способ получения хелперных фракций нейтрофилокинов, синтезированных нейтрофилами перитонеального экссудата экспериментальных животных под влиянием клеток вакцинного штамма чумного микроба

Формула изобретения

1. Способ получения хелперных фракций нейтрофилокинов, отличающийся тем, что первоначально выделяют нейтрофилы перитонеального экссудата экспериментальных животных, которые синтезируют под влиянием микробных клеток Yersinia pestis EV-76 общий пул нейтрофилокинов и из последнего выделяют фракции нейтрофилокинов путем осаживания сульфатом аммония до 80% насыщения в течение 10-12 ч при 4°С, полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин, затем выделяют фракции посредством гель-хромотографии, после этого в реакции фагоцитоза выявляют хелперные фракции нейтрофилокинов, для этого к 1,0 мл предварительно выделенных макрофагов перитонеального экссудата животных добавляют 0,1 мл вакцинного штамма чумного микроба из расчета 25 микробных клеток на один макрофаг и 0,1 мл фракций нейтрофилокинов, содержащих 5-10 мкг белка, при этом полученную суспензию перемешивают и подслаивают под покровные стекла, которые инкубируют, промывают, высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза, причем окрашенные опытные образцы (с внесением фракции нейтрофилокинов) и контрольные (без фракций) просматривают под микроскопом и осуществляют подсчет процента активных фагоцитов (ПАФ) и индекса завершенности фагоцитоза (ИЗФ), в результате выделяют фракции [ИЗФ составляет (+0,15±0,005)-(+0,68±0,04)] и определяют их как хелперные.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что синтез под влиянием микробных клеток Yersinia pestis EV-76 осуществляют при 37°С в атмосфере 5% СО в течение 4 ч с последующим центрифугированием культуральных жидкостей при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим фильтрованием через мембранные фильтры диаметром под 0,22 мкм.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что воздействие хелперной фракции нейтрофилокинов на лизосомные мембраны макрофагов снижает число лизосомных гранул в одной клетке до 2,63±0,04 (контроль 2,92±0,04), одновременно не влияя на процент клеток, содержащих лизосомы 94±1,8% (контроль 95±1,8), что имеет положительное значение, так как приводит к лабилизации лизосомных мембран и слиянию лизосом с фагосомами, подтверждая этим активацию обменных процессов в клетке и усиление специфической активности иммунокомпетентных клеток.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при введении животным хелперной фракции, полученной при стимуляции нейтрофилов микробными клетками чумного штамма, наблюдают увеличение индекса перераспределения субпопуляций (ИПС) в сравнении с хелперной фракцией нейтрофилокинов, индуцированной микросферами латекса, в первом случае ИПС=21, а в последнем ИПС=7,0, при этом перераспределение субпопуляций макрофагов под влиянием хелперных фракций нейтрофилокинов идет в сторону количественного увеличения субпопуляций D, наиболее значимой при формировании противочумного иммунитета.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в иммунологии для выделения хелперных фракций нейтрофилокинов, обладающих иммунорегуляторной активностью, а также для коррекции иммунопатологических реакций при экспериментальной чуме.

Изучение механизмов цитокиновой регуляции системы фагоцитоза в процессе формирования специфического иммунитета вызывает особый интерес, так как иммунофагоцитарная система является не только центральным звеном неспецифической защиты от инфекционных заболеваний, но и иммунорегуляторной системой, направленной на стабилизацию внутренней среды организма.

Известен способ влияния секреторных продуктов нейтрофилов, активированных латексом, на некоторые функции моноцитов (см. И.И.Долгушин, А.В.Зурочка, С.И.Марачев «Влияние активированных и интактных нейтрофилов на функции моноцитов периферической крови». Иммунология, 1986 г., №2, стр.79-80), заключающийся в том, что супернатанты, содержащие секреторные продукты, получали от активированных нейтрофилов (Нф) после их контакта с латексом, используемым в качестве индуктора, и изучали регуляторную способность этих секреторных продуктов Нф в отношении моноцитов периферической крови.

