способ получения средства, обладающего гепатопротекторным, желчегонным, гипохолестеринемическим и ранозаживляющим действием
Классы МПК: | A61K36/185 Magnoliopsida (двудольные) A61P1/16 для лечения печени или расстройств желчного пузыря, например противогепатитные средства, желчегонные средства, средства, способствующие растворению конкрементов A61P3/06 средства против повышенного содержания жира в крови (гиперлипемии) A61P17/02 для обработки ран, язв, ожогов, шрамов, келоидов или подобных заболеваний |
Автор(ы): | Симонян Ашот Вагаршакович (RU), Саламатов Александр Александрович (RU), Аванесян Ануш Ашотовна (RU), Новочадов Валерий Валерьевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2007-05-02 публикация патента:
27.11.2008 |
Изобретение относится к медицине. Проводят экстрагирование шрота после получения сока яблок водой при температуре 80-90°С, при соотношении сырье - экстрагент 1:5 и кратности экстракции, равной 5. Объединенные водные извлечения сгущают досуха и получают целевой продукт с выходом 32% по отношению к массе исходного сырья. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 7 табл.
Формула изобретения
Способ получения средства, обладающего гепатопротекторным, желчегонным, гипохолестеринемическим и ранозаживляющим действием путем экстракции шрота яблок, полученного после получения сока яблок, водой при температуре 80-90°С, соотношений сырье - экстрагент 1:5 и 5-кратной экстракции и сгущения извлечений.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к получению лечебно-профилактических средств из пищевого растительного сырья.
Технический результат изобретения заключается в разработке способа получения средства, обладающего одновременно гепатопротекторным, желчегонным, гипохолесте-ринемическим и ранозаживляющим действием.
Известны способы получения отдельно желчегонного средства фламин из соцветий бессмертника песчаного и отдельно гепатопротекторного средства силибор из семян расторопши пятнистой [1, 2].
Фламин получают из соцветий бессмертника песчаного экстракцией водой при температуре 60-70°С. Полученный экстракт сгущают, обрабатывают 5 объемами этанола, отстаивают, декантируют раствор с осадка, разбавляют водой и извлекают смесью этилацетат - этанол (9:1). Органическую фазу удаляют, остаток сушат и получают целевой продукт с выходом 4-5% по отношению к массе исходного сырья [1]. Однако данный способ трудоемок, не обеспечивает достаточно высокого выхода, ограничен из-за дефицита сырьевой базы (острая нехватка соцветий бессмертника), в процессе используется токсичный, взрывоопасный и дорогостоящий растворитель - этилацетат. Кроме того, данный лекарственный препарат характеризуется только желчегонной активностью.
Силибор получают экстракцией семян расторопши пятнистой 80% этанолом с последующим сгущением и растворением осадка в 50% этаноле. Полученный раствор последовательно обрабатывают тетрахлорметаном, затем смесью хлороформ-этанол в соотношении 2:1. Хлороформно-этаноловые извлечения сгущают, органическую фазу удаляют, остаток сушат. Получают целевой продукт с выходом 4,5-5% по отношению к массе сырья [2]. Однако данный способ не обеспечивает высокого выхода целевого продукта, в процессе используется только нативное сырье, запасы которого ограничены, а также токсичные растворители - тетрахлорметан, хлороформ. Кроме того, данное лекарственное средство, получаемое этим способом, обладает лишь гепатопротекторным действием.
Целью изобретения является расширение спектра фармакологического действия целевого продукта, обладающего одновременно гепатопротекторным, желчегонным, гипо-холестеринемическим и ранозаживляющим действием, повышение его выхода, исключение использования органических и токсичных растворителей, использование в качестве сырья отечественных промышленных отходов - шрота свежих яблок после получения яблочного сока.
Поставленная цель достигается экстракцией сырья (шрота яблок) водой при температуре 80-90°С, соотношение сырье - экстрагент 1:5 и 5-кратной экстракции. Объединенные водные извлечения сгущают досуха и получают целевой продукт.
Способ получения целевого продукта поясняется следующими конкретными примерами выполнения.
