способ идентификации ингибиторов или агонистов протеинкиназы irs

Формула изобретения

1. Способ идентификации ингибитора протеинкиназы IRS, включающий этапы

a) введения РКС- в контакт, по меньшей мере, с одним пептидом IRS, содержащим, по меньшей мере, один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования в присутствии, по меньшей мере, одного предполагаемого ингибитора, причем по меньшей мере один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования выбран из остатка 498 и 570, где номера в последовательности соответствуют IRS-1 крысы, как отражено в SEQ ID NO:16, или соответствующего сайта РКС- -Ser-фосфорилирования млекопитающего, предпочтительно человека или грызуна, и

b) измерения степени фосфорилирования сайта PKC- -Ser-фосфорилирования, в котором пониженное фосфорилирование по меньшей мере одного из сайтов PKC- -Ser-фосфорилирования по сравнению с фосфорилированием в отсутствии, по меньшей мере, одного предполагаемого ингибитора служит признаком ингибирующих свойств предполагаемого ингибитора.

2. Способ по п.1, в котором РКС- получают от млекопитающего, предпочтительно грызуна или человека, более предпочтительно крысы или человека.

3. Способ по п.1, в котором пептид IRS получают из IRS млекопитающего, предпочтительно человека или грызуна, более предпочтительно крысы.

4. Способ по п.1, в котором пептид IRS представляет собой rIRS-1^449-664 (SEQ ID NO:17).

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором ингибитор выбирают из группы, состоящей из антител, связывающих пептидов, низкомолекулярных соединений (LMWs).

6. Способ идентификации агониста IRS, включающий этапы

a) введения РКС- в контакт, по меньшей мере, с одним пептидом IRS, содержащим, по меньшей мере, один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования в присутствии, по меньшей мере, одного предполагаемого агониста, содержащего, по меньшей мере, один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования, причем по меньшей мере один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования по меньшей мере одного пептида IRS выбран из остатка 498 и 570, где номера в последовательности соответствуют IRS-1 крысы, как отражено в SEQ ID NO:16, или соответствующего сайта PKC- -Ser-фосфорилирования млекопитающего, предпочтительно человека или грызуна, и

b) измерения степени фосфорилирования сайта PKC- -Ser-фосфорилирования предполагаемого агониста, в котором увеличение степени фосфорилирования сайта PKC- -Ser-фосфорилирования агониста по сравнению с фосфорилированием сайта PKC- -Ser-фосфорилирования пептида IRS служит признаком агонистических свойств предполагаемого агониста.

7. Способ по п.6, в котором РКС- получают от млекопитающего, предпочтительно человека или грызуна, более предпочтительно крысы.

8. Способ по п.6, в котором пептид IRS представляет собой rIRS-1 ^449-664 (SEQ ID NO:17).

9. Пептид IRS-1, где пептид IRS-1 содержит по меньшей мере один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования в остатке 570, где номер в последовательности соответствует IRS-1 крысы, как отражено в SEQ ID NO:16, или соответствующий сайт PKC- -Ser-фосфорилирования млекопитающего, предпочтительно человека или грызуна, отличающийся тем, что остаток 570 заменен в результате мутации, предпочтительно остаток 570 заменен в результате мутации на аланин.

Описание изобретения к патенту

Описание

Настоящее изобретение относится к способу идентификации ингибиторов или агонистов протеинкиназы IRS, а также к выбранным пептидам IRS, содержащим сайты фосфорилирования для PKC- и других сериновых киназ IRS, и к применению этих пептидов для идентификации фармацевтического состава для лечения диабета типа 2.

Инсулин-независимый сахарный диабет (NIDDM) встречается преимущественно у взрослых и характеризуется пониженной чувствительностью тканей, способных к очистке крови от глюкозы. В отличие от инсулин-зависимого сахарного диабета (IDDM, диабета типа I), диабет типа II не характеризуется пониженной секрецией инсулина бэта-клетками поджелудочной железы.

Молекулярный механизм, приводящий к пониженной чувствительности к инсулину или даже резистентности к инсулину, еще не известен, несмотря на усиленные попытки исследователей в Университетах и в фармацевтической промышленности. Недавние исследования прояснили, что в диабете типа II нарушаются пути вторичных мессенджеров, соединяющие активированный инсулиновый рецептор с транслокацией GLUT4 и транспортом глюкозы. Конкретно, у белков субстрата инсулинового рецептора (IRS) множество остатков тирозина фосфорилируется активированным инсулиновым рецептором, рецептором инсулиноподобного фактора роста и JAK1/2 и играют центральную роль в процессе нисходящей передачи сигнала инсулина (1, 2, 3). Фосфотирозиновые мотивы, конкретно в IRS-1 и IRS-2, служат сайтами посадки для ряда адапторных белков, которые обладают гомологией домена Src 2 (SH2), включая Grb2, внутриклеточную РТРазу SHP-2, Nck, Crk и фосфатидилинозитол-3 киназу (PI-3 киназу) (4-6). PI-3 киназа состоит из каталитической 110 кДа субъединицы (p110) и регуляторной 85 кДа субъединицы (p85), содержащей два домена SH2, которые связываются с тирозин-фосфорилированными мотивами pYMXM и pYXXM в белках IRS и индуцируют активацию PI-3 киназы (7). Это приводит к стимуляции дополнительных нисходящих киназ, включая серин/треониновую киназу PKB/Akt (8,9) и атипичные изоформы- и- протеинкиназы C (PKC- / ) (10, 11) фосфоинозитид-зависимой киназой 1. Показано, что активация PKB и PKC- / и их нисходящих сигналов играет важную роль в обеспечении метаболических действий инсулина таких, как транслокация GLUT4 и транспорт глюкозы (10, 11), фосфорилирование серина GSK3 и синтез гликогена (12), фосфорилирование серина PDE и антилиполиз (13, 14) и активация mTOR и синтез белков (15, 16).

Дисрегуляция сигнальной системы инсулина представляет собой многофакторный процесс, приводящий к резистентности к инсулину и диабету типа 2 с белками IRS, потенциально представляющими основную мишень (17). Таким образом, было предположено, что фосфорилирование серин/треониновых белков IRS играет ключевую роль как в ингибировании сигнала инсулина по принципу обратной связи, так и в развитии клеточной резистентности к инсулину (обзор см. в 17-19). Показано, что ковалентная модификация IRS-1 на серине/треонине ухудшает индуцированные инсулином фосфорилирование тирозина, активацию PI 3-киназы и стимуляцию транспорта глюкозы (20). В нестимулированном состоянии фосфорилирование серина/треонина IRS-1 происходит в клетке конститутивно (21), и оно дополнительно активируется цитокинами и метаболитами, которые ингибируют трансдукцию сигналов таких, как фактор некроза опухоли (TNF) (22), свободные жирные кислоты, глюкоза или церамид (23). Кроме того, на остатках серина/треонина обычно обнаруживают гиперфосфорилирование IRS-1 при резистентности к инсулину и диабете типа 2 (24).

Несмотря на ключевую роль в развитии резистентности к инсулину, фосфорилирование серина IRS-1 остается не до конца понятным, главным образом, в силу того, что IRS-1 содержит более 100 потенциальных сайтов фосфорилирования серина и того, что, как показано, представляет субстрат для многих протеинкиназ, включая N-концевую киназу c-Jun (JNK) (25), IkappaB киназу- (26), MAP-киназу (27), киназу казеина (28), киназу гликогенсинтазы (29), фосфоинозитол-3-киназу (30), протеинкиназу А (31), протеинкиназу C (32), протеинкиназу B (PKB) (33) и АМФ-активируемую протеинкиназу (AMPK) (34). Интересно, что PKB и AMPK, как обнаружено, действуют в качестве положительного регулятора функции IRS-1, что говорит в пользу представления о том, что серин/треониновое фосфорилирование IRS-1 играет двойную роль либо усиления, либо прекращения передачи сигнала инсулина (35). Идентификация остатков в различных доменах IRS-1, претерпевающих фосфорилирование серина в ответ на различные стимулы, улучшила понимание этого чрезвычайно сложного регуляторного этапа в действии инсулина. Таким образом, Ser ³⁰⁷, расположенный вблизи фосфотирозин-связывающего домена (PTB), идентифицировали как мишень для киназ, активизируемых при стрессе, включая JNK (25), и может также играть роль в качестве регулятора действия инсулина с отрицательной обратной связью (36). Ser⁷⁸⁹ является мишенью для AMPK и положительно модулирует действие инсулина (34), однако также было обнаружено, что фосфорилирование Ser⁷⁸⁹ неидентифицированными киназами ослабляет передачу сигнала инсулина (37). Ser⁶¹², Ser⁶³² , Ser⁶⁶² и Ser⁷³¹ расположены внутри или вблизи домена взаимодействия с PI 3-киназой, однако, функциональное значение этих сайтов остается неясным (38-40).