Однако, несмотря на то, что нейтрофилы стимулировали синтетическим латексом и полученные супернатанты повышали функциональную активность моноцитов, эти секреторные продукты Нф не могут быть использованы для усиления активности иммунокомпетентных клеток в процессе формирования специфического иммунитета к возбудителям особо опасных инфекций, в том числе и к чумному микробу.

За прототип выбран способ регуляции формирования противочумного иммунитета с помощью нейтрофилокинов, индуцированных Yersinia pestis EV, предложенный ранее авторами (см. Г.И.Васильева, И.А.Иванова, А.К.Киселева, Е.П.Дорошенко, И.А.Беспалова «Влияние нейтрофилокинов на функциональную активность макрофагов в процессе формирования противочумного иммунитета». Биотехнология, №2, 2004 г., стр.47-53), заключающийся в том, что выделяют Нф перитонеального экссудата, которые обрабатывают микробными клетками 2-суточной культуры Yersinia pestis EV и получают супернатант (СН), содержащий комплекс нейтрофилокинов, среди которых были идентифицированы посредством моноклональных антител цитокины ИЛ-1, ФНО- и ИЛ-6, полученные нейтрофилокины оценивают по их способности модулировать фагоцитарную активность Мф, выделенных из перитонеального экссудата животных.

Недостатком прототипа является то, что с его помощью возможно получение комплекса нейтрофилокинов (суммарный пул белков), которые как усиливают отдельные функции иммунокомпетентных клеток, так и угнетают их. Это обстоятельство снижает возможность использования известного способа для усиления специфической защиты от инфекционных заболеваний. Поэтому перед разработчиками стояла задача выделения отдельных фракций нейтрофилокинов с разной регуляторной способностью в отношении иммунокомпетентных клеток.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в повышении специфического иммунитета при инфекционных заболеваниях путем стимулирования функциональной активности иммунокомпетентных клеток посредством хелперных фракций нейтрофилокинов.

Техническая сущность заявленного способа состоит в том, что первоначально выделяют нейтрофилы перитонеального экссудата экспериментальных животных, которые синтезируют под влиянием микробных клеток Yersinia pestis EV-76 общий пул нейтрофилокинов и из последнего выделяют фракции нейтрофилокинов путем осаживания сульфатом аммония до 80% насыщения в течение 10-12 часов при 4°С, полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин, затем выделяют фракции посредством гель-хроматографии, после этого в реакции фагоцитоза выявляют хелперные фракции нейтрофилокинов, для этого к 1,0 мл предварительно выделенных макрофагов перитонеального экссудата животных добавляют 0,1 мл вакцинного штамма чумного микроба из расчета 25 микробных клеток на один макрофаг и 0,1 мл фракций нейтрофилокинов, содержащих 5-10 мкг белка, при этом полученную суспензию перемешивают и подслаивают под покровные стекла, которые инкубируют, промывают, высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза, причем окрашенные опытные образцы (с внесением фракции нейтрофилокинов) и контрольные (без фракций) просматривают под микроскопом и осуществляют подсчет процента активных фагоцитов (ПАФ) и индекса завершенности фагоцитоза (ИЗФ), в результате выделяют фракции [ИЗФ составляет (+0,15±0,005)-(+0,68±0,04)] и определяют их как хелперные.

При этом синтез под влиянием микробных клеток Yersinia pestis EV-76 осуществляют при 37°С, в атмосфере 5% СО в течение 4-х часов с последующим центрифугированием культуральных жидкостей при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим фильтрованием через мембранные фильтры диаметром под 0,22 мкм.

Кроме того, воздействие хелперной фракции нейтрофилокинов на лизосомные мембраны макрофагов снижает число лизосомных гранул в одной клетке до 2,63±0,04 (контроль 2,92±0,04), одновременно не влияя на процент клеток, содержащих лизосомы 94±1,8% (контроль 95±1,8), что имеет положительное значение, так как приводит к лабилизации лизосомных мембран и слиянию лизосом с фагосомами, подтверждая этим активацию обменных процессов в клетке и усиление специфической активности иммунокомпетентных клеток.

