаза, а также в тромбоцитах синтезируется ряд факторов плазменного звена гемостаза, в частности фибриноген. Функция тромбоцитов во многом определяется состоянием их внутриклеточной метаболической системы. Именно через метаболическую систему реализуется действие ряда веществ на тромбоциты, в том числе и воздействие аспирина. Активность дегидрогеназ наиболее объективно отражает состояние внутриклеточного обмена [2].

ЛДГ (КФ 1.1.1.27) - фермент гликолиза, обратимо катализирующий окисление лактата в пировиноградную кислоту с участием в качестве кофермента НАД. ЛДГ занимает ключевое положение в регуляции цитоплазматического уровня НАДН/НАД. В случае избытка НАДН в цитоплазме ЛДГ восстанавливает пируват до лактата, который затем удаляется из клетки (анаэробная реакция ЛДГ). В то же время, при активации аэробных процессов ЛДГ может окислять лактат до пирувата с образованием НАДН (аэробная реакция ЛДГ).

Глутаматдегидрогеназы осуществляют окислительное дезаминирование Г-глутаминовой кислоты. Выделяют две глутаматдегидрогеназы, использующие в качестве кофакторов НАД (КФ 1.4.1.2) или НАДФ (КФ 1.4.1.4). Ферментативные реакции глутаматдегидрогеназ являются обратимыми, соответственно аммиак в присутствии НАД(Ф)Н и -кетоглутаровой кислоты может участвовать в синтезе глутамата. НАД- и НАДФ-зависимые глутаматдегидрогеназы являются регуляторными в системе аминокислотного обмена.

Способ выполняется следующим образом.

Выделяют тромбоциты из 9 мл венозной крови по методу, предложенному Савченко Е.А. с соавт. [3]. Для этого венозную кровь смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Обогащенную тромбоцитами плазму получают путем центрифугирования стабилизированной крови при 140g в течение 10 минут. Из пробирки осторожно отбирают супернатант, переносят в чистую пробирку и доводят до 10 мл буфером №1 (90 мМ MaCl, 5 мМ KCl, 36 мМ цитрата натрия, 10 мМ ЭДТА, рН=7,2). Полученную смесь центрифугируют 15 мин при 400g. Осадок ресуспензируют в 10 мл буфера №1 и повторно центрифугируют 1 мин при 400g. Отбирают 9 мл супернатанта, который вновь центрифугируют при 400g в течение 15 мин. Супернатант аккуратно сливают, а к осадку добавляют 10 мл буфера №2 (0,13 М NaCl, 0,02 М Трис-HCl буфера, 0,03 М ЭДТА, 0,015 М глюкозы, рН=7,4) и центрифугируют в том же режиме. После чего осадок разводят в 400 мкл буфера №2 и центрифугируют 50 с при 140g. Для дальнейших исследований отбирают 250 мкл супернатанта. Для определения активности реакций НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ из забранного супернатанта с тромбоцитами отбирают объем, содержащий 10⁷ клеток. Разрушают тромбоциты методом осмотического лизиса с доведением общего объема до 2,5 мл (конечная концентрация клеток составляет 4×10⁶/мл). Активность реакций ЛДГ, НАДФ-ГДГ, НАДФН-ГДГ и НАДН-ГДГ определяют с помощью биолюминесцентного метода [4, 5]. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных тромбоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определения активности ферментативных реакций представлены в таблице 1.

Таблица 1
Ферментативные реакции	Субстрат, мМ	Кофактор, мМ	РН буфера
НАД-ЛДГ	Лактат-2,0	НАД-0,50	9,0
НАДФ-ГДГ	Глутамат-0,5	НАДФ-1,65	9,8
НАДФН-ГДГ	2-оксоглутарат-100,0	НАДФН-0,0025	7,4
НАДН-ГДГ	2-оксоглутарат-100,0	НАДН-0,0025	7,0

