способ метки мононуклеарных клеток красного костного мозга с помощью ^99mтс-эксаметазима

Формула изобретения

Способ мечения мононуклеарных клеток красного костного мозга при помощи ^99mТс-эксаметазима, характеризующийся получением клеточной суспензии, инкубации клеточной суспензии с 4 мл ^99mТс-эксаметазима в течение 10 мин при комнатной температуре, с последующей отмывкой, центрифугированием 5 мин при 150g, сбором надосадка, ресуспензированием осадка, содержащего меченные ^99mТс-эксаметазимом мононуклеарные клетки красного костного мозга, при этом инкубирование проводят с 1500-2000 мБк ^99mТс-эксаметазима, отмывку проводят 10 мл изотонического раствора натрия хлорида, а ресуспензирование в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к радионуклидной диагностике, и может найти применение в кардиологии и кардиохирургии.

Известен способ мечения лейкоцитов крови ^99m Tc-эксаметазимом, заключающийся в том, что у пациента забирают 50-100 мл крови, методом центрифугирования выделяют клеточную суспензию, затем 10 мин инкубируют клеточную суспензию с 4 мл 500-1000 мБк ^99mTc-эксаметазима, после чего добавляют 10 мл бесклеточной плазмы, центрифугируют при 150g в течение 5 мин, удаляют надосадок, а лейкоциты, находящиеся в осадке ресуспензируют 3 мл бесклеточной плазмы и вводят пациенту внутривенно [1].

Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.

Данный способ не позволяет проводить метку мононуклеарных клеток красного костного мозга ^99mTc-эксаметазимом и оценивать их распределение в организме.

Задачей изобретения является разработка способа метки мононуклеарных клеток красного костного мозга ^99mTc-эксаметазимом, которая дает возможность оценивать их распределение в организме пациента после инфузии (внутривенной, внутрикронарной).

Поставленная задача решается техническим решением, представляющим собой способ метки мононуклеарных клеток красного костного мозга ^99mTc-эксаметазимом, включающий забор 100-120 мл костного мозга с последующим выделением мононуклеарных клеток костного мозга методом градиентного центрифугирования. Затем 30-50 млн мононуклеарных клеток красного костного мозга ресуспензируют в 4 мл изотонического раствора натрия хлорида, смешивают с 1500-2500 мБк ^99mTc-эксаметазима и инкубируют при комнатной температуре 10 мин. По истечении срока инкубации процесс мечения останавливают добавлением в пробирку с клеточной суспензией 10 мл изотонического раствора натрия хлорида и центрифугируют в течение 5 мин при 150 g. По окончании центрифугирования надосадок, содержащий несвязанный с мононуклеарными клетками костного мозга ^99mTc-эксаметазим, убирают, а осадок, содержащий меченные ^99mTc-эксаметазимом мононуклеарные клетки красного костного мозга, ресуспензируют в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида и измеряют их активность.

Новым в предлагаемом способе является использование ^99mTc-эксаметазима в дозе 1500-2500 мБк, а также использование изотонического раствора натрия хлорида для отмывки и ресуспензирования меченых ^99m Tc-эксаметазимом мононуклеарных клеток красного костного мозга.

На сегодняшний день известно, что все специализированные клетки взрослого организма происходят из плюрипотентных (стволовых) клеток. Своевременное обновление пула здоровых клеток является незаменимым условием здоровья и долголетия многоклеточного организма. Именно поэтому, клеточная терапия рассматривается в качестве одного из перспективных направлений в медицине и других смежных областях биологической и медицинской науки.

Названный вид лечения может обеспечить восстановление высокодифференцированных тканей (нервная, хрящевая, мышечная и т.д.) с помощью имплантации дифференцированных плюрипотентных клеток после повреждения органа или патологии (например, при ишемической болезни, патологиях нервной системы, сахарном диабете и др.).

В последние годы клеточная терапия все больше привлекает внимание кардиохирургов и кардиологов в качестве метода альтернативного лечения сердечно-сосудистых заболеваний, которые, как известно, являются основной причиной инвалидизации и смертности населения. Особое место в ряду данных заболеваний занимает инфаркт миокарда, являющийся первостепенным фактором в развитии сердечной недостаточности (СН).

Развитие биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии сделало клетку не только главным объектом воздействий, но и средством лечения многих заболеваний. Клеточную терапию в кардиологии клинически стали серьезно использовать лишь в последние пять лет. Поводом для начала этой большой работы послужили экспериментальные работы D.Orlic с соавт.(2001 г.) [2], S.Tomita с соавт.(2002 г.) [3], где авторы показали, что клетки костного мозга способствовали регенерации зон инфаркта миокарда и улучшению функциональной работы сердца у выживших животных.

Наиболее востребованным и изучаемым видом клеток среди клиницистов, в настоящее время, являются мононуклеарные клетки костного мозга. Это обусловлено не только тем, что среди них содержится до 2% гемопоэтических и до 0,05% мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [4], но и возможностью использовать их для аутотрансплантации.

В то же время известно, что как бы не была совершенна искусственно созданная экспериментальная модель на животных, она далеко не всегда может отразить все нюансы клинического течения заболевания.

На сегодняшний день особенно часто дискутируется вопрос о том, как ведут себя клетки после доставки в миокард и в каком количестве фиксируются в миокарде. Для того чтобы ответить на этот вопрос, нужно рационально использовать методы радионуклидной индикации, которые дают возможность пометить мононуклеарные клетки костного мозга изотопами и, в дальнейшем, оценить распределение мононуклеарных клеток костного в организме и степень их накопления в сердце.

Предлагаемый способ по сравнению с известными ранее имеет ряд преимуществ, основные из которых следующие: метод позволяет метить мононуклеарные клетки красного костного мозга, а также за счет использования изотонического раствора натрия хлорида дает возможность избежать забора дополнительного количества крови с целью получения бесклеточной плазмы для отмывки клеток.

Новые признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня технически в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков в известных технических решениях не обнаружено.

Изобретение будет понятно из следующего описания и чертежа.

На чертеже представлены сцинтиграммы грудной клетки пациента, перенесшего острый инфаркт миокарда: а) - через 30 мин, б) - через 2,5 ч, в) - через 24 ч после интракоронарного введения меченных ^99mТс-эксаметазимом мононуклеарных клеток красного костного мозга.

Способ осуществляется следующим образом: первоначально выполняют забор 100-120 мл красного костного мозга с последующим выделением взвеси мононуклеарных клеток красного костного мозга методом градиентного центрифугирования. Затем 30-50 млн мононулкеарных клеток ресуспензируют в 4 мл изотонического раствора натрия хлорида, смешивают с 1500-2500 мБк ^99mТс-эксаметазима и инкубируют при комнатной температуре 10 мин. По истечении срока инкубации процесс мечения останавливают добавлением в пробирку с мононуклеарными клетками 10 мл изотонического раствора натрия хлорида и центрифугируют 5 мин при 150 g. По окончании центрифугирования надосадок, содержащий несвязанный с мононуклеарными клетками красного костного мозга ^99mТс-эксаметазим убирают, а осадок, содержащий меченные ^99m Тс-эксаметазимом клетки, ресуспензируют в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида и измеряют его активность.

Для того чтобы оценить жизнеспособность меченых указанным способом мононуклеарных клеток красного костного мозга в сравнении с немечеными, мы использовали витальный краситель трепановый синий. По результатам этого исследования значение жизнеспособности в обеих группах составило в среднем 96±4%, при этом достоверных различий выявлено не было.

Сцинтиграфическую индикацию распределения меченых мононуклеаров в организме пациента проводят в планарном или томографическом режиме в течение 24 ч после их введения, поскольку период полураспада ^99mTc составляет 6 ч.

Необходимо отметить, что в соответствии с нормальным распределением ^99mТс-эксаметазим, использованный нами для метки мононуклеарных клеток красного костного мозга, в сердце не накапливается, а неспецифическая, обусловленная обратным выходом ^99mТс-эксаметазима из клеток, аккумуляция радиофармпрепарата в миокарде исключается [5].

Новые существенные признаки позволяют пометить мононуклеарные клетки красного костного мозга ^99mТс-эксаметазимом, определить характер распределения мононуклеарных клеток костного мозга в организме, в том числе оценить степень их фиксации в миокарде после инфузии пациенту.

Клинический пример

Больной Б., 52 г., находился на лечении в клиниках ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН с основным диагнозом ИБС: стенокардия напряжения IV функциональный класс, постинфарктный кардиосклероз, стенозирующий атеросклероз коронарных артерий.

В ходе обследования и наблюдения пациента было принято решение о проведении терапии аутологичными мононуклеарными клетками красного костного мозга. Для этого больному была выполнена пункция гребня повздошной кости, проведен забор 100-120 мл красного костного мозга с последующим выделением взвеси мононуклеарных клеток красного костного мозга методом градиентного центрифугирования. Общее количество выделенных клеток составило 30 млн. Клетки ресуспензировали в 4 мл изотонического раствора натрия хлорида, смешали с 1500 мБк ^99mТс-эксаметазима и инкубировали при комнатной температуре 10 мин. По истечении срока инкубации процесс мечения остановили добавлением в пробирку с мононуклеарными клетками 10 мл изотонического раствора натрия хлорида и центрифугировали 5 мин при 150 g. По окончании центрифугирования надосадок, содержащий несвязанный с мононуклеарными клетками красного костного мозга ^99mТс-эксаметазим, убрали, а осадок, содержащий меченные ^99mТс-эксаметазимом клетки, ресуспензировали в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида. Активность меченных ^99mТс-эксаметазимом мононкулеарных клеток костного мозга составила 250 мБк, а эффективность мечения - 14%.

Пациенту была проведена ангиография, во время которой в переднюю нисходящую коронарную артерию были введены 30 млн мононуклеарных клеток красного костного мозга, меченых ^99m Тс-эксаметазимом в 10 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Регистрацию распределения меченых ^99m Тс-эксаметазимом клеток проводили через 30 мин, 2,5 ч и 24 ч после интракоронаного введения на гамма-камере ГКС-301Т (Россия).

Как видно на чертеже (а, б, в), после инфузии мононуклеарные клетки красного костного мозга аккумулируются преимущественно в печени, селезенке, а также фиксируются в сердце. При обработке сцинтиграммы строились зоны интереса, соответствующие всему телу, легким, печени, селезенке и сердцу, с последующим определением скорости счета импульсов в каждой зоне интереса. Затем проводился перерасчет скорости счета импульсов в каждом органе в проценты по отношению ко всему телу. По результатам расчетов через 30 мин после введения (чертеж а) в сердце зафиксировалось 4,1%, в печени - 28,6%, в селезенке - 7,2%, в легких - 14,6% от общей активности введенных мононуклеарных клеток красного костного мозга, меченных ^99mТс-эксаметазимом. Через 2,5 ч после введения (чертеж б) в сердце зафиксировалось 3,2%, в печени - 26,7%, в селезенке - 14,8%, в легких - 7,2% от общей активности. Через 24 ч после введения в сердце зафиксировалось 3,2%, в печени - 26,7%, в селезенке - 14,8%, в легких - 7,2% от общей активности. Через 24 ч после введения в сердце зафиксировалось 2,3%, в печени - 23,6%, в селезенке - 8,3%, в легких - 5,4% от общей активности.

Предлагаемый способ применен у 10 пациентов с ишемической болезнью сердца и позволяет эффективно пометить мононуклеарные клетки красного костного мозга ^99mTc-эксаметазимом и оценить их распределение в организме пациента после инфузии.

Используемая литература

1. Peters A.M., Danpure H.J., Osman S., et al. Preliminary clinical experience with ^99mTc-hexamethylpropylene-amineoxime for labelling leucocytes and imaging infection. // Lancet. - 1986. V.1. - P.945-949.

2. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., et al. Bone marrow cells regenerate infracted myocardium. // Nature. - 2001. V.410. - P.701-705.

3. Tomita S., Mickle D.A., Weisel R.V. et al. Improved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine marrow stromal cell transplantation. // J. Thorac cardiovasc surg. - 2002. V.123. - P.1132-1135.

4. Гольдберг Е.Д. Справочник по гематологии Томск: Изд-во Томского гос. университета. 1989. С.370.

5. Neirinckx R.D., Burke J.F., Harrison R.C., et al. The retention mechanism of technetium-99m HMPAO: intracellular reaction with glutathione. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1988. V8. S4 (Suppl).

6. McAfee J.G., Subramanian G., Gagne G. // Technique of leukocyte harvesting and labeling: problems and perspectives. 1984. V 14(2). P.83-106.