способ увеличения резерва стволовых клеток в организме
Классы МПК: | A61K38/47 действующие на гликозидные компоненты (32), например целлюлазы, лактазы A61P43/00 Лекарственные средства для специфических целей, не указанные в группах 1/00 |
Автор(ы): | Гольдберг Евгений Данилович (RU), Дыгай Александр Михайлович (RU), Зюзьков Глеб Николаевич (RU), Жданов Вадим Вадимович (RU), Мирошниченко Лариса Аркадьевна (RU), Симанина Елена Владиславна (RU), Ставрова Лариса Александровна (RU), Удут Елена Владимировна (RU), Хричкова Татьяна Юрьевна (RU), Ермакова Наталия Николаевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2007-06-25 публикация патента:
27.02.2009 |
Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям, и касается способа увеличения резерва стволовых клеток в организме. Для этого лабораторным животным (мышам) внутрибрюшинно вводят гиалуронидазу в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки, в течение 2 дней. Способ позволяет значительно увеличить резерв стволовых клеток в интактном организме животного. 1 табл.
(56) (продолжение):
CLASS="b560m" Mobilization and harvesting of peripheral blood stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 2006 May; 1(2): 189-201 (abstr). GOLDBERG E.D. et al. Role of hyaluronidase in the regulation of functions of mesenchymal precur.
Формула изобретения
Способ увеличения резерва стволовых клеток в организме, характеризующийся введением препарата, в качестве которого используют гиалуронидазу, которую вводят внутрибрюшинно в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям, и касается способа увеличения резерва стволовых клеток в организме.
Известны способы увеличения содержания в организме коммитированных клеток-предшественников гемопоэза с помощью факторов роста: эритропоэтина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, гранулоцитомакрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), интерлейкина-3 (ИЛ-3). Наиболее широким спектром действия и наиболее выраженным влиянием обладают раннедействующие факторы роста - ГМ-КСФ и ИЛ-3 [1, 2, 3]. В то же время их стимулирующее влияние ограничено гемопоэтическими предшественниками и не затрагивает популяцию истинных (мезенхимальных) стволовых клеток (СК), способных давать начало большинству известных клеточных типов (элементы соединительной, мышечной, нервной ткани, печени и др.) и являющихся «глубоким» резервом регенерации [4, 5]. В свете вышеизложенного чрезвычайно важное значение приобретает проблема создания способов увеличения в организме резерва истинных (мезенхимальных) стволовых клеток.
Предлагаемый способ увеличения резерва стволовых клеток в организме адекватного прототипа по широте воздействия на разные классы СК и терапевтической (фармакодинамической) сущности среди существующих способов не имеет.
Задачей, решаемой данным изобретением, является создание эффективного способа увеличения резерва стволовых клеток в организме.
Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой способ увеличения резерва стволовых клеток в организме, заключающийся во внутрибрюшинном введении лабораторным животным (мыши) препарата гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней.
Новым в предлагаемом изобретении является использование препарата гиалуронидазы, вводимого внутрибрюшинно в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней.
На сегодняшний день известна важная роль гиалуроновой кислоты (ГК) в регуляции функцонального состояния клеточных элементов (на примере фибробластов, макрофагов) [6, 7]. ГК является наиболее распространенным гликозаминогликаном (ГАГ), участвующим в образовании межклеточного матрикса различных тканей, в том числе и костного мозга, в котором она составляет около 40% от всех ГАГ [7]. При этом стволовые клетки и клетки-предшественники различных классов in situ связаны с гиалуронатом через CD44 и RHAMM-рецепторы [7, 8]. Вместе с тем известен фермент-гиалуронидаза, введение которого приводит к гидролитическому расщеплению ГК и образованию в организме ее полимеров с различной длиной полисахаридной цепи. При этом известно, что низко- и среднемолекулярные формы ГК стимулируют ангиогенез, пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток. В то время как молекулы ГК с высокой молекулярной массой, напротив, тормозят сосудообразование, ингибируют деление клеток и снижают их способность к миграции [6]. Тем не менее, роль гиалуронидазы в регуляции функций стволовых клеток до сих пор во многом остается не известна, так же как не известна и принципиальная возможность увеличения резерва стволовых клеток в организме путем введения гиалуронидазы извне.
Факт применения гиалуронидазы с достижением нового технического результата: создание эффективного способа увеличения резерва стволовых клеток в организме за счет изменения свойств межклеточного матрикса для специалиста является не очевидным.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют создать эффективный способ увеличения резерва стволовых клеток в организме. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом:
Лабораторному интактному животному (мыши) 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводят гиалуронидазу в дозе 1000 УЕ/кг.
Заявляемая доза и режим введения гиалуронидазы подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата. Повышение дозы и кратности введения отменяют получение заявленного технического результата. Снижение дозы и/или однократное введение препарата значительно снижают эффективность способа.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 98 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).
На 3, 5, 8-е сутки с помощью метода лимитирующих разведений определяли количество мезенхимальных (истинных) стволовых клеток (МСК) [9], а также методом клонирования в полувязкой среде изучали содержание гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) - гранулоцитарно-эритро-макрофагально-мегакариоцитарных единиц (КОЕ-ГЭММ) [10], коммитированных мезенхимальных, эритроидных и грануломоноцитарных клеток-предшественников в костном мозге [11], представляющим собой по современным представлениям депо СК [4, 5].
Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Частоту встречаемости МСК в костном мозге и периферической крови определяли с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных лимитирующих разведений одномерной модели Пуассона оценивалось посредством линейной log-log регрессии. При этом теоретическая фракция отрицательных лунок i распределялась как i=exp(-fxi), где f - частота встречаемости МСК, xi - количество клеток, высаженных в лунку [9, 12]. Использовалась программа Statistica 6.0.
Пример 1
Гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ), растворенную в 0,3 мл физиологического раствора, вводили интактным животным внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней в дозе 1000 УЕ/кг (УЕ - условные еденицы). Контрольным мышам в эквивалентном объеме внутрибрюшинно вводили физиологический раствор.
Введение интактным животным гиалуронидазы приводило к существенному возрастанию содержания всех исследуемых прогениторных элементов в костном мозге.
Так, количество МСК было повышенным на протяжении всего эксперимента и достигало максимальных значений на 5-е опыта (до 386,2% от контроля).
Динамика содержания КОЕ-ГЭММ в гемопоэтической ткани носила аналогичный характер. Имело место увеличение их числа на 3, 5, 8-е сут исследования, с максимумом на 8-е сутки (356,6% от фона).
Кроме того, расщепление ГК приводило к возрастанию числа комитированных кроветворных прекурсоров: КОЕ-Э (3, 5, 8-е сутки) и КОЕ-ГМ (3, 5, 8-е сутки) (с максимумом КОЕ-Э до 286,17% на 8-е и КОЕ-ГМ до 286,8% на 5-е сутки соответственно); а также мезенхимальных клеток-предшественников (фибробластных колониеобразующих едениц) в костном мозге на 3, 5-е сутки (табл.).
В целом, изменение свойств межклеточного матрикса с помощью гиалуронидазы приводило к выраженному возрастанию содержания стволовых клеток, причем в большей степени ранних родоначальных элементов - мезенхимальных и кроветворных стволовых клеток, в их депо - в костном мозге.
Предлагаемый способ позволяет значительно увеличить резерв стволовых клеток в организме путем введения гиалуронидазы.
Таблица Динамика содержания стволовых клеток и коммитированных клеток-предшественников гемопоэза в костном мозге мышей линии CBA/CaLac при введении гиалуронидазы, (Х±m) | |||||
Сроки исследования (сутки) | МСК, на 106 миелокариоцитов | КОЕ-Ф, на 250 тыс. миелокариоцитов | СКК (КОЕ-ГЭММ), на 105 миелокариоцитов | КОЕ-Э, на 105 миелокариоцитов | КОЕ-ГМ, на 105 миелокариоцитов |
фон | 29,0±3,01 | 7,67±0,51 | 7,74±0,69 | 6,0±0,7 | 5,17±0,98 |
3-е | 90,0±10* | 13,67±1,03* | 14,6±1,32* | 12,33±0,61* | 7,83±0,7* |
5-е | 112,0±12* | 18,0±1,2* | 16,5±0,74* | 16,0±1,63* | 14,83±1,19* |
8-е | 90,0±10* | 6,17±0,57 | 27,6±1,58* | 17,17±0,6* | 11,17±0,87* |
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при p<0,05 |
Источники информации
1. Metcalf D. Hemopoietic growth factors. 1. // The Lancet. - 1989. - Vol.15. - P.825-827.
2. Platzer E. Human hemopoietic growth factors // Eur. J. Haematol. - 1989. - V.42. - N1. - P.1-15.
3. Натан Д.Г., Зифф К.А. Регуляция кроветворения // Гематол. и трансфузиол.. - 1994. - Т.39. - №2. - С.3-10.
4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.
5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С.184-199.
6. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Glycobiology. - 2003. - Vol.13. - №12. - P.105-115.
7. Avigdor A., Goichberg P., Shivtiel S. e.a. CD44 and hyaluronic acid cooperate with SDF-1 in the trafficking of human CD34 + stem/progenitor cells to bone marrow // Blood. - 2004. - Vol.103. - №8. - P.2981-2989.
8. Nedvetzki S., Gonen E., Assayag N. e.a. RHAMM, a receptor for hyalu-ronan-mediated motility, compensates for CD44 in inflamed CD44-knockout mice: A different interpretation of redundancy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol.101. - №52. - P.18081-18086.
9. In't Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. e.a. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogenous multilineage differentiation potential // Haematologica. - 2003. - Vol.88. - P.845-852.
10. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск, 1999. - 114 с.
11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.
12. Bonnefoix Т., Bonnefoix P., Callanan M. e.a. Graphical representation of a generalized linear model-based statistical test estimating the fit of the single-hit poisson model to limiting dilution assays // J. Immunol. - 2001. - Vol.167. - P.5725-5730.
Класс A61K38/47 действующие на гликозидные компоненты (32), например целлюлазы, лактазы
Класс A61P43/00 Лекарственные средства для специфических целей, не указанные в группах 1/00