Для определения активности реакций НАДФН-ГДГ и НАДН-ГДГ в инкубационную смесь дополнительно вносят NH ₄CL в концентрации 5.0 мМ. После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут для реакций ЛДГ и НАДФ-ГДГ или в течение 5 минут для реакций НАДФН-ГДГ и НАДН-ГДГ к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5 М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 М К⁺,Na ⁺-фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы измеряют свечение с помощью биохемилюминометра, например, марки "БЛМ-8803". Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение проводят в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биохемилюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности, строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДН и НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения активности реакций дегидрогеназ, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят для каждого рН буфера. Активность реакций НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ рассчитывают по формуле:

где А - активность реакций дегидрогеназ, Е на 2×10 ⁵ тромбоцитов (1Е=1 мкмоль/мин [2]);

[С] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

Т - время инкубации, мин.

Затем рассчитывают индекс ИОР по соотношению уровней активности реакций НАДФ-ГДГ и НАДФН-ГДГ (ИОР=НАДФ-ГДГ/НАДФН-ГДГ). Индекс ИВН определяют по соотношению уровней активности реакций НАДН-ГДГ и НАД-ЛДГ (ИВН=НАДН-ГДГ/НАД-ЛДГ). Затем находят коэффициент ККОТ по соотношению индексов ИОР и ИВН (ККОТ=ИОР/ИВН). Величина ККОТ выше 0,3 свидетельствует об АР, а ККОТ, равный или меньший 0,3, свидетельствует о чувствительности тромбоцитов больных ИБС к аспирину.

В таблице 2 представлены результаты обследований 38 больных ИБС, проведенных в кардиохирургическом отделении Красноярской краевой клинической больницы №1. До начала лечения аспирином (в дозе 75-150 мг/сутки) по предложенному способу в тромбоцитах крови больных определяли активность реакций НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ, рассчитывали ККОТ и в зависимости от его значения диагностировали АР или чувствительность тромбоцитов к аспирину. Через 5 суток после начала лечения аспирином у наблюдаемых больных определяли аспиринорезистентность по данным агрегатометрии: у 12 больных диагностировали АР, у 28 больных тромбоциты оказались чувствительными к действию аспирина. Данные, представленные в таблице, показывают, что у 36 из 38 больных отмечено совпадение прогноза по предложенному способу (94,7%).

Таблица 2
Номер п/п	Прогноз по предложенному способу	ИОР	ИВН	ККОТ	Совпадение прогноза
1	АР	0,02	0,02	1,00	Да
2	АЧ	0,00	0,19	0,00	Да
3	АР	0,02	0,06	0,33	Да
4	АР	0,02	0,06	0,33	Да
5	АЧ	0,00	0,39	0,00	Да
6	АР	0,05	0,02	2,25	Да
7	АР	0,02	0,03	0,67	Да
8	АЧ	0,00	0,06	0,00	Да
9	АЧ	0,00	0,06	0,00	Да
10	АЧ	0,00	0,06	0,00	Да
11	АР	0,07	0,06	1,17	Да
12	АР	0,02	0,02	1,00	Да
13	АЧ	0,00	0,15	0,00	Да
14	АЧ	0,00	0,27	0,00	Да
15	АЧ	0,00	0,08	0,00	Да
16	АЧ	0,01	0,10	0,10	Нет
17	АЧ	0,00	0,01	0,00	Да
18	АР	0,55	0,01	55,00	Да
19	АЧ	0,00	0,33	0,00	Да
20	АЧ	0,00	0,25	0,00	Да
21	АЧ	0,00	0,26	0,00	Да
22	АЧ	0,00	1,17	0,00	Да
23	АР	0,11	0,02	5,50	Да
24	АЧ	0,00	0,04	0,00	Да
25	АЧ	0,00	0,07	0,00	Да
26	АР	0,06	0,03	2,00	Нет
27	АР	0,02	0,02	1,00	Да
28	АЧ	0,01	0,33	0,03	Да
29	АЧ	0,01	0,08	0,13	Да
30	АЧ	0,00	0,09	0,00	Да
31	АЧ	0,00	0,24	0,00	Да
32	АЧ	0,01	0,05	0,20	Да
33	АЧ	0,03	0,11	0,27	Да
34	АЧ	0,00	0,08	0,00	Да
35	АЧ	0,01	0,11	0,09	Да
36	АЧ	0,02	0,09	0,22	Да
37	АЧ	0,01	0,12	0,08	Да
38	АР	0,16	0,10	1,60	Да
Примечание: АР - аспиринорезистентность; АЧ - аспириночувствительность.