Примеры. К 1 кг сухого шрота яблок добавляют от 3-кратного до 7-кратного количества (по объему) воды и выдерживают при температуре от 60°С до 100°С в течение от 40 до 80 мин, при кратности процесса экстрагирования от 1 до 7.
Результаты исследований по влиянию некоторых факторов на выход целевого продукта приведены в сводной таблице 1.
Таблица 1 | ||||
Влияние регулируемых факторов на выход целевого продукта | ||||
Соотношение сырье - экстрагент, кг:л | Кратность извлечения | Температурный режим, °С | Продолжительность извлечения, мин | Выход, % |
1:3 | 5 | 80 | 60 | 27 |
1:4 | 5 | 80 | 60 | 30 |
1:5 | 5 | 80 | 60 | 32 |
1:6 | 5 | 80 | 60 | 32 |
1:7 | 5 | 80 | 60 | 32 |
1:5 | 1 | 80 | 60 | 16 |
1:5 | 2 | 80 | 60 | 24 |
1:5 | 3 | 80 | 60 | 28 |
1:5 | 4 | 80 | 60 | 30 |
1:5 | 5 | 80 | 60 | 32 |
1:5 | 6 | 80 | 60 | 32 |
1:5 | 7 | 80 | 60 | 32 |
1:5 | 5 | 60 | 60 | 27 |
1:5 | 5 | 70 | 60 | 30 |
1:5 | 5 | 80 | 60 | 32 |
1:5 | 5 | 90 | 60 | 32 |
1:5 | 5 | 100 | 60 | 32 |
1:5 | 5 | 80 | 40 | 26 |
1:5 | 5 | 80 | 50 | 30 |
1:5 | 5 | 80 | 60 | 32 |
1:5 | 5 | 80 | 70 | 32 |
1:5 | 5 | 80 | 80 | 32 |
Острая токсичность целевого продукта изучалась на белых крысах массой 180-190 г при его пероральном введении в 3 мл водного раствора [3]. Максимальная доза целевого продукта, возможная для введения, составила 5000 мг/кг массы тела животного и не вызывала их гибели, что позволило считать LD50>5000 мг/кг. Согласно классификации токсичности по К.К.Сидорову [4], исследуемую субстанцию следует отнести к группе практически нетоксичных веществ.
Гепатопротекторная активность целевого продукта исследовалась на белых крысах с экспериментальным хроническим гепатитом, вызванным 3-хразовым пероральным введением через день тетрахлорметана по 0,3 мл на 100 г массы тела в 50% масляном растворе [5]. Исследуемый продукт вводили перорально в дозе 75 мг/кг в виде водного раствора в течение 12 дней. Первое введение производили за 6 дней до начала введения тетрахлорметана. Аналогичным образом вводили в терапевтической дозе препарат сравнения - официнальное гепатозащитное средство силибинин [6]. В сыворотке крови животных определяли общий билирубин, триглицериды, щелочную фосфатазу и аланинаминотрансферазу, а в тканях печени - гликоген и общие липиды [7, 8].
Результаты опытов обрабатывали методом вариантной статистики.
Введение животным с токсическим гепатитом целевого продукта обусловило существенное восстановление нарушенных показателей: снижение в крови повышенного уровня общего билирубина на 31,7% (р<0,001), триглицеридов на 36,6% (р<0,001), аланинаминотрансферазы на 50% (р<0,01), щелочной фосфатазы на 45% (р<0,001), а также уменьшение в ткани печени общих липидов на 54,3% (р<0,05) и увеличение гликогена на 159% (р<0,001). Этот эффект находился на уровне или превышал действие официнального гепатозащитного средства силибинина.
Желчегонное действие целевого продукта исследовано в опытах in vivo на белых крысах в острых опытах по методу Литвинчук М.Д. и Новосилец З.И. [9]. В трехчасовых порциях собранной желчи определяли содержание холестерина и желчных кислот [10]. Целевой продукт в дозе 75 мг/кг в 2 мл воды вводили в желудок крысе за 30 мин перед опытом. В аналогичных условиях исследовали препараты сравнения - официнальное желчегонное средство фламин в терапевтической дозе [6]. Контролем служили опыты, в которых животным вводили воду (табл.2).