В отличие от описанных выше протеинкиназ, протеинкиназа C (PKC)- , которая является атипичным членом семейства PKC серин/треониновых киназ, как представляется, участвует как в нисходящей трансдукции сигнала инсулина, так и в контроле функции IRS-1 с отрицательной обратной связью (11, 41-44). Таким образом, было обнаружено, что PKC- локализуется совместно с GLUT4 и является существенным для регулируемых инсулином транслокации GLUT4 и транспорта глюкозы в скелетной мышце (41) и адипоцитах (11). Дополнительно, дефектная активация PKC- может внести свой вклад в зависимое от ожирения развитие резистентности скелетной мышцы к инсулину (42). Недавние данные Quon и сотрудников (43) показали, что IRS-1 представляет новый субстрат для PKC- , и в параллельном исследовании Zick и сотрудники (44) нашли, что этот процесс ингибирует активацию PI 3-киназы, что говорит о том, что PKC- представляет ключевой элемент в контроле действия инсулина с отрицательной обратной связью.

В общих словах, несмотря на то, что в уровне техники известно, что IRS, особенно IRS-1, взаимодействует с PKC- , природа этого взаимодействия не известна. Следовательно, нет агентов, известных в уровне техники, взаимодействующих с IRS-PKC- . Однако такие агенты были бы весьма полезными, так как вероятно, что торможение взаимодействия IRS и PKC- привело бы к отрицательной регуляции торможения IRS и вниз по пути передачи сигнала, PI 3-киназы, которая в свою очередь приводит к улучшению транслокации GLUT4 и транспорта глюкозы.

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение способа идентификации ингибиторов или агонистов протеинкиназы IRS.

В соответствии с настоящим изобретением, данной цели соответствует способ идентификации ингибитора протеинкиназы IRS, предусматривающий этапы:

a) введение PKC- в контакт, по меньшей мере, с одним пептидом IRS, содержащим, по меньшей мере, один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования в присутствии, по меньшей мере, одного предполагаемого ингибитора, и

b) измерение степени фосфорилирования сайта PKC- -Ser-фосфорилирования.

Настоящее изобретение основано на неожиданной идентификации специфичных сайтов фосфорилирования серина в последовательности IRS, которые специфично узнаются PKC- . Следовательно, в контексте настоящего изобретения был идентифицирован молекулярный механизм, обеспечивающий взаимодействие IRS-PKC- . Кроме того, вероятно, что другие протеинкиназы такие, как c-Jun N-концевая киназа (JNK), IkappaB киназа- , MAP-киназа, киназа казеина, киназа гликогенсинтазы, фосфоинозитол-3-киназа, протеинкиназа A, протеинкиназа C, протеинкиназа B 8PKB) и АМФ-активируемая протеинкиназа (AMPK), могут узнавать эти сайты фосфорилирования. Поэтому определение сериновых сайтов, фосфорилируемых протеинкиназами, особенно PKC- , обеспечивает идентификацию молекул, препятствующих этому взаимодействию, либо по пути антагонистов, либо по пути агонистов.

В контексте настоящего изобретения, термин "ингибитор протеинкиназы IRS" относится к веществу, которое препятствует взаимодействию между IRS и протеинкиназой, например, PKC- .

В контексте настоящего изобретения, термин "пептид IRS" относится к пептиду, содержащему отрезок, по меньшей мере, из 5, предпочтительно, из 7, предпочтительно, по меньшей мере, из 10 аминокислот IRS. Термин "пептид IRS" подразумевает, что IRS-пептид кроме аминокислотного отрезка, полученного из IRS, может включать дополнительные аминокислоты, которые получены не из IRS.

Все способы в соответствии с изобретением предпочтительно проводят in vitro.

PKC- коммерчески доступна, например от CalBiochem (San Diego, CA, USA). Кроме того, способы выделения PKC- описаны в литературе, процитированной в настоящей заявке.

Последовательности IRS, особенно IRS-1 и IRS-2, различных видов известны в уровне техники. Последовательность IRS-1 крысы представлена как SEQ ID NO: 16.

Способы получения белков и, следовательно, IRS известны в уровне техники и включают, например, экспрессию белка в подходящих клетках из кДНК, или получение путем последовательного добавления аминокислот к начальной аминокислоте (см. Current Protocols, John Wiley & Sons, Inc., New-York).

Кроме того, в уровне техники известны способы получения белковых фрагментов (см. выше) и включают расщепление белка подходящими протеазами, или получения фрагментов нуклеиновой кислоты, кодирующих белковые фрагменты, и последующей экспрессии фрагментов в подходящих клетках.

В уровне техники известны способы получения мутантных белков, например, путем замещения одной или более аминокислот или путем делеции аминокислотного отрезка (см. выше). Эти способы включают сайтнаправленный мутагенез гена IRS и экспрессию модифицированного гена в подходящих клетках.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, сокращение фосфорилирования сайта PKC- -Ser-фосфорилирования по сравнению с фосфорилированием в отсутствие, по меньшей мере, одного предполагаемого ингибитора указывает на ингибирующие свойства предполагаемого ингибитора.

Предпочтительно, PKC- получают от млекопитающего, предпочтительно, грызуна или человека, более предпочтительно, крысы или человека.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, пептид IRS получают из IRS, предпочтительно IRS-1, от млекопитающих, предпочтительно человека или грызуна, более предпочтительно, от крысы.

Предпочтительно, IRS-1 получают от крысы, и, по меньшей мере, один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования выбирают из группы, состоящей из Ser 458, 469, 481, 498, 522, 526, 530, 536, 538, 539, 542, 560, 570, 577, 599, 600, 612, 620, 632, 635, 662 и 664, в которой номера в последовательности соответствуют IRS-1 крысы, как отражено в SEQ ID NO:16. Кроме того, IRS-1 можно получать от человека, и, по меньшей мере, один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования выбирают из числа остатков Ser, соответствующих приведенным выше остаткам Ser IRS-1 крысы.

Предпочтительно, сайт PKC- -Ser-фосфорилирования в контексте настоящего изобретения может быть выбран из группы, состоящей из Ser ⁴⁹⁸, Ser⁵⁷⁰ и Ser ⁶¹², более предпочтительно, Ser⁵⁷⁰ .

В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, данный пептид представляет собой rIRS^449-664 (SEQ ID NO: 17).

Предпочтительно, ингибитор выбирают из группы, состоящей из связывающих пептидов, антител и низкомолекулярных соединений (LMWs).

Термин "связывающий белок" или "связывающий пептид" обозначает класс белков или пептидов, которые связывают и ингибируют IRS, включая, без ограничения, поликлональные или моноклональные антитела, фрагменты антитела и белковые каркасы, направленные против IRS, например антикалины, которые направлены против IRS.

Процедуру получения антитела или фрагмента антитела выполняют в соответствии со способами, известными специалисту, например, путем иммунизации млекопитающего, например, кролика с помощью IRS, где является уместным в присутствии, например, адъюванта Фрейнда и/или гелей гидроксида алюминия (см., например, Diamond, B.A. et al. (1981) New England Journal of Medicine: 1344-1349). Поликлональные антитела, которые образуются у животных в результате иммунологической реакции, впоследствии можно выделить из крови с применением известных способов и, например, очистить посредством колоночной хроматографии. Моноклональные антитела, например, можно получить в соответствии с известным способом Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299).

В соответствии с настоящим изобретением термин антитело или фрагмент антитела также следует понимать как обозначающий антитела или их антиген-связывающие части, которые получили рекомбинантным способом и, где является уместным, модифицировали, такие, как химерные антитела, гуманизированные антитела, многофункциональные антитела, биспецифичные или олигоспецифичные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты F(ab) или F(ab)₂ (см., например, EP-B1-0 368 684, USA 4 816 567, USA 4 816 397, WO 88/01649, WO 93/06213 или WO 98/24884).

В качестве альтернативы классическим антителам также можно, например, использовать белковые каркасы против IRS, например антикалины, которые основаны на липокалине (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903). Естественные лиганд-связывающие сайты липокалинов, например ретинол-связывающий белок или билин-связывающий белок, можно изменить, например, посредством "комбинаторного белкового дизайна"-подхода, в котором они связываются с выбранными гаптенами, здесь с IRS (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50). Другие известные белковые каркасы известны в качестве альтернативы к антителам для молекулярного узнавания (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167-187).