Причем, при введении животным хелперной фракции, полученной при стимуляции нейтрофилов микробными клетками чумного штамма, наблюдают увеличение индекса перераспределения субпопуляций (ИПС) в сравнении с хелперной фракцией нейтрофилокинов, индуцированной микросферами латекса, в первом случае ИПС=21, а в последнем ИПС=7,0, при этом перераспределение субпопуляций макрофагов под влиянием хелперных фракций нейтрофилокинов идет в сторону количественного увеличения субпопуляций D, наиболее значимой при формировании противочумного иммунитета.

Способ осуществляется по следующей технологии

I. Выделяют нейтрофилы (Нф) перитонеального экссудата, для этого экспериментальным животным вводят внутрибрюшинно 0,1% раствор гликогена («Serva», Германия) на стерильном апирогенном физиологическом растворе (рН 7,2) (беспородным мышам - 0,2 мл, морским свинкам - 2 мл). Через 4 часа животных усыпляют хлороформом, Нф вымывают из брюшной полости средой 199 (Биолот, Санкт-Петербург), содержащей 20% сыворотки крови крупного рогатого скота и 5 ед/мл гепарина. В полученном экссудате по морфологическим данным Нф составляют от 90% до 96%. Жизнеспособность клеток, оцененная в тесте с трипановым синим (Amimed, Switzerland), составляет 96-98%. Средой 199 доводят концентрацию Нф до 10 ⁶ кл/мл, разливают в пластиковые чашки Петри по 3 мл и инкубируют при комнатной температуре 1 час.

II. Следующим этапом проводят индуцирование нейтрофилокинов (НК), при этом экссудат сливают и монослой Нф обрабатывают индукторами синтеза НК: микробными клетками (м.к.) Yersinia pestis EV-76. Культуру выращивают на агаре Хоттингера (рН 7,1) при 28°С в течение двух суток, затем готовят взвесь м.к. вакцинного штамма чумного микроба в апирогенном физиологическом растворе, убивают кипячением в течение 1-2 минут и разливают по 3 мл в каждую чашку Петри из расчета 10 м.к. на Нф. Отрицательным контролем служит НК, полученный от Нф, не обработанных индуктором, а положительным - НК от Нф, стимулированных микросферами монодисперсионного полистирольного латекса, диаметром 1,7 мкм из расчета 50 частиц на Нф. Чашки помещают в эксикатор и инкубируют в термостате при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение 4 часов. По окончании инкубации супернатанты, содержащие комплекс нейтрофилокинов, получают центрифугированием культуральных жидкостей при 1000 об/мин в течение 10 мин с последующим фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

III. Процесс выделения фракций нейтрофилокинов (ФНфК) заключается в том, что жидкость, полученную после фильтрования, сливают и концентрируют комплекс нейтрофилокинов осаждением сульфатом аммония до 80% насыщения. Сформировавшийся в течение 10-12 часов при 4°С осадок нейтрофилокинов отделяют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин. Осадок, представляющий собой суммарный пул НК, суспендируют в 5 мл забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР) (рН 7,1), содержащего 0,02% азида натрия. Получение отдельных фракций нейтрофилокинов проводят путем гель-хроматографического разделения их суммарного пула на оборудовании фирмы LKB (Швеция), состоящем из колонки, соединенной с фракционирующим коллектором и автоматическим самописцем (Uvicord II, LKB, Швеция). На колонку с сефадексом G-75 (Pharmacia), упакованную и уравновешенную в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя, с помощью перистальтического насоса наносят препарат нейтрофилокинов, суспендированный в ЗФР. Элюцию проводят ЗФР с 0,02% азида натрия при постоянной скорости. Элюент собирают в пробирки по 15 мл.

Содержание белка в полученных фракциях оценивают по методу Эрисмана (1973); количество общих гексоз-реакций с фенолом и серной кислотой (Dubois M. et al., 1956); количество суммарных нуклеиновых кислот - по методу Спирина (1956). Биохимическая характеристика фракций нейтрофилокинов показала, что они представляли собой продукты полипептидной природы и не содержали углеводов и нуклеиновых кислот.

IV. Выделение перитонеальных макрофагов (Мф). Для получения перитонеальных Мф создают асептическое воспаление путем внутрибрюшинного введения белым мышам 2 мл 1% пептонной воды за 4 дня до опыта (Кротова М.Р., 1971). Взятие клеток осуществляют промыванием брюшной полости животных средой 199, содержащей 5 ед/мл гепарина и 20% сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при 56°С в течение 30 мин. Жизнеспособность полученных клеток в тесте с трипановым синим составляет 90-95%. Концентрацию клеток определяют подсчетом в камере Горяева, после этого экссудат разводят средой 199 до концентрации 4 млн клеток в мл.

V. Проведение реакции фагоцитоза. Для постановки реакции к 1 мл перитонеального экссудата, содержащего Мф, добавляют 0,1 мл суточной культуры вакцинного штамма Y. pestis EV-76 (выращенного на агаре Хоттингера, рН 7,1, при 28°С, из расчета по 25 м.к. на каждый Мф) и затем вливают 0,1 мл ФНфК, причем последние включают 5-10 мкг белка. В качестве контроля используют взвесь Мф и м.к. без добавления ФНфК. Суспензию хорошо перемешивают и подслаивают под покровные стекла, помещенные в стерильные пенициллиновые флаконы (по 6 флаконов со стеклами на каждую фракцию). Последние поворачивают покровным стеклом вверх и инкубируют при 37°С в течение часа. По истечении этого времени покровные стекла десятикратно стерильно промывают средой 199 для удаления не прикрепившихся клеток и внеклеточно расположенных микробов. Три стекла высушивают, фиксируют в 96% спирте и окрашивают по Романовскому-Гимза (Шосткинский завод химреактивов), а другие три стекла после промывания помещают в стерильные флаконы со свежей средой 199, содержащей 20% сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при 56°С в течение 30 мин, и выдерживают в термостате еще 5 часов. Затем стекла вновь промывают, высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза. Окрашенные опытные (образцы с внесением ФНфК) и контрольные мазки (без ФНфК) просматривают под иммерсионным микроскопом. Подсчитывают процент активных фагоцитов (ПАФ) - отношение активных фагоцитов с захваченными микробами к числу подсчитанных; фагоцитарный индекс ФИ₁ и ФИ₆ - число микробов в одном фагоците через 1 и 6 часов инкубации соответственно. Определяют индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) - отношение разности между ФИ ₁ и ФИ₆ к ФИ₁ . Выделенные предложенным способом ФНфК модулируют киллерную активность Мф: усиливают (№ фракций - 1, 7, 8, 11-14) или ингибируют ее (№ 2, 3, 6, 9, 10) (табл.1). Фракции со стимулирующим эффектом фракции [ИЗФ составляет (+0,15±0,005)-(+0,68±0,04)] объединяют, называют условно хелперной ФНфК и изучают влияние на фагоцитарную активность перитонеальных Мф беспородных мышей (in vitro), на проницаемость лизосомных мембран (in vitro) и перераспределение субпопуляций этих клеток (in vivo).

Эффективность описанного способа подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Влияние хелперных ФНфК на фагоцитарную способность перитонеальных Мф беспородных мышей in vitro.

Мф перитонеального экссудата выделяли по методу Кротковой М.Р. (см. табл.2) как описано выше. Затем проводили постановку реакции фагоцитоза. Изучали влияние хелперных ФНфК, полученных как под воздействием м.к. Y. pestis EV, так и ФНфК, индуцированной микросферами латекса, на киллерную активность Мф. Статистический анализ материалов осуществляли с помощью таблиц для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала.

