амид октапептида, обладающий способностью повышать артериальное давление и частоту сердечных сокращений

Формула изобретения

Пептид H-Phe-Nle-Phe-Gln-Gly-Gln-Arg-Phe-NH ₂ и его фармацевтически приемлемые соли.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к биологически активным пептидам, способным повышать артериальное давление (АД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Известен ряд соединений, вызывающих при внутривенном введении повышение АД. К ним относятся адреналин [1], норадреналин [2], дофамин [3], ренин [4], ангиотензин [5], вазопрессин [6]. Все эти препараты действуют через свои специфические рецепторы. При этом у них могут быть побочные эффекты (сердцебиения, стенокардии, аритмии, инсульты). В условиях блокады рецепторов действие этих препаратов сильно ослабляется или вообще не проявляется. По этой причине необходимость поиска новых гипертензивных препаратов без побочных эффектов, которые оказывают свое действие даже при блокаде известных рецепторов, не вызывает сомнения.

Известен также нейропептид FF (H-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH ₂), являющийся членом пептидной группы RF-амидов, локализованный главным образом в головном мозге, где его рассматривают в качестве модулятора действия морфина [7]. Внутривенное введение нейропептида FF кратковременно повышало АД и ЧСС [8-12], при этом одновременно в несколько раз возрастали концентрации норадреналина и адреналина в крови [12], что позволило предполагать реализацию эффекта через высвобождение симпатических медиаторов. Такой механизм может реализовываться в организме при коллапсе, шоке и служить одним из важных способов нормализации АД. Таким образом, нейропептид FF может быть средством для выведения из состояний, но использование данного пептида как гипертензивного средства мало вероятно вследствие его кратковременного действия, длящегося лишь 20-30 с, а также умеренной степени повышения АД - на 20-30 мм рт.ст. [12].

В связи с этим задачей предлагаемого изобретения являлся поиск такого пептида, который бы обладал более выраженным и длительным действием в отношении повышения АД и ЧСС по сравнению с природным нейропептидом FF. Актуальность этой задачи продиктована необходимостью обеспечения практической медицины эффективными препаратами гипертензивного действия.

Поставленная задача решается путем синтеза амида октапептида формулы

или его фармацевтически приемлемых солей.

Поскольку в ряду пептидных аналогов не существует четкой взаимосвязи структура - активность, модификация структуры эндогенного нейропептида FF не является очевидной.

Заявляемый пептид получали твердофазным методом пептидного синтеза с использованием Fmoc-технологии, описанным ниже в примере.

Пример. Синтез заявляемого пептида

Список сокращений:

АсОН - уксусная кислота;

DIC - N,N^'-диизопропилкарбодиимид;

DCM - дихлорметан;

DMF - N,N-диметилформамид;

DMSO - d6 - дейтерированный диметилсульфоксид;

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил;

HOBT - 1-гидроксибензотриазол;

NMP - N-метилпирролидон;

NMM - N-метилморфолин;

Pip - пиперидин;

Pmc - 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил;

Trt - тритил;

TIBS -триизобутилсилан;

TFA - трифторуксусная кислота;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография.

Для получения заявляемого амида октапептида использовали производные L-аминокислот фирмы Bachem (Швейцария), DIC, NMP, TFA фирмы Fluka (Швейцария). DMF очищали перегонкой над нингидрином и окисью бария. Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе фирмы Gilson (Франция), использовали колонку Ultropac TSK ODS-120T, 5 мкм (4,6×250 мм) Beckman (США), в качестве элюентов использовали буфер А - 0,05 М КН₂РО₄ , рН 3.0, буфер Б - 70% ацетонитрила в буфере А, элюция градиентом концентрации от 20% до 80% буфера Б в буфере А за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин, детекция при 220 нм. Аминокислотный анализ пептидов, гидролизованных 6 н. соляной кислотой, содержащей 2% фенола, при 110°С в течение 24 ч, проводили на приборе Biotronik LC 5001 (ФРГ). ¹Н-ЯМР-спектры снимали на спектрометре WH-500 Bruker 500 МГц (ФРГ) в DMSO-d при 300 K, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл. Химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана. Масс-спектры регистрировали на приборе PC-Kompact MALDI (Kratos, Англия).

Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с 4-(2,4-диметокфенил)-Fmoc-аминометилфенокси - якорной группой (Rink-amide-полимер) фирмы Nova BioChem, Швейцария, предназначенный для получения амидов пептидов, содержащий 0.56 ммоль/г аминогрупп. Синтез амида октапептида проводили исходя из 0.45 г (0.25 ммоль) Rink-amide-полимера в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 431 А по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот.

Протокол твердофазного синтеза
№	Операция	Реагент	Время обработки
1	Промывка	5×NMP	3 мин
2	Деблокирование -аминогрупп	20% Pip/NMP	10 мин
3	Промывка	5×NMP	3 мин
	Активация	1 ммоль Fmoc-аминокислоты+1 ммоль HOBt+1 ммоль DIC в NMP	20 мин
6	Конденсация	1 ммоль активированного производного Fmoc-аминокислоты в NMP	90 мин
7	Промывка	5×NMP	3 мин

Заключительное деблокирование и отщепление октапептида от полимера проводили в 1 стадию путем обработки соответствующего октапептидилполимера смесью 10 мл TFA, 0.25 мл Н₂О и 0.25 мл TIBS в течение 1 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получали 0,25 г сырого продукта I, содержащего по данным ВЭЖХ 89% целевого пептида.

После этого проводили очистку пептида с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Beckman (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (2.5×250 мм), размер частиц сорбента 10 мкм. В качестве элюентов использовали буфер А - 0,01 М раствор ацетата аммония и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 220 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и лиофилизовали. В итоге получили 0.19 г (60% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) амида октапептида.

Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 98%.

Аминокислотный состав: Glx 2.12 (2), Gly 1.00 (1), Phe 3.02 (3), Arg 1.00 (1), Nle не определяли.

¹Н-ЯМР (DMSO-d₆ , , м.д). В спектре присутствуют сигналы (м.д.):

1) фенилаланина - 8.03 (NH₂, 2Н), 4.04 ( -СН, 1Н), 2.99, 2.83 ( -СН₂, 2Н);

2) норлейцина - 8.51 (NH, 1H), 4.3 ( -СН, 1Н), 1.47 ( -СН₂, 2Н);

3) фенилаланина - 8.21 (NH, 1H), 4.58 ( -СН, 1Н), 3.06, 2.80 ( -СН₂, 2Н);

4) глутамина - 8.23 (NH, 1Н), 4.23 ( -СН, 1Н), 1.88, 1.78 ( -СН₁, 2Н); 2.11 ( -СН₂,2Н);

5) глицина - 8.11 (NH, 1Н), 3.76, 3.69 ( -СН₂,2Н);

6) глутамина - 7.99 (NH, 1H), 4.25 ( -СН, 1Н), 1.86, 1.78 ( -CH₂, 2Н), 2.11 ( -СН₂, 2Н);

7) аргинина - 8.08 (NH, 1Н), 4.20 ( -СН, 1Н), 1.60, 1.48 ( -СН, 2Н);

8) фенилаланина - 7.85 (NH, 1H), 4.45 ( -СН, 1Н), 3.00, 2.83 ( -СН₂, 2Н), а также 7.43, 6.84 (CONH ₂).

Масс-спектр, m/z: 1041.9 [М+Н] ⁺ брутто-формула: С₅₁, Н ₇₂ N₁₄О₁₀, вычислено 1041.2.

Изучение действия заявляемого амида октапептида на параметры гемодинамики бодрствующих животных.

Изучение действия заявляемого амида октапептида на параметры гемодинамики проводили на бодрствующих самцах крыс линии Wistar весом 300-350 г, которым за сутки до опыта вживляли катетеры в сонную артерию и яремную вену под кетаминовым наркозом (100 мг/кг). После присоединения артериального катетера к электроманометру Gould Statham Р23 Db (США) регистрировали среднее артериальное давление (АД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) в спокойном состоянии животного на полиграфе Gould Brush 2400S (США). В качестве препарата сравнения применяли нейропептид FF. Оба пептида вводили в яремную вену в 0,5 мл физиологического раствора.

Введение нейропептида FF бодрствующим крысам оказывало немедленный эффект, выражавшийся в повышении артериального давления и частоты сокращений сердца. Пик эффекта достигался через 10-15 сек, а стабилизация до исходного уровня в зависимости от дозы занимала 40-60 сек. Эффект мог быть воспроизведен повторно на том же животном. Минимальная дозировка, при которой наблюдался отчетливый эффект, составляла 0,1 мг/кг. Практически максимальный эффект достигался при введении 0,4 мг/кг (фиг.1 и табл.1), при этом частота сокращений возрастала на 12%.

Введение заявляемого пептида бодрствующим крысам оказывало подобный, но более выраженный эффект (фиг.2 и табл.2). Отчетливый подъем АД наблюдали уже после введения 0,01 мг/кг, а практически максимальный эффект - после введения 0,3 мг/кг. При этом частота сокращений возрастала на 36%. Результаты представлены в табл. 1 и 2, а также на фиг. 1 и 2.

Таблица 1 Зависимость среднего артериального давления (мм рт.ст.) и сокращений сердца (мин -1) у бодрствующих крыс от дозы нейропептида FF (M±SEM)
Доза FF (мг/кг)	0	0.1	0.2	0.4	0.6	0.8	1	1.2
Число опытов	11	6	5	4	4	4	9	4
САД (мм рт.ст.)	118	127	129	143	151	151	155	158
М	3	3	6	4	10	9	7	1
ЧСС/с	348	366	366	384	384		390
М	5	6	1,1	13	12		6

Таблица 2 Зависимость среднего артериального давления (мм рт.ст.) и частоты сокращений сердца (мин-1) у бодрствующих крыс от дозы заявляемого амида октапептида (M±SEM)
Доза FF (мг/кг)	0	0.01	0.03	0.05	0.1	0.3	0,5	0,7	1
Число опытов	8	8	4	7	7	8	8	8	7
САД (мм рт.ст.)	105	117	125	129	145	155	157	156	158
М	2	2	3	2	3	2	4	4	5
ЧСС (мин -1)	336	366	391	399	421	442	456	456	452
М	11	12	4	4	17	12	9	15	15

Таким образом, заявляемый пептид оказывает на АД и ЧСС бодрствующих крыс эффект, аналогичный вызываемому нейропентндом FF, но отличается повышенным относительным приростом и АД и ЧСС. При этом действие заявляемого пептида начинается при дозировках, почти на порядок ниже, чем дозировки нейропептида FF.

Заявляемый пептид нетоксичен, поскольку является аналогом эндогенного нейропептида FF и состоит из остатков природных аминокислот, которые обычно присутствуют в организме, и остатка норлейцина, которым заменяют обычно остаток метионина при создании пептидных лекарственных препаратов.