LMWs представляют собой молекулы, которые не являются белками, пептидами, антителами или нуклеиновыми кислотами и которые обладают молекулярным весом меньше, чем 5000 Да, предпочтительно, меньше, чем 2000 Да, более предпочтительно, меньше, чем 2000 Да, наиболее предпочтительно, меньше, чем 500 Да. Такие LMWs можно идентифицировать в высокопроизводительных процедурах, начинающихся с библиотек.

Ингибитор может быть в форме естественного экстракта продукта, как в неочищенной, так и в очищенной форме. Экстракт может быть получен в соответствии со стандартными процедурами такими, как экстракция водного и/или спиртового и/или органического растворителя и/или колоночная хроматография и/или осаждение из животного, растительного или микробного источника такого, как змеиный яд, листья или микробные жидкие среды ферментации.

В контексте настоящего изобретения, IRS и PKC- обеспечивают, например, в системе пробы и прямо или косвенно вводят в контакт с тестируемым соединением, в частности, с биохимическим или химическим тестируемым соединением, например, в форме библиотеки химических соединений. Затем измеряют или обнаруживают влияние тестируемого соединения на фосфорилирование IRS. После этого можно анализировать и/или выделять подходящие ингибиторы. Для скрининга библиотек химических соединений, предпочтительно применение высокопроизводительных проб, известных специалисту или которые являются промышленно доступными.

В соответствии с настоящим изобретением, термин "библиотека химических соединений" обозначает множество химических соединений, которые собирали из любого из множества источников, включая химически синтезируемые молекулы и естественные продукты, или которые производили с помощью методик комбинаторной химии.

В целом, влияние тестируемого соединения на взаимодействие измеряют или обнаруживают путем определения степени фосфорилирования пептида IRS. Это можно проделать при использовании фосфор-специфичных антител. Такие антитела известны в уровне техники и доступны, например, от Clonetech, Santa-Cruz и Cellsignal.

В качестве альтернативы, степень фосфорилирования можно измерять с применением радиоактивно меченой АТФ в пробе. АТФ можно метить с помощью 32-P или 33-P, и количество радиоактивного фосфата, включенного в IRS, можно измерять способами, известными в уровне техники (см. примеры 2, 9.). Например, интенсивность сигнала, измеренного с помощью авторадиографии, может указывать на степень фосфорилирования.

Преимущественно способ настоящего изобретения осуществляют в системе робототехники, например, включающей автоматизированную систему высевания на плашки и автоматизированную систему переноса жидкостей, например, с применением микроструйной техники, то есть с канальной структурой.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, способ выполняют в форме высокопроизводительной системы скрининга. Преимущественно в такой системе способ скрининга автоматизирован и выполнен в уменьшенных масштабах, в частности в нем используют уменьшенные лунки и микроструйную технику, которой управляют роботы.

Изобретение дополнительно относится к способу идентификации агониста IRS, предусматривающему этапы

a) введения PKC- в контакт, по меньшей мере, с одним пептидом IRS, содержащим, по меньшей мере, один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования в присутствии, по меньшей мере, одного предполагаемого агониста, содержащего, по меньшей мере, один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования, и

b) измерения степени фосфорилирования сайта PKC- -Ser-фосфорилирования предполагаемого агониста.

Для этого способа в соответствии с изобретением, в отношении PKC- и IRS применяют те же варианты осуществления, что и для приведенного выше раскрытого способа.

В предпочтительном варианте осуществления, агонист представляет собой пептид. Библиотеки пептидов, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, известны в уровне техники.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного способа изобретения, увеличение степени фосфорилирования сайта PKC- -Ser-фосфорилирования агониста по сравнению с фосфорилированием сайта PKC- -Ser-фосфорилирования пептида IRS свидетельствует об агонистических свойствах предполагаемого агониста.

Изобретение дополнительно относится к способу определения активности PKC- , предусматривающему этапы

a) введения PKC- в контакт, по меньшей мере, с одним пептидом IRS, содержащим, по меньшей мере, один сайт PKC- -Ser-фосфорилирования в присутствии, по меньшей мере, одного предполагаемого ингибитора, и

b) измерения степени фосфорилирования сайта PKC- -Ser-фосфорилирования.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает способ измерения активности PKC- . Такой способ является особенно полезным в случае, если активность PKC- от различных пациентов необходимо измерить для получения большего количества информации о сигнальной системе трансдукции у пациентов, в частности у пациентов с диабетом.

В данном способе изобретения, PKC- получают предпочтительно от млекопитающего, более предпочтительно от человека.

В отношении данного способа изобретения и используемых в нем IRS, применяют то же, что и для другого способа изобретения, раскрытого выше.

Изобретение дополнительно относится к пептиду IRS-1, содержащему Ser⁵⁷⁰ , предпочтительно IRS-1^449-664, как показано в SEQ ID NO: 17, или к его человеческому гомологу.

В рамках настоящего изобретения, оказалось, что данный пептид в соответствии с изобретением особенно полезен для идентификации аналогов или ингибиторов IRS.

Изобретение дополнительно обеспечивает набор, содержащий

a) по меньшей мере, один пептид IRS,

b) препарат PKC- и

c) по меньшей мере, один предполагаемый ингибитор или агонист протеинкиназы IRS.

Как уже обсуждалось выше, такой набор чрезвычайно полезен для идентификации ингибиторов протеинкиназы IRS. Его отдельные компоненты уже обсуждались выше.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает пептид IRS-1, в котором Ser⁵⁷⁰ и/или Ser ⁶¹² являются мутированными, предпочтительно, с заменой на аланин. Такой пептид полезен для блокировки активности PKC- in vitro или in vivo.

Изобретение дополнительно относится к применению пептида IRS, определенного выше, для получения антител, предпочтительно, против сайта PKC- -Ser-фосфорилирования, предпочтительно, против Ser ⁴⁹⁸, Ser⁵⁷⁰ и Ser ⁶¹², более предпочтительно, против Ser⁵⁷⁰ . Следовательно, с помощью пептидов IRS, определенных в настоящем изобретении, можно получить IRS-специфичные антитела, в частности антитела, направленные против сайтов фосфорилирования PKC- . Такие антитела могут служить как в in vitro диагностиках, так и в фармацевтических композициях.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению пептида IRS, определенного выше, или пептида IRS-1 с мутировавшими Ser-сайтами, определенными выше для получения фармацевтической композиции для лечения диабета типа 2. Такие пептиды могут ингибировать взаимодействие между IRS и PKC- и, следовательно, могут служить антагонистами фосфорилирования IRS.

Для получения фармацевтической композиции ингибиторы или агонисты протеинкиназы IRS, идентифицированные в настоящем изобретении, или пептиды в соответствии с настоящим изобретением обычно составляют с одной или более фармацевтически приемлемой добавкой или вспомогательным веществом таким, как физиологический буферный раствор, например раствор хлорида натрия, деминерализованная вода, стабилизаторы, такие как ингибиторы протеазы или нуклеазы, предпочтительно апротинин, -аминокапроновая кислота или пепстатин A или секвестирующие агенты такие, как EDTA, гелевые составы такие, как белый вазелин, парафин с низкой вязкостью и/или желтый воск и т.д. в зависимости от типа введения.

Подходящими дополнительными добавками, например, являются детергенты такие, как, например, Triton X-100 или дезоксихолат натрия, а также полиолы такие, как, например, полиэтиленгликоль или глицерин, сахара такие, как, например, сахароза или глюкоза, цвиттерионные соединения такие, как, например, аминокислоты такие, как глицин или, в особенности, таурин или бетаин и/или белок такой, как, например, сывороточный альбумин быка или человека. Предпочтительными являются детергенты, многоатомные спирты и/или цвиттерионные соединения.

Физиологический буферный раствор предпочтительно имеет pH приблизительно 6,0-8,0, в особенности pH приблизительно 6,8-7,8, в особенности pH приблизительно 7,4, и/или осмолярность приблизительно 200-400 миллиосмоль/литр, предпочтительно приблизительно 290-310 миллиосмоль/литр. pH фармацевтической композиции, в целом, доводят с применением подходящего органического или неорганического буфера, например, предпочтительно с применением фосфатного буфера, трис-буфера (трис(гидроксиметил)аминометана), буфера HEPES ([4-(2-гидроксиэтил)пиперазино]этансульфоновой кислоты) или буфера MOPS (3-морфолино-1-пропансульфоновой кислоты). Выбор соответствующего буфера, в целом, зависит от требуемой молярности буфера. Фосфатный буфер является подходящим, например, для инфузионных растворов и инъекции.