Результаты этих испытаний (см. табл.2) свидетельствуют о том, что хелперная ФНфК, индуцированная м.к. Y. pestis EV, стимулирует киллинг возбудителя чумы Мф в большей степени (ИЗФ+0,68±0,04), чем хелперная ФНфК, полученная в результате стимуляции Нф микросферами латекса (ИЗФ+0,12±0,04), которые практически не превышают контрольного значения (ИЗФ+0,10±0,05).

Пример 2. Влияние хелперных ФНфК на проницаемость лизосомных мембран перитонеальных Мф беспородных мышей.

Перитонеальные Мф выделяли описанным выше методом Кротковой М.Р. Концентрацию клеток определяли подсчетом в камере Горяева и разводили экссудат средой 199 до концентрации 4 млн клеток в мл. К 1,0 мл экссудата добавляли по 0,1 мл ФНфК (5-10 мкг белка), индуцированных как Y. pestis EV, так и латексом. Контролем служила взвесь Мф без добавления ФНфК. Суспензию хорошо перемешивали и подслаивали под покровные стекла, помещенные в пенициллиновые флаконы. Флаконы поворачивали покровным стеклом вверх и инкубировали при 37°С в течение часа. По истечении этого времени покровные стекла десятикратно стерильно промывали средой 199 для удаления не прикрепившихся клеток и помещали в стерильные флаконы со свежей средой 199, содержащей 20% сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при 56°С в течение 30 мин, и выдерживали в термостате при 37°С 4 часа. Влияние хелперных ФНфК, полученных под воздействием м.к. вакцинного штамма и микросфер латекса, на активность лизосом Мф оценивали по способности этих клеток включать флюоресцирующий краситель акридиновый оранжевый. Мазки изучали в люминесцентном микроскопе МБИ-15 (источник света - ртутная лампа ДРШ-250-3, светофильтр ФС-1-4, запирающий фильтр ЖС-18, увеличение 90х10). В каждом варианте экспериментов просматривали по 300 клеток в опыте и контроле (с добавлением ФНфК и без них). Учитывали процент клеток, содержащих ярко-оранжевые гранулы - лизосомы. Количество лизосом в клетках выражали в условных единицах (у.е.) (Khavkin T.N. et al., 1977). Статическую обработку результатов исследований осуществляли с помощью статистических таблиц для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала.

Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что хелперная ФНфК, продуцированная в ответ на воздействие м.к. Y. pestis EV, в отличие от хелперной ФНфК, индуцированной латексом, обусловливает более выраженное снижение числа лизосомных гранул в одной клетке, не влияя на процент клеток, содержащих лизосомы. Это явление имеет положительное значение, так как такие изменения мембран являются показателем активации обменных процессов в клетке и защитных механизмов, обеспечивающих захват и уничтожение чужеродных агентов с помощью кислых гидролаз и катионных белков лизосом, для чего необходим выход этих биологически активных компонентов из лизосом в образовавшиеся фаголизосомы и приводит к повышению специфической активности иммунокомпетентных клеток.

Пример 3. Влияние хелперных ФНфК на перераспределение субпопуляций перитонеальных Мф беспородных мышей (in vivo) (см. табл.4).

Для оценки способности хелперных ФНфК, индуцированных разными препаратами (м.к. чумного микроба или микросферами латекса), вызывать перераспределение субпопуляций (например, А, В, С, D) перитонеальных Мф за 4 часа до эксперимента подопытным животным вводили внутрибрюшинно 0,1-0,2 мл нейтрофилокинов (5-10 мкг белка), контрольным - ЗФР в том же количестве. Клетки перитонеального экссудата вымывали средой 199. Разделение Мф перитонеального экссудата на субпопуляции осуществляли методом адгезии в градиенте температур на пластиковых чашках, обработанных культуральной средой с бычьим сывороточным альбумином (2 мг на мл), в течение 18-20 часов при 4°С. Суспензию Мф (2×10 ⁷) вносили в чашки и инкубировали при 2°С в течение часа. Не прикрепившиеся клетки переносили на следующие чашки и инкубировали при 10°С в течение часа. Эту процедуру адгезии - смыва повторяли при 28° и 37°С. Все полученные в виде монослоев субпопуляции Мф отмывали в 4-х порциях культуральной среды для удаления не прикрепившихся клеток, снимали с поверхности чашек резиновым шпателем и определяли концентрацию Мф в камере Горяева. Субпопуляции обозначали буквами А, В, С, D, что соответствовало адгезии клеток при 2°, 10°, 28° и 37°С. Определяли индекс перераспределения субпопуляций (ИПС) по формуле: ИПС=С _Д÷С_А, где С_Д и С_А - относительное содержание в суммарном пуле субпопуляций, выделенных при 37°С и 2°С соответственно. Статистический анализ материалов осуществляли с помощью таблиц для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала.