Таблица 2 | ||||
Желчегонное действие целевого продукта | ||||
Условия опыта | Количество животных | Количество желчи за 3 часа опыта (мл); М±m; п; р; % изм. к контр. | Желчные кислоты (г/л) М+m; п; р; % изм. к контр. | Холестерин желчи (г/л) М±m; п; р; % изм. к контр. |
Крысы, получавшие воду (контроль) | 11 | 1,7±0,1 | 5,32±0,47 | 0,34±0,02 |
Крысы, получавшие извлечение из яблок | 7 | 3,0±0,04 р<0,01; +76,0% | 4,28±0,16 р<0,01; -20,0% | 0,38±0,02 р<0,05; +12,2% |
Крысы, получавшие фламин | 6 | 2,0±0,06 р<0,05; +17,6% | 2,85±0,01 р<0,001; -46,5% | 0,22±0,04 р<0,01; -35,3% |
Как видно из данных табл.2, извлечение из яблок обладает значительной желчегонной активностью: по сравнению с контролем желчевыделение усиливается на 76% (р<0,001). Этот эффект превышает аналогичное действие фламина.
Исследование гипохолестеринемического действия целевого продукта проводили на белых крысах, у которых экспериментальная гиперхолестеринемия вызывалась внутрибрюшинным введением твина-80 в дозе 200 мг на 100 г массы тела животного [11]. Одновременно с твином-80 опытным животным перорально вводили в объеме 1 мл целевого продукта в дозе 75 мг/кг. Контрольные животные в аналогичных условиях получали 1 мл воды. В качестве препаратов сравнения использовались официнальные гипохолестеринемические средства: цетамифен, полиспонин и сапарал, вводимые в терапевтических дозах [6], в аналогичных условиях. У всех животных, а также в группе интактных крыс исследовалось содержание в сыворотке крови общего холестерина [7]. Результаты опытов обрабатывались методом вариантной статистики и приведены в таблице 3.
Таблица 3 | ||||
Гипохолестеринемическая активность целевого продукта | ||||
Условия опыта | Количество животных | Холестерин сыворотки крови (ммоль/л) | ||
M±m | р | % изм. к контр. | ||
Интактные животные | 10 | 2,0±0,07 | ||
Животные с гиперхолестеринемией, получавшие воду (контроль) | 10 | 2,99±0,07 | ||
Животные с гиперхолестеринемией, получавшие целевой продукт | 8 | 1,89±0,15 | 0,001 | -37,6 |
Животные с гиперхолестеринемией, получавшие воду (контроль) | 10 | 3,12±0,07 | ||
Животные с гиперхолестеринемией, получавшие полиспонин | 8 | 2,4±0,02 | 0,001 | -23,2 |
Животные с гиперхолестеринемией, получавшие воду (контроль) | 10 | 2,9±0,17 | ||
Животные с гиперхолестеринемией, получавшие цетамифен | 9 | 2,35±0,12 | 0,05 | -19,5 |
Животные с гиперхолестеринемией, получавшие воду (контроль) | 10 | 3,01±0,18 | ||
Животные с гиперхолестеринемией, получавшие сапарал | 10 | 2,39±0,1 | 0,05 | -20,4 |
Из данных таблицы 3 видно, что под влиянием целевого продукта у животных с гиперхолестеринемией уровень холестерина в крови снижался на 37,6% (р<0,001), тогда как под влиянием полиспонина - на 23,2% (р<0,001), цетамифена - на 19,5% (р<0,05), сапарала - на 20,4% (р<0,05).
Исследование ранозаживляющей активности целевого продукта, после термического ожога, проведено на 12 нелинейных крысах обоего пола в возрасте 80 суток. В качестве препарата сравнения использовали левомеколь, обладающий противомикробным и противовоспалительным действием, традиционно применяемый при лечении гнойных ран.
Для оценки результатов эксперимента был использован комплексный критерий определения эффективности заживления ожогов у экспериментальных животных. Данный критерий представляет собой совокупность трех адекватных методов исследования, показатели которых отражают различные стороны течения раневого процесса и обеспечивают наиболее достоверную и максимально объективную оценку процесса заживления.