Фармацевтическая композиция может вводиться обычным способом, например, посредством пероральных лекарственных форм таких, как, например, таблетки или капсулы, через слизистые, например носовой или ротовой полости, в форме депозиториев, имплантируемых под кожу, посредством инъекций, вливаний или гелей, которые содержат фармацевтические композиции в соответствии с изобретением. Можно также вводить фармацевтическую композицию местно и локально, если является уместным, в форме липосомных комплексов. Кроме того, лечение можно проводить посредством трансдермальной терапевтической системы (TTS), которая делает возможным управляемое во времени высвобождение фармацевтических композиций. TTS известна, например, из EP 0 944 398 A1, EP 0 916 336 A1, EP 0 889 723 A1 или EP 0 852 493 A1.

В целом, инъекционные растворы используют, если в тело необходимо вводить лишь относительно малые количества раствора или суспензии, например, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мл. Инфузионные растворы, в целом, используют, если необходимо вводить большее количество раствора или суспензии, например один или более литров. Поскольку, в отличие от инфузионного раствора, в случае инъекционных растворов вводят лишь несколько миллилитров, малые отличия от pH и от осмотического давления крови или тканевой жидкости в инъекции не становятся заметными или становятся заметными лишь в незначительной степени в отношении болевых ощущений. Следовательно, разбавление композиции в соответствии с изобретением перед применением, в целом, не является необходимым. Однако в случае введения относительно больших количеств, композицию в соответствии с изобретением следует быстро разбавить перед введением до такой степени, чтобы получить, по меньшей мере, приблизительно изотонический раствор. Примером изотонического раствора является раствор хлорида натрия с концентрацией 0,9%. В случае вливания, разбавление можно выполнять, например, с применением стерилизованной воды, в то время как введение можно выполнять, например, посредством так называемого искусственного кровообращения.

Изобретение дополнительно относится к способу получения фармацевтической композиции, предусматривающему этапы:

a) идентификации ингибитора или агониста протеинкиназы IRS, определенного выше,

b) обеспечения адекватных количеств ингибитора протеинкиназы IRS и

c) составления фармацевтической композиции с ингибитором протеинкиназы IRS, необязательно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Изобретение дополнительно описано следующими примерами и чертежами, которые, как подразумевается, не ограничивают объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

МАТЕРИАЛЫ

Олигонуклеотидные праймеры были получены от MWG-Biotech (Ebersberg, Germany). BL21 Codon Plus и набор сайт-направленного мутагенеза QuikChange были закуплены в Stratagene (La Jolla, CA, USA). Компетентные клетки One Shot TOP 10 были от Invitrogen (Karlsruhe, Germany). Набор плазмид miniprep был получен от Qiagen (Hilden, Germany). Поликлональная anti-IRS-1 иммунная сыворотка была подарена доктором Dr. J. A. Maassen (Leiden, The Netherlands). Анти-фосфотирозиновое антитело (RC20), связанное с пероксидазой хрена, и anti-p85 антитело было получено от Transduction Laboratories, Inc (Lexington, KY, USA). Моноклональное anti-IRb антитело поставлялось от Oncogene (Cambridge, MA, USA). Anti-IRS-1 pS616 антитело было от Biosource (Camarillo, CA, USA). Детекция HRP-конъюгированного антитела IgG анти-кролик и анти-мышь в качестве вторичного антитела для усиленной хемилюминесценции (ECL) была от Promega Corp. (Mannheim, Germany). Протеинкиназа C из мозга крысы (PKC-rb), рекомбинантная протеинкиназа C- человека, бисиндолилмалеимид I (BIM) и ингибитор псевдосубстрата PKC- были получены от Calbiochem (San Diego, CA, USA). Альфа Тромбин был куплен в Upstate Biotechnology Inc (Lake Placid, NY, USA). Ферменты для молекулярной биологии, полная смесь ингибиторов протеаз и модифицированный трипсин марки секвенирования были получены от Roche (Mannheim, Germany). Окадаиновая кислота, фосфатидилсерин и агглютинин зародыша пшеницы (Triticum vulgaris) были куплены в SIGMA (München, Germany). Пептиды IRS-1 синтезировал доктор Hoffmann (BMFZ, University of Düsseldorf, Düsseldorf, Germany). Химические вещества для SDS-PAGE, вектор pGEX-5X-3 слияния генов GST, глютатионовая Sepharose® 4B и [ -³²P]АТФ были закуплены в Amersham Biosciences (Freiburg, Germany). Реактив синего красителя GelCode, очищающий буфер Restore для Вестерн-блоттинга и субстрат SuperSignal были получены от Pierce (Rockford, USA). Biacore X и сенсорный чип CM5 являются продуктами Biacore (Freiburg, Germany). Все другие химические вещества были высшей коммерчески доступной марки.

Пример 2

СПОСОБЫ

1. Конструирование и экспрессия составных белков

Регуляторная субъединица p85 PI 3-киназы быка, клонированная в вектор экспрессии pGEX-2T, была любезным подарком доктора P. Shepherd (London, UK). Составной белок глютатионовой S-трансферазы (GST), содержащий аминокислоты 449-664 из IRS-1 крысы (rIRS-1^449-664, M_w 51,2 кДа), получили на основании способа, описанного Smith и Johnson (40) с применением вектора pGEX-5X-3. Соответствующую кДНК крысы получили из РНК, выделенной из сердца крысы с помощью обратной транскрипции с применением обратной транскриптазы птичьего вируса миелобластоза и последующей амплификации путем полимеразной цепной реакции с применением Pwo ДНК полимеразы и следующих олигонуклеотидных праймеров: 5'-праймер, ATATTGTCGACCAC-ACCCCACCAGCCAGG, 3'-праймер, ATGTACTACTACAGAGGGTC-ACGCCGGCGTAAGAATA (SEQ ID NO: 1 и 2). Продукты PCR выделяли, расщепляли подходящими ферментами рестрикции и субклонировали в pGEX-5X-3. Идентичность клона IRS-1 крысы проверяли путем анализа эндонуклеазы рестрикции и секвенирования нуклеотидов. Данный вектор и конструкцию p85 -pGEX-2T использовали для трансформации Escherichia coli BL21. Трансформированные клетки выращивали до значения A _{600 нм} 0,6-0,8 в 2x среде YTA (16 г/л триптон, 10 г/л дрожжей, NaCl 5 г/л) с добавкой 0,1 мг/мл ампициллина и индуцировали в течение 2 часов 0,1 мМ изопропил-b-D-тиогалактозидом (IPTG). Составные белки очищали с помощью афинной хроматографии на колонках глютатионовой сефарозы и элюировали 10 мМ глютатионом в 50 мМ трис-HCl (pH 8,0). GST часть p85 GST - составного белка протеолитически удаляли с применением бычьего тромбина в PBS. Протеазу добавляли к составному белку, связанному с колонкой глютатионовой сефарозы, культивировали в течение 2 часов при комнатной температуре, и затем собирали элюат. Белок определяли с применением модификации пробы белка Bio-Rad. Все составные белки GST обладали ожидаемым молекулярным весом при анализе электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) с додецилсульфатом натрия (SDS).

2. Приготовление киназы инсулинового рецептора

Печень крысы быстро удалили, сразу заморозили в жидком азоте и обработали, как описано (41). Вкратце, добавили 3,5 об./вес. ледяного буфера, состоящего из 50 мМ Hepes (pH 7,4), 1% Triton X-100 и 2x полных ингибиторов протеаз и гомогенизировали печень с применением Ultraturrax и гомогенизатора Potter-Elvehjem с последующим центрифугированием при 10 000 x g в течение 10 минут при 4°C. Получающийся супернатант медленно перемешивали при комнатной температуре в течение 60 минут, затем снова центрифугировали при 100 000 x g в течение 90 минут при 4°C. Затем супернатант вносили в колонку со связанным с агарозой агглютинином зародыша пшеницы (WGA). Колонку промывали 50 мМ Hepes (pH 7,4), 0,1% Triton X-100 и связанные гликопротеиды элюировали из колонки WGA данным буфером, содержащим 0,3 М N-ацетилглюкозамина.

3. Проба фосфорилирования in vitro

Для фосфорилирования rIRS-1 ^449-664 инсулиновым рецептором, 5 мкг WGA-очищенной фракции гликопротеида предварительно выдерживали в течение 30 минут при 30°C с 100 нМ инсулином в буфере фосфорилирования, содержащем 20 мМ Hepes (pH 7,4), 1 мМ DTT, 10 мМ MgCl ₂, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,2 мМ Na₃VO₄ , 1,7 мМ CaCl₂, 0,6 мг/мл фосфатидилсерина и 0,5 мкг/мкл окадаиновой кислоты. Автофосфорилирование инициировали добавлением АТФ при концентрации 50 мкМ и продолжали в течение 10 минут при 30°C. Фосфорилирование субстрата инициировали добавлением равных объемов rIRS-1 ^449-669 (1 мкг) с предварительной обработкой (30 минут) изоформами PKC или без них в том же буфере в присутствии 50 мкМ АТФ и давали ему протекать в течение 10 минут при 30°C в конечном объеме 50 мкл. Реакцию завершали добавлением 6x буфера для образца (0,35 М трис-HCl (pH 6,8), 10,28% (вес./об.) SDS, 36% (об./об.) глицерина; 0,6 М DTT, 0,012% (вес./об.) бромфенола синего) и кипятили в течение 5 мин. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали с помощью иммунодетекции антифосфотирозиновым антителом после переноса на нитроцеллюлозу. Серин/треониновое фосфорилирование rIRS-1^449-664 различными изоформами PKC оценивали путем выдерживания 1 мкг rIRS-1 ^449-664 с 0,5 мкг PKC-rb или PKC- в буфере фосфорилирования в течение 30 минут при 30°C в присутствии 50 мкМ АТФ плюс 2 мкКи [g-³² P]АТФ в объеме 20 мкл. Белки анализировали с помощью SDS-PAGE, окрашенные, и высушенные гели подвергали авторадиографии. Степень включения фосфата определяли путем измерения рассеченных фрагментов счетчиком Черенкова.

4. Проба разъединения GST

In vitro фосфорилированный rIRS-1^449-664 выдерживали с гранулами глютатионовой сефарозы во вращательном устройстве в течение 1 часа при 4°C. Гранулы промывали три раза буфером связывания (50 мМ трис (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1% (об./об.) Nonidet P-40, 1 мМ EDTA, 1 мМ NaF, Na₃VO₄ 1 мМ). Затем добавляли 0,5 мкг рекомбинантных p85 и обработку продолжали в течение 2 часов при 4°C. После трехкратного промывания связанные белки элюировали 20 мкл 2x буфера для образца и разделяли с помощью SDS-PAGE.

5. Иммуноблоттинг

Белки разделяли с помощью SDS-PAGE с применением гелей с градиентом 8-18%, с последующим переносом на нитроцеллюлозу в полусухом приборе блоттинга. Затем мембрану блокировали в течение 60 минут в трис-забуференном солевом растворе, содержащем 0,05% Tween 20 и 1% BSA или 5% нежирное сухое молоко, и исследовали с применением подходящих антител (anti-IRS-1, anti-pTyr, anti-p85 ). После обширного промывания мембраны выдерживали со вторичными антителами, сопряженными с пероксидазой хрена, снова промывали, и затем полосы белков визуализировали с помощью способа усиленной хемилюминесценции (ECL) на рабочей станции LumiImager (Boehringer, Mannheim, Germany). Все пятна подвергали количественному анализу с применением программного обеспечения LumiImager. Значение представленных разностей оценивали с применением нулевой гипотезы и t-статистики для непарных данных. Предполагалось, что значение p меньше 0,05 являлось статистически значимым.

6. Картирование фосфопептидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и масс-спектрометрии электрораспылительной ионизации (ESI-MS)

С применением 50 ед. (40 мкг) PKC- , фосфорилировали 5 нмоль белка rIRS-1^449-664 с помощью 50 мкМ АТФ плюс 0,25 мКи/мл [ -³²P] АТФ в течение 60 минут при условиях, описанных выше. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и фосфорилированный rIRS-1^449-664 расщепляли с помощью 100 мкг трипсина в отделенных частях геля в течение ночи при 30°C. Пептиды элюировали 50 мМ NH ₄HCO₃, 50% ацетонитрилом и разделяли на анионообменной колонне (Nucleogel SAX 1000-8/46, 50 x 4,6 мм, Macherey & Nagel, Düren, Germany) с применением системы доставки растворителя Beckman gold. Скорость потока HPLC составляла 0,5 мл/мин. После инжекции образца, пептиды элюировали, начиная со 100% буфера A (20 мМ NH₄CH ₃COOH, pH 7,0) и 0% буфера B (1 М KH₂ PO₄, pH 4,0). Количество буфера B увеличивали до 10% в течение 40 минут и от 10 до 50% в течение следующих 75 мин. Собирали 0,5 мл фракции и измеряли радиоактивность с помощью счетчика Черенкова. Радиоактивные фракции подвергали обратнофазной HPLC. Пептиды разделяли на C18 обратнофазной колонке (Nucleosil 300-5 C18, 250 мм x 2 мм, размер частиц 5 мкм, размер пор 300 Å, Macherey & Nagel, Düren, Germany). Скорость потока HPLC доводили до 0,33 мл/мин. После внесения образца элюцию начинали со 100% раствора А (0,1% TFA) и 0% раствора B (ацетонитрил/TFA (84/0,1; об./об.)). Долю раствора B увеличивали до 100% в течение 120 мин. Радиоактивность собранных фракций повторно измеряли. Фракции, содержащие радиоактивно меченые пептиды, подвергали масс-спектрометрии ESI TOF. Масс-спектры регистрировали на электрораспылительном квадрупольном времяпролетном масс-спектрометре (QSTAR Pulsar I, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), с применением nanospray-источника (Protana, Odense, Denmark). Выбранные пептиды анализировали в режиме тандемной масс-спектрометрии и последовательность и посттрансляционные модификации находили путем ручной интерпретации.

7. Сайт-направленный мутагенез

Мутантов rIRS-1 ^449-664 с заменой серина 570 на аланин и серина 612 на аланин получали путем сайт-направленного мутагенеза с применением набора сайт-направленного мутагенеза QuikChange в соответствии с инструкциями фирмы - производителя с применением pGEX-5X-3/rIRS-1^449-664 в качестве матрицы. Использовали следующие праймеры: С570А,

5' -CCCGGCTACCGGCATGCCGCCTTCGTGCCCACC (SEQ ID NO:3) и

3'-GGGCCGATGGCCGTACGGCGGAAGCACGGGTGG (SEQ ID NO:4); S612A,

5'-GGCTACATGCCCATGGCT CCCGGAGTGGCTCC (SEQ ID NO:5) и

3'-CCGATGTACGGGTAC CGAGGGCCTCACCGAGG (SEQ ID NO:6).

Наличие требуемых мутаций было подтверждено секвенированием рекомбинантных молекул с помощью Qiagen Sequencing Services (Hilden, Germany).

8. Изучение взаимодействия с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса

Принцип действия биосенсора BIAcore (Biacore, Freiburg, Germany) был предварительно описан (42). Во избежание мешающей димеризации GST-части составного белка, его расщепили с помощью тромбина в ходе очистки. В силу известной чрезвычайно высокой скорости связывания SH2-доменов с фосфопептидами, относительные степени сродства оценивали с помощью пробы конкуренции (43). В связи с этим, p85 с постоянной концентрацией (100 нМ) выдерживали в проточном буфере (0,01 М Hepes pH 7,4, 0,15 М NaCl, EDTA 3 мМ, 0,005% сурфактант P20 (HBS-EP)) с переменной концентрацией пептида-конкурента (50 нМ - 10 мкМ), который был идентичен таковому, связанному с поверхностью сенсорного чипа CM5. Затем, после 1-часовой предварительной выдержки при комнатной температуре, последовательно вводили различные смеси при скорости потока 5 мкл/мин при 25°C в буфере HBS-EP. Используемые пептиды DDGYMPMSPGV (SEQ ID NO: 7), DDGpYMPMSPGV, DDGYMPMpSPGV и DDGpYMPMpSPGV, представляющие аминокислоты 605-615 из IRS-1 крысы, синтезировали на синтезаторе пептидов Applied Biosystems model 433. Все пептиды иммобилизировали при концентрации 5 мг/мл в 100 мМ H₃BO₄ (NaOH pH 8,5) в 1 мкл/мин с помощью стандартной процедуры сочетания аминов, как описано фирмой-производителем. Восстановление после каждого эксперимента связывания выполняли путем инжекции 6 М гидрохлорида гуанидина в течение 2 мин. Кинетический анализ p85 с взаимодействием pY608 и pY606-pS612 выполняли с применением программного обеспечения BIAevaluation 3.1 (Biacore, Freiburg, Germany) и GraphPad Prism 3.0 (San Diego, CA, USA).

9. Измерение степени фосфорилирования серина/треонина rIRS- ^1449-664 с помощью PKC

Фосфорилирование серина/треонина rIRS-1^449-664 различными изоформами PKC оценивали путем пипетирования подходящих объемов 1 мкг rIRS-1^449-664 и 0,1 - 1,0 мкг PKC- или PKC мозга крысы в 10 мкл 2x буфера фосфорилирования (20 мМ Hepes (pH 7,4), 1 мМ DTT, 10 мМ MgCl₂ , 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,2 мМ Na₃VO₄ , 1,7 мМ CaCl₂, 0,6 мг/мл фосфатидилсерина и 0,5 мкг/мл окадаиновой кислоты, 50 мкМ АТФ + 2 мкКи [ -³²P] АТФ). С помощью воды смесь доводили до конечного объема 20 мкл минус необходимый объем АТФ. Затем начинали реакцию фосфорилирования путем добавления АТФ из основного раствора до конечной концентрации 50 мкМ АТФ плюс 2 мкКи [ -³²P] АТФ и выдерживали в течение 30 минут при 30°C. Реакцию останавливали путем добавления 4 мкл 6x буфера для образца (0,35 М трис-HCl (pH 6,8), 10,28% (вес./об.) SDS, 36% (об./об.) глицерина; 0,6 М DTT, 0,012% (вес./об.) бромфенола синего) и кипячения в течение 5 мин. Затем белки исследовали с помощью SDS-Page и окрашенные и высушенные гели для анализа подвергали авторадиографии.

Пример 3

Домен IRS-1 фосфорилировали с помощью инсулинового рецептора, и он взаимодействовал с PI 3-киназой

Для определения действия фосфорилирования серина/треонина на взаимодействие IRS-1 с инсулиновым рецептором и PI3-киназой, авторы изобретения разработали пробу in vitro фосфорилирования и взаимодействия с PI 3-киназой с применением рекомбинантного p85 и подхода GST-разъединения. Выбранную часть белка IRS-1 крысы клонировали, экспрессировали как GST - составной белок и очищали от E. coli. Данный GST - составной белок (rIRS-1 ^449-664) включает домен из 216 аминокислот (449-664) белка IRS-1 крысы, содержащий потенциальные сайты фосфорилирования тирозина в консенсусных мотивах YMXM или YXXM, включая главные сайты связывания PI3-киназы Tyr608 и Tyr628 (39) (см. фиг.1). На основании структуры кодируемого составного белка рассчитывали массу молекулы, составившую 51,2 кДа, наблюдаемую массу 55 кДа определяли с помощью SDS-PAGE. Порядок проведения эксперимента in vitro фосфорилирования и пробы взаимодействия p85 представлен на фиг.2A.

Обеспечение действия WGA-очищенного инсулинового рецептора на составной белок приводило к заметному фосфорилированию тирозина rIRS-1^449-664 , стимулируемому инсулином (фиг.2 B, верхняя рамка). Количественный анализ продемонстрировал 8,8±1,1-кратную стимуляцию выше основного уровня (n=10, фиг.2C). Проба GST-разъединения демонстрировала значительное увеличение взаимодействия регуляторной субъединицы p85 PI3-киназы с rIRS-1^449-664 с фосфорилированным тирозином (фиг.2B, средняя рамка).

Пример 4

Различные изоформы PKC ингибируют стимулируемое инсулином фосфорилирование тирозина rIRS-1^449-664 и последующее связывание с p85 .

Для оценки способности протеинкиназы C к фосфорилированию rIRS-1^449-664 in vitro, авторы изобретения сначала культивировали составной белок с PKC мозга крысы и PKC- в присутствии [³²P] АТФ. Затем rIRS-1 ^449-664 анализировали с помощью SDS-PAGE и авторадиографии (фиг.3 A), и заметное фосфорилирование rIRS-1 ^449-664, с помощью PKC становилось детектируемым. rIRS-1 ^449-664, выдерживаемое с тем же количеством PKC в присутствии ингибиторов PKC, не демонстрировало значительного включения фосфата (фиг.3 A). Затем определили, что кривая ответа на дозу с увеличением количества PKC устанавливает условия максимального фосфорилирования, которое наблюдали при 0,5 мкг PKC мозга крысы или PKC- (данные не показаны). Затем, используя это условие, авторы изобретения исследовали влияние фосфорилирования серина rIRS-1 ^449-664 на последующую активацию с помощью автофосфорилированного IR. В связи с этим, rIRS-1^449-664 обрабатывали с PKC или без него и затем выдерживали с WGA-очищенным IR. Впоследствии определяли связывания p85 путем связывания rIRS-1^449-664 с гранулам глютатионовой сефарозы через часть GST и выдерживания с 0,5 мкг p85 , как подчеркнуто на фиг.2A. Образцы анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с антителами против фосфотирозина (pTyr), p85 и IRS-1. Как показано на фиг.3B, предварительная обработка rIRS-1^449-664 с помощью PKC мозга крысы вызывала уменьшение стимулируемого инсулином фосфорилирования тирозина и взаимодействия с p85 . Tyr-фосфорилирование rIRS-1^449-664 уменьшалось на 27±4% (n=9) с более заметным ингибированием связывания p85 (49±8%) (фиг.3C). Ингибирование PKC-rb после фосфорилирования rIRS-1^449-664 путем добавления бисиндолилмалеимида (BIM) не влияло на данный результат (фиг.3C).

Для дополнительного исключения эффектов PKC на уровне IR, исследовали автофосфорилирование -субъединицы. При выдерживании самоактивировавшегося рецептора в течение 10 минут при 30°C в присутствии PKC-rb или PKC- не регистрировали значительного изменения автофосфорилирования IR по сравнению с контролями (фиг.4).

Затем экспериментальный подход, описанный на фиг.3B, повторили для PKC- . По сравнению с PKC-rb наблюдали еще более заметное понижение фосфорилирования тирозина rIRS-1^449-664 и взаимодействия с p85 (фиг.5A). Количественный анализ данных продемонстрировал ингибирование фосфорилирования тирозина на 46±5% (n=3) и сопутствующего ингибирования связывания p85 с IRS-1 на 81±1% (фиг.5B).

Пример 5

Идентификация и функциональный анализ сайтов фосфорилирования серина IRS-1, являющихся мишенью PKC

Предшествующие исследования продемонстрировали, что отрицательная регуляция передачи сигнала инсулина протеинкиназой C включает активизированную митогеном протеинкиназу и фосфорилирование серина 612 в IRS-1 (26). Серин 612 расположен в непосредственном соседстве с главным мотивом YMXM в Y608, который описывают, как являющийся одним из главных сайтов взаимодействия для PI 3-киназы (39).

Авторы изобретения оценили модификацию этого сайта с помощью PKC с применением специфичного антитела фосфосерина 612 IRS-1 ( pS⁶¹²). После выдерживания с PKC из мозга крысы и PKC- в течение 30 минут при 30°C, rIRS-1 ^449-664 в значительной степени подвергался иммуноблоттингу с apS⁶¹² (фиг.6A); ингибирование PKC с помощью BIM явным образом предотвращало фосфорилирование данного серина.

Для характеризации влияния фосфосерина 612 из IRS-1 на взаимодействие с PI 3-киназой использовали методику поверхностного плазмонного резонанса (SPR). С этой целью пептиды синтезировали с последовательностью DDGYMPMSPGV (SEQ ID NO:7), представляющей аминокислоты 605 - 615 из IRS-1 крысы, и иммобилизировали на поверхности чипа путем стандартного сочетания аминов. Сообщалось, что слияние доменов SH2 к GST может повредить их связыванию с фосфопептидами, что приводит к переоценке сродства связывания (44). В связи с этим, расщепляли GST-часть рекомбинантного p85 составного белка. Связывание p85 с пептидами изучали при нанесении различных концентраций очищенного p85 на биосенсорный чип, с которым были связаны пептиды в различных формах фосфорилирования. Эти эксперименты показали, что p85 связывается только с формой пептида с фосфорилированным тирозином (фиг.6B и C), что согласовалось с литературой (45).

Затем авторы изобретения определили относительное сродство связывания этой реакции путем мониторинга связывания 100 нМ p85 с пептидами pY608 (DDGpYMPMSPGV) и pY608-pS612 (DDGpYMPMpSPGV) в присутствии конкурирующих растворимых пептидов (фиг.6D, E, F). Полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC50) получали путем построения графика ответа SPR 440 s после инжекции при равновесии по отношению к логарифму концентрации пептида. Оба пептида демонстрировали измеримую активность связывания (фиг.6D против 6E). Солюбилизированные пептиды ингибировали связывание p85 с иммобилизированными пептидами в микромолярных концентрациях. Полное ингибирование достигалось при концентрации пептида ˜10 мкМ. Аппроксимация определенных считываний уравнением для конкуренции за два сайта дала IC50 для pY608 0,26 мкмоль/л и 16,56 мкмоль/л (r²=0,9983) и для pY608-pS612 0,15 мкмоль/л, 2,88 мкмоль/л (r²=0,9989). Из этих данных ясно, что пептид pY608-pS612 ингибировал связывание p85 с лучшей эффективностью, указывая на то, что наличие остатка фосфосерина в положении +4 фосфотирозиновых даже увеличивает сродство p85 SH2-домена к фосфопептиду IRS-1.

Для идентификации дополнительных сайтов фосфорилирования PKC- на rIRS-1^449-664, которые могли бы вызывать ингибирование стимулируемого инсулином фосфорилирования тирозина в системе in vitro, rIRS-1^449-664 выдерживали с PKC- и разделяли с помощью SDS-PAGE. Фосфорилированный rIRS-1 ^449-664 расщепляли с помощью трипсина и извлекали из геля. Пептиды, получающиеся в результате расщепления, исследовали с помощью двумерной HPLC и содержание радиоактивности во фракциях отслеживали с помощью счета со счетчиком Черенкова.

Профиль HPLC первого разделения с применением анионообменной колонки продемонстрировал 6 воспроизводимых главных пиков (фиг.7 A). Для разделения совместно мигрирующих пептидов радиоактивные фракции каждого пика объединяли в соответствии с профилем элюции и подвергали обратнофазной (RP)-HPLC (фиг.7 B). Это приводило к 10 различным радиоактивно меченым фракциям RP-HPLC, которые впоследствии подвергали электрораспылительной ионизационной масс-спектрометрии (ESI-MS). Результаты, полученные с помощью анализа MS, сведены в таблице. Можно было идентифицировать восемь пептидов, содержащих 37% последовательности rIRS-1^449-664. Обнаружили два фосфосерина, серин 358 (серин 570 в полном IRS-1) (LPGYRHpSAFVPTHSYPEEGLEMHHLER (SEQ ID NO:8)) в пике 4 анионообменой HPLC и серин 286 (серин 498) (YIPGATMGTpSPALTGDEAAGAADLDNR (SEQ ID NO:9)) в пиках 5 и 6. Фосфопептид с серином 358/570 соответствовал приблизительно 19% введенной радиоактивности. Пептид с фосфосерином 286/498 составлял 11% полной измеренной радиоактивности.

Фосфосерин 358 идентифицировали с помощью ESI-MS/MS. Фрагментный ион с разностью масс 97,9 Да по оношению к исходному иону указывает на фосфопептид (фиг.8A). Разность масс 97,9 Да коррелирует с потерей фосфорной кислоты. Сайт фосфорилирования идентифицировали потерей фосфорнокислой группы (HPO₃) и фосфорной кислоты (H ₃PO₄) ионами фрагмента b ₉ и b₁₀. Данное дефосфорилирование фрагментных ионов указывает на то, что фосфорилирование могло иметь место только на Y355 или S358. S358 представляет собой фосфоаминокислоту, поскольку дефосфорилирования на ионе b ₄ не было обнаружено, что указывает на фосфорилирование на Y355 (данные не показаны).

Фосфосерин 612 не мог быть обнаружен с помощью масс-спектрометрии несмотря на то, что он обнаруживался с помощью фосфосайт-специфичного антитела (фиг.6 A), но пептид, включающий данный сайт, был найден в пике 2 вместе с тремя дополнительными пептидами. Пик 1 и пик 3 содержал только один пептид, содержащий 13% и 21% радиоактивности, соответственно (THSAGTSPTISHQK и TPSQSSVVSIEEY-TEMMPAAYPPGGGSGGR). (SEQ ID NO:10 и 11)

Для дальнейшего подтверждения, что обнаруженные сайты фосфорилирования представляли собой серины 570 и 612, получали два дополнительных составных белка GST с мутацией серина на аланин. Эти составные белки GST подвергали воздействию PKC- и фосфорилировали ферментом на уровне, сопоставимом с диким типом (данные не показаны). С другой стороны, преобразование серина 358/570 на аланин в значительной степени уменьшило пик 4 в анионообменной HPLC (фиг.9 B), что демонстрировало, что серин 570 из IRS-1 представляет собой новый сайт фосфорилирования, являющийся мишенью PKC- . Мутация серина 400/612 на аланин приводит к уменьшению пика 2 (фиг.9 C), что подтверждает данные, полученные с фосфоспецифичной антисывороткой.

Пример 6

Функциональное значение остатков серина 570 и 612 в rIRS-1 ^449-664

Для определения функционального значения идентифицированных фосфосайтов rIRS-1^449-664 мутанты серина 358/570 на аланин и серина 400/612 тестировали в пробе in vitro фосфорилирования и взаимодействия p85 (фиг.10A). Сравнение результатов фосфорилирования тирозина с помощью IR после предварительной обработки PKC- продемонстрировало сопоставимое понижение (30-40%) для rIRS-1^449-664 дикого типа и двух данных мутантов (фиг.10B, левая рамка). Однако значительную разницу наблюдали при сравнении взаимодействия двух данных мутантов с p85 . Таким образом, связывание p85 c S570A уменьшилось до 43±4% (n=3) контроля посредством обработки PKC- , с уменьшением до 28±3% для мутанта S612A rIRS-1 ^449-664 (фиг.10B, правая рамка).

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ АББРЕВИАТУРЫ: GST, ГЛЮТАТИОН-S-ТРАНСФЕРАЗА; HPLC, ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ; IR, ИНСУЛИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР; IRS, СУБСТРАТ ИНСУЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА; ESI-MS, ЭЛЕКТРОРАСПЫЛИТЕЛЬНАЯ ИОНИЗАЦИОННАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ; P85, РЕГУЛЯТОРНАЯ СУБЪЕДИНИЦА ФОСФАТИДИЛИНОЗИТОЛ-(PI)-3 КИНАЗЫ; PAGE, ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ; PI 3-КИНАЗА, ФОСФАТИДИЛИНОЗИТОЛ-3-КИНАЗА; RP, ОБРАТНОФАЗНЫЙ; PKC, ПРОТЕИНКИНАЗА C; PKB, ПРОТЕИНКИНАЗА B; RTKS, ТИРОЗИНОВЫЕ КИНАЗЫ РЕЦЕПТОРА; SH2, ДОМЕН 2 SRC-ГОМОЛОГИИ; WGA, АГГЛЮТИНИН ЗАРОДЫША ПШЕНИЦЫ; SDS, ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТ НАТРИЯ; ECL, УСИЛЕННАЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1: Схематический обзор IRS-1 с известными партнерами взаимодействия и известными сайтами фосфорилирования серина/треонина.

Верхняя рамка: обозначены относительные положения гомологии плекстрина (PH) и фосфотирозин-связывающий (PTB) домен со следующим за ними C-концевым хвостом, который содержит многочисленные сайты фосфорилирования тирозина. Также показаны потенциальные партнеры связывания, включая PI 3-киназу, Grb2 и SHP-2. Средняя рамка: выделены известные (S307, 612, 632, 789) и потенциальные сайты фосфорилирования серина. Нижняя рамка: Конструкция GST-составного белка, содержащего аминокислоты 449-664 из IRS-1 крысы, включая главный сайт связывания PI 3-киназы.

Фиг.2: фосфорилирование Тирозина rIRS-1 ^449-664 и взаимодействие с субъединицей p85 PI 3-киназы.

(A) Принципиальная схема порядка проведения эксперимента. 5 мкг IR подвергали автофосфорилированию в течение 10 минут при 30°C в буфере фосфорилирования после 30 минут предварительной выдержки с 100 нМ инсулина. Затем фосфорилирование субстрата инициировали добавлением автофосфорилированного IR в аликвоты 1 мкг rIRS-1^449-664. Реакцию продолжали в течение 10 минут и затем добавляли гранулы глютатионовой сефарозы и образцы выдерживали при 4°C во вращательном аппарате в течение 1 часа. Гранулы промывали буфером связывания три раза, добавляли 0,5 мкг рекомбинантного p85 и продолжали выдерживание в течение 2 часов. После промывания связанные белки элюировали путем добавления 2x буфера для образца с последующим кипячением в течение 5 мин. (B) Элюируемые белки исследовали с помощью SDS-PAGE и анализировали с помощью иммуноблоттинга с применением антител против фосфотирозина, p85 и IRS-1, как подробно описано в разделе Способов. Показаны репрезентативные иммуноблоты из шести отдельных экспериментов. (C) Количественный анализ rIRS-1^449-664 фосфорилирования тирозина осуществляли с применением программного обеспечения Lumi Imager. Данные представляют собой средние значения ± SEM (n=10).

Фиг.3: Действие PKC из мозга крысы на фосфорилирование тирозина rIRS-1^449-664 и взаимодействие с p85 .

(A) 1 мкг rIRS-1^449-664 выдерживали с 0,5 мкг PKC из мозга крысы (PKC-rb) или 0,5 мкг PKC- в присутствии 2 мкКи (³²P)-АТФ (конечная конц. 50 мкМ), как подробно описано в разделе Способов. Реакцию ингибировали с помощью бисиндолилмалеимида I (BIM) или пептида псевдосубстрата для PKC-rb или PKC- , соответственно. Белки исследовали с помощью SDS-PAGE и подвергали авторадиографии. (B) Фосфорилирование тирозина rIRS-1 ^449-664 с помощью IR и взаимодействие с p85 устанавливали, как описано на фиг.2. rIRS-1 ^449-664 предварительно выдерживали с 0,5 мкг PKC-rb в течение 30 мин. Показаны репрезентативные иммуноблоты. (C) Количественный анализ ингибирующего действия PKC-rb на стимулированное инсулином фосфорилирование тирозина и взаимодействие p85 со стимулируемым инсулином значением принимали за 100%. Если присутствует, BIM добавляли в течение 10 минут перед начальным фосфорилированием субстрата с помощью IR (см. фиг.2). Данные представляют собой средние значения ± SEM (n=6-9).

Фиг.4: Действие изоформ PKC на автофосфорилирование IR.

(A) Автофосфорилирование IR проводили, как изложено на фиг.2. PKC-rb или PKC- прибавляли после автофосфорилирования в течение 10 минут, и продолжали выдерживание в течение еще 10 мин. Затем анализировали фосфорилирование тирозина -субъединицы IR с помощью иммуноблоттинга. (B) Количественный анализ иммуноблотов осуществляли с применением программного обеспечения Lumi Imager. Данные представляют собой средние значения ± SEM (n=4-6).

Фиг.5: Действие PKC- на фосфорилирование тирозина rIRS-1^449-664 и взаимодействие с p85 .

(A) rIRS-1^449-664 предварительно выдерживали с PKC- (0,5 мкг) в течение 30 мин. Фосфорилирование тирозина IR и взаимодействие с p85 определяли с помощью иммуноблоттинга, как подробно описано на фиг.2. (B) Количественный анализ ингибирующего действия PKC- выполняли, как описано на фиг.3. Данные представляют собой средние значения ± SEM (n=3).

Фиг.6: Идентификация серина 612 IRS-1 как мишени PKC и анализ взаимодействия с p85 с применением поверхностного плазмонного резонанса.

(A) 0,5 мкг rIRS-1^449-664 выдерживали с 0,5 мкг различных PKCs в течение 30 минут при 30°C и подвергали иммуноблоттингу с антителом против фосфосерина 612. Показан репрезентативный эксперимент. (B) Связывание p85 с иммобилизированными пептидами, соответствующими аминокислотам 605-615 из IRS-1 с фосфотирозином 608 или (C) без фосфотирозина с применением поверхностного плазмонного резонанса (pY608-DDGpYMPMSPGV и Y608-DDGYMPMSPGV). Используемые концентрации белка p85 составляли (снизу вверх): 1, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 нМ. (D) Ингибирование связывания p85 за счет конкуренции с растворимыми пептидами pY608-DDG pYMPMSPGV или (E) pY608-pS612-DDGpYMPMpSPGV. Растворимые пептиды также иммобилизировали на чипе. (F) Полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC50) получали путем построения графика ответа SPR в равновесии (440 с после инжекции) по отношению к логарифму концентрации пептида. IC50 для pY608: 0,26 мкмоль/л, 16,56 мкмоль/л и для pY608-pS612: 0,15 мкмоль/л, 2,88 мкмоль/л.

Фиг.7: Анализ HPLC трипсиновых фосфопептидов, полученных из rIRS-1^449-664, фосфорилированных с помощью PKC- .

Пять наномолей rIRS-1^449-664 фосфорилировали в течение 60 минут с применением 0,5 нмоль PKC- . Белки разделяли с помощью SDS-PAGE, и отделенный rIRS-1 ^449-664 расщепляли трипсином. Восстановленную ³²P-радиоактивно меченую смесь пептида разделяли с помощью ионобменной (A) и C18 обратнофазной HPLC (B). Радиоактивность собранных фракций определяли с помощью счета со счетчиком Черенкова. После обратнофазной HPLC радиоактивные фракции анализировали с помощью масс-спектрометрии.

Фиг.8: Спектры ESI-MS/MS фосфопептида 352-378.

(A) Потеря фосфорной кислоты исходным ионом [M+4H]⁴⁺=818,11, указывающая на фосфорилирование. (B) Дефосфорилирование фрагментного иона b₉ и b₁₀, указывающее на сайт фосфорилирования.

Фиг.9: анализ HPLC трипсиновых фосфопептидов rIRS-1 ^449-664 и мутантов S570A и S612A.

Показан анализ HPLC трипсиновых пептидов, полученных из rIRS-1 ^449-664 дикого типа (A), rIRS-1^449-664 S570A (B) и rIRS-1^449-664 S612A (C), фосфорилированных рекомбинантным PKC- . Представлены репрезентативные профили HPLC.

Фиг.10: Функциональный анализ серина 570 и серина 612.

(A) rIRS-1 ^449-664 и обозначенные мутанты предварительно выдерживали с PKC- и подвергали фосфорилированию тирозина с помощью IR и взаимодействия с p85 , как отмечено на фиг.5. Показаны репрезентативные Вестерн-блоттинги. (B) Вестерн-блоты подвергали количественному анализу с применением программного обеспечения Lumi Imager, и данные выражены относительно стимулируемого инсулином контрольного значения, принятого за 100%. Результаты представляют собой средние значения ± SEM (n=3).

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Результаты Секвенирования фосфопептидов rIRS1 449-664
Аминокислотная последовательность идентифицированного фосфопептида	Аминокислоты в rIRS1449-664 b	Фосфорилированный остаток	пикc	Доля 32р (%) d
VAHTPPARGEEELSNYICMGGK (SEQ ID NO:12)	233-254		4 и 2
GASTLTAPNGHYILSR (SEQ ID NO:13)	255-270		2	20,7
YIPGATMGTSPALTGDEAAGAADLDNR (SEQ ID NO:9)	277-303	S286	5 и 6	10,6
THSAGTSPTISHQK (SEQ ID NO:10)	308-321		1	12,9
TPSQSSVVSIEEYTEMMPAAYPPGGGSGGR (SEQ ID NO:11)	322-351		3	21,2
LPGYRHSAFVPTHSYPEEGLEMHHLER (SEQ ID NO: 8)	352-378	S358	4	18,8
GGHHRPDSSNLHTDDGYMPMSPGVAPVPSNR (SEQ ID NO:14)	380-410		2	20,7
VDPNGYMMMSPSAAAS (SEQ ID NO:15)	441-456		2	20,7
a Трипсиновые пептиды rIRS-1449-664 анализировали с помощью масс-спектрометрии после анионообменной HPLC и обратнофазной HPLC. Фосфорилированные остатки серина выделены полужирными буквами. b Нумерация в соответствии с составленной последовательностью глютатионовой S-трансферазы плюс IRS-1, аминокислоты 449-664. c Пики анионообменной хроматографии HPLC (номера) (см. фиг.7A). d Общее количество радиоактивности, включенной в идентифицированные фосфопептиды, принимали за 100%, и данное процентное соотношение представляет собой интегрированную область пика.