Результаты экспериментов по изучению влияния хелперных ФНфК, индуцированных м.к. Y. pestis EV или микросферами латекса, на распределение субпопуляций перитонеальных Мф представлены в таблице 4. Наблюдалось существенное увеличение ИПС (Д/А) при введении животным хелперной ФНфК, полученной при стимуляции Нф м.к. чумного микроба (ИПС=21), которая была более активна в этом плане, чем ФНфК, индуцированная микросферами латекса (ИПС=7,0).

Таким образом, перераспределение субпопуляций Мф под влиянием хелперной ФНфК идет в сторону количественного увеличения субпопуляций D на фоне неизменного относительного содержания клеток других субпопуляций. Биологический смысл указанного явления заключается в том, что с помощью специальных нейтрофилокинов организм пытается удержать в очаге воспаления клетки субпопуляции D, наиболее активные при формировании противочумного иммунитета.

Исходя из изложенных примеров 1, 2, 3 можно утверждать, что предлагаемый способ получения хелперной фракции нейтрофилокинов, синтезированных под влиянием м.к. возбудителей особо опасных инфекций, в частности м.к. вакцинного штамма чумного микроба, позволяет выделить фракции нейтрофилокинов, обладающих иммуностимулирующей активностью в отношении иммунокомпетентных клеток. Кроме того, полученная предложенным способом хелперная ФНфК может быть применена для изучения неизвестных механизмов пато- и иммуногенеза, а также для коррекции иммунопатологических реакций при экспериментальной чуме.

Таблица 1
Влияние фракций нейтрофилокинов на киллерную способность макрофагов беспородных мышей в отношении Y. pestis EV
№ фракции	ИЗФ
1	+0,40±0,08
2	-0,30±0,07
3	-0,50±0,01
4	-0,29±0,02
5	-0,21±0,04
6	-0,11±0,01
7	+0,31±0,066
8	+0,25±0,02
9	-0,9±0,02
10	-0,51±0,01
11	+0,59±0,05
12	+0,68±0,04
13	+0,58±0,07
14	+0,15±0,005
Контроль	+0,10±0,05

Таблица 2
Влияние хелперных фракций нейтрофилокинов на фагоцитарную активность макрофагов беспородных мышей
Индукторы нейтрофилокинов	ПАФ	ИЗФ
М.к. Y. pestis EV	91±1,5	+0,68±0,04
Латекс	89±1,5	+0,12±0,04
Контроль	90±1,6	+0,10±0,05

Таблица 3
Влияние хелперных фракций нейтрофилокинов на лизосомный аппарат макрофагов беспородных мышей
Индукторы нейтрофилокинов	Клетки, содержащие лизосомы, %	Количество лизосомных гранул, УЕ
М.к. Y. pestis EV	94,0±1,8	2,63±0,4
Латекс	85,4±2,03	2,90±0,2
Контроль	95,0±1,6	2,92±0,4

Таблица 4
Влияние хелперных фракций нейтрофилокинов на распределение субпопуляций перитонеальных макрофагов беспородных мышей
Индукторы нейтрофилокинов	ИПС
М.к. Y. pestis EV	21,0
Латекс	7,0
Контроль	1,5