Первый метод основан на исследовании характера заживления раны. Для этого были проведены гистологические исследования ожоговых поверхностей. Срезы кожи, полученные на 3-и, 7-е и 14-е сутки эксперимента, помещали в 10% раствор формалина с последующим экспериментом по стандартной методике и окраской гематоксилином и эозином, позволяющим определить влияние терапии на процессы репарации.
В результате проведенных исследований установлено, что заживление ожоговой поверхности происходит при применении целевого продукта и левомеколя, а также в контрольной группе животных, не получавших лечение. Однако наиболее быстро признаки начала краевой эпителизации, уже на 3-й сутки, наблюдались при применении целевого продукта. На 14-е сутки зарегистрированы пикообразные разрастания эпителия при практически полном смыкании ожогового дефекта. Под эпителизированными участками наблюдались разрастания соединительной ткани. У животных контрольной группы, а также группы сравнения, в меньшей степени, наблюдалась выраженная клеточно-лейкоцитарная инфильтрация, что приводило к удлинению сроков эпителизации и заживления раны по сравнению с животными опытной группы. Также было отмечено, что при использовании левомеколя эпителизация происходила с элементами патологической регенерации, проявляющейся в виде роста эпителия вокруг волосяного фолликула.
Бактериологические исследования позволяют оценить динамику заживления ран путем определения наличия микрофлоры в составе раневого отделяемого и ее качественной оценки. Количественный и видовой состав микрофлоры поверхности раны изучали путем посева смывов с поверхности раны на дифференциально-диагностические среды, после применения соответствующего лечения (табл.4). В качестве контроля использовали 8 смывов с ожоговых поверхностей, не подвергшихся лечению.
Таблица 4 | ||
Среды и условия культивирования, применявшиеся для изучения бактериальной обсемененности ожоговой поверхности | ||
Микроорганизмы | Среда | Условия культивирования |
Энтеробактерии | Эвдо | 24 ч, аэробное, +37°С |
Стафилококки | Желточно-солевой агар | 48 ч, аэробное, +37°С |
Дрожжеподобные грибы | Сабуро | 48 ч, аэробное, +30°С |
Общая микробная обсемененность | Мясо-пептонный агар; Кровяной агар 5% | 48 ч, аэробное, +37°С |
При исследовании микробиоценоза поверхности раны учитывали: общее количество микрофлоры; микроорганизмы сем. Enterobacteriaceae; стафилококки; грибы рода Candida; оценивали частоту встречаемости отдельных видов микроорганизмов, в зависимости от биотопа и применяемых препаратов для лечения ожогов, плотность бактериальной обсемененности в динамике на 7 и 14-е сут лечения ожогов с учетом индекса доминирования.
Основные представители, высеваемые с поверхностного слоя раны, - стафилококки (табл.5). При оценке биоценозов поверхностей раны особое значение уделяют сообществу стафилококков, являющихся доминирующими. Наибольший удельный вес среди стафилококков принадлежит S. saprophyticus, S. epidermidis, S. aureus.
Таблица 5 | ||||
Частота встречаемости экологических групп микроорганизмов в микробиоценозе раневой поверхности у крыс | ||||
Биотоп | Экологические группы, % | |||
Staphylococcus | Streptococcus | Enterobacteriaceae | Грибы рода Candida | |
Контроль | 100,0 | 37,5 | 87,5 | 75,0 |
Целевой продукт | 75,0 | 12,5 | 25,0 | 25,0 |
Левомеколь | 87,5 | 25,0 | 62,5 | 37,5 |
Анализ доминантности стафилококков показал, что на поверхности ожога контрольной группы доминировали золотистый (54,8) и эпидермальный (с гемолитическими свойствами) стафилококки (41,8) (табл.6).
Таблица 6 | |||
Степень доминантности видов стафилококков в структуре сообщества различных биотопов ожоговой поверхности | |||
Биотоп | Вид стафилококков, % | ||
S. saprophyticus | S. epidermidis | S. aureus | |
Контроль | 3,4 | 41,8 | 54,8 |
Целевой продукт | 23,6 | 45,9 | 30,5 |
Левомеколь | 23,6 | 31,3 | 45,1 |
Наибольшая численность эпидермального и сапрофитного стