штамм а/курица/россия/22/07 вируса гриппа а птиц (pestis galinarum) подтипа h5n1 для производства биопрепаратов и контроля иммуногенности вакцины

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа А птиц, сем. Pestis Galinarum, подтип H5N1, депонированный в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ РАСХН под №2633, для получения вакцины.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой штамм А/курица/Россия/22/07 вируса гриппа А птиц подтипа H5N1, используемый в научных и производственных лабораториях и предприятиях биологической промышленности при конструировании биопрепаратов, в частности вакцин, против гриппа А птиц этого подтипа и контроля их иммуногенности, а также антигенов для диагностических наборов.

Возбудитель гриппа А птиц - РНК-содержащий вирус семейства Ortomixoviridae рода Influenzavirus размером 60-180 нм.

Вирус гриппа А птиц включает 15 подтипов по гемагглютинину и 9 подтипов по нейраминидазе. По классификации МЭБ грипп птиц (ГП) отнесен к группе А особо опасных болезней и широко распространен на всех континентах. Наиболее опасны вспышки гриппа, обусловленные пятым и седьмым подтипами вируса, которые вызывают заболеваемость - 70-100% и смертность - 50-70%.

В России в 2005 г. возбудитель гриппа А птиц был выявлен в 62 пунктах 8 регионов, пало 26844 голов, уничтожено 609250 голов птицы. В этот период были выделены и типированы изоляты вируса ГП подтипа H5N1.

Для профилактики ГП путем вакцинации применяют препараты, изготовленные из эпизоотических или референс штаммов.

Известен штамм вируса ГП подтипа H5N1 - А/БАК/Россия/05, предназначенный для разработки средств и методов биологической защиты. Этот штамм был выделен из биопроб, взятых от погибшей домашней птицы [1].

Типы гемагглютинина и нейраминидазы в различных сочетаниях определяют антигенную формулу вируса гриппа. Ведущая роль в проявлении инфекционности принадлежит гемагглютинину (Н). Большинство эпизоотических и референс штаммов вирусов ГП имеют низкие титры гемагглютинина, поэтому при производстве вакцин против гриппа птиц предусматривается очистка и концентрирование вируса с целью повышения титра гемагглютинина.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является эпизоотический штамм вируса гриппа А птиц подтипа H5N1 - А/курица/Курган/01/05 (прототип), используемый для изготовления эмбриональной вакцины против гриппа А птиц, которую применяют в целях профилактики однократно внутримышечно. Вирус гриппа А птиц для изготовления указанной вакцины получают на куриных эмбрионах. Недостатком данного штамма является то, что он имеет низкий титр гемагглютинина - 1/32-1/64, вследствие чего необходимо проведение трудоемких операций концентрирования и очистки вируса при изготовлении вакцинных и диагностичесчких препаратов [2].

Целью настоящего изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А птиц подтипа H5N1, обладающего высокой гемагглютинирующей активностью и обеспечивающего изготовление инактивированной вакцины без проведения концентрирования вируса, контроля иммуногенности вакцины и изготовление антигена для диагностических наборов.

Поставленная цель достигается тем, что использован штамм вируса гриппа А птиц подтипа H5N1 - А/курица/Курган/01/05, обладающий высокой биологической, антигенной активностью.

Штамм выделен на птицефабрике «Утятская» Курганской обл. Инфекционный титр вируса - 9,5±0,25 lg ЭЛД 50/см³ , 8,5±0,25 lg ЛД 50/см³, гемагглютинирующий титр - 1:16-1:32.

Для получения штамма с повышенной гемагглютинирующей активностью вируса используют пассирование его на куриных эмбрионах (КЭ). КЭ заражают вирусом с инфекционной активностью 6,0-8,0 lg ЭЛД 50/см³ по 0,1 см ³ на эмбрион. Инкубируют КЭ при 37,0±0,5°С и влажности 60-70% в течение 36-48 часов, затем охлаждают при температуре 2,0-4,0°С. Отбирают аллантоисную жидкость и определяют инфекционную активность и гемаггютинирующий титр вируса. Аллантоисную жидкость с максимальным титром используют для очередного пассажа. Титр гемагглютинина повышается с 8-го пассажа, в 19-21 пассаже он составляет 1:1024-1:2048, инфекционная активность - 9,75±0,25 lg ЭЛД 50/см³.

Полученному штамму присвоено наименование - штамм А/курица/Россия/22/07 вируса гриппа А птиц подтипа H5N1.

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ РАСХН под №2633 27.03.2007 г.