Клинические примеры.

Пример 1. Больной Н., 64 года (данные №11 в табл.2). История болезни №4984. Находился на стационарном лечении в кардиохирургическом отделении Краевой клинической больницы №1 с 02.03.2005 по 05.04.2005 с диагнозом ИБС, стенокардия 3 функционального класса, постинфарктный кардиосклероз. Проведено обследование по предложенному способу. В тромбоцитах периферической крови больного определены активности реакций дегидрогеназ: ЛДГ=947,15 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФ-ГДГ=3,39 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДН-ГДГ=54,03 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФН-ГДГ=46,94 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов. Рассчитаны значения ИОР, ИВН и ККОТ: ИОР=0,07; ИВН=0,06; ККОТ=0,07/0,06=1,17. Согласно изобретению ККОТ>0,3 свидетельствует об аспиринорезистентности больного. При поступлении больного в стационар проведено исследование агрегации тромбоцитов (лазерный агрегометр "Biola", Москва) с АДФ (5 мкМ): светопропускание составило 40%. Через 5 суток после начала лечения аспирином проведена агрегатометрия тромбоцитов с АДФ: светопропускание составило 60%. Следовательно, на фоне лечения аспирином снижения агрегации тромбоцитов не произошло, что подтверждает аспиринорезистентность больного.

Пример 2. Больной А., 54 года (данные №17 в табл.2). История болезни №8205. Находился на стационарном лечении в кардиохирургическом отделении Краевой клинической больницы №1 с 08.04.2005 по 12.05.2005 с диагнозом: ИБС, стенокардия 2 функционального класса, постинфарктный кардиосклероз. Проведено обследование по предложенному способу. В тромбоцитах периферической крови больного определены активности реакций дегидрогеназ: ЛДГ=14373,42 мкЕ на 2×10 ⁵ тромбоцитов; НАДФ-ГДГ=0,00 мкЕ на 2×10 ⁵ тромбоцитов; НАДН-ГДГ=170,48 мкЕ на 2×10 ⁵ тромбоцитов; НАДФН-ГДГ=37,63 мкЕ на 2×10 ⁵ тромбоцитов. Рассчитаны значения ИОР, ИВН и ККОТ: ИОР=0,00; ИВН=0,01; ККОТ=0,0. Согласно изобретению ККОТ<0,3 свидетельствует об аспириночувствительности больного. При поступлении больного в стационар проведено исследование агрегации тромбоцитов с АДФ (5 мкМ): светопропускание составило 41%. Через 5 суток после начала лечения аспирином проведена агрегатометрия тромбоцитов с АДФ: светопропускание составило 27%. Следовательно, на фоне лечения аспирином произошло снижение агрегации тромбоцитов, что подтверждает чувствительность больного к аспирину.

Технический результат от реализации предложенного способа:

- возможность диагностики у больных ИБС до начала лечения аспирином;

- высокий уровень совпадения прогноза - 94,7%.

Таким образом, предложенный способ позволяет достоверно диагностировать аспиринорезистентность больных ИБС до начала терапии и может быть рекомендован для применения в клинической практике.

Источники информации

1. Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики. - Спб.: ФормаТ, 2006. - С.95.

2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

3. Савченко Е.А., Савченко А.А., Герасимчук А.Н., Грищенко Д.А. Оценка метаболического статуса тромбоцитов в норме и при ишемической болезни сердца//Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - №5. - С.33-36.

4. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови биолюминесцентным методом // Лаб. дело. - 1989. - №11. - С.23-25.

5. Савченко А.А. Биолюминесцентное определение активности НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдгидрогеназ лимфоцитов // Лаб.дело. - 1991. - №11. - С.22-25.