Штамм А/курица/Россия/22/07 вируса гриппа А птиц подтипа H5N1 используется для производства инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа А птиц подтипа H5N1. Средний титр антигемагглютининов у вакцинированной птицы уже на 10 день составляет 1:130, что на 11-18 суток сокращает срок наступления иммунитета.

Инактивированный антиген этого вируса с активностью 1:512-1:1024 используется в реакции задержки гемагглютинации для выявления специфических антител к вирусу ГП в сыворотках крови птиц.

Штамм А/курица/Россия/22/07 вируса гриппа А птиц подтипа H5N1 (производственный) характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки.

При электронно-микроскопическом исследовании вирионы штамма А/курица/Россия/22/07 имеют типичные для ортомиксовирусов сферические и филаментозные формы размером от 80 до 120 нм.

Культуральные признаки.

Вирус хорошо размножается в 10-11-дневных КЭ при заражении в аллантоисную или амниотическую полость. Инкубирование КЭ проводится при 37°С и 70% влажности. Вирус вызывает гибель куриных эмбрионов через 26-40 часов. Инфекционная активность штамма А/курица/Россия/22/07 составляет 9,75±0,25 lg ЭЛД 50/см³, гемагглютинирующий титр - 1/1024-1/2048.

Штамм А/курица/Россия/22/07 вируса ГП хорошо размножается в культуре клеток куриных фибробластов (КФ), инфекционная активность через 48-72 часа инкубирования при 37°С - 5,5-6,5 lg ТЦД 50/см³, а гемагглютинирующий титр - 1:16-1:32.

Подтиповая принадлежность штамма А/курица/Россия/22/07 вируса гриппа А птиц определена с помощью реакции задержки гемагглютинации со специфическими сыворотками к вирусу гриппа птиц, ньюкаслской болезни и ССЯ-76 по общепринятой методике, а так же твердофазным иммуноферментным анализом (ТФ ИФА) с использованием моноклональных антител (МАт) к рибонуклеопротеиду (РНП) вирусов НБ и ГП. В ТФ ИФА реакция положительная с МАт к РНП вируса ГП. В результате типирования штамм А/курица/Россия/22/07 отнесен к гриппу птиц А.

Определение подтипа вируса по гемагглютинину проводили с использованием «Набора антигенов и сывороток для лабораторной диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)» (ТУ 9388-004-70952707-04) производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов». Установлена принадлежность штамма А/курица/Россия/22/07 к вирусу гриппа А птиц подтипа Н5.

Инфекционную активность штамма А/курица/Россия/22/07 для 10-11-дневных КЭ определяли путем заражения в аллантоисную полость по 0,1 см ³ ЭЭЖ в разведениях с 10^-4 по 10 ^-9 по 4 КЭ на каждое разведение в двух повторностях. Инкубирование КЭ проводили при 37°С, овоскопировали через каждые 24 часа. Инфекционная активность штамма А/курица/Россия/22/07 составила 9,75±0,25 lg ЭЛД 50/см³, гемагглютинирующий титр - 1/1024-1/2048 (табл.).

Характеристика некоторых биологических свойств вируса гриппа А птиц подтипа H5N1.
Штамм вируса гриппа птиц	Инфекционная активность		Гемагглютинирующая активность
	lg ЭЛД 50/см 3	lg ЛД 50/см3
А/курица/Курган/01/05 (прототип)	9,50±0,25	8,50±0,25	1:16-1:32
Штамм А/курица/Россия/22/07	9,75±0,25	8,75±0,25	1:1024-1:2048

Сохраняемость и условия хранения.

Штамм А/курица/Россия/22/07 хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40°С.

Инактивированная эмульгированная вакцина, изготовленная из штамма А/курица/Россия/22/07 вируса гриппа А птиц подтипа H5N1 обладает высокой антигенностью и иммуногенностью. Средний титр антител в сыворотках крови иммунизированных цыплят на 10 сутки составляют 1:128, а на 21 сутки - 1:1024. Контрольное заражение вакцинированных цыплят вирулентным штаммом вируса гриппа А птиц подтипа H5N1 не вызывает клинических признаков заболевания, а выживаемость составляет более 90%.

Контроль стерильности штамма А/курица/Россия/22/07 проверен на бактериальных средах: МПА, МПБ, Сабуро и тиогликолевом бульоне. Рост бактериальной и грибковой микрофлоры при наблюдении в течение 10 дней - отсутствовал.

Источники информации

1. Заявка №2005129200, опубл. 27.03.2007, C12N 7/00, Марков В.И., Меркулов В.А., Лыков М.В. и др.

2. «Инструкция по изготовлению и контролю инактивированной жидкой и сухой вакцины против гриппа птиц», утвержденная ГУВ МСХ СССР 14 июля 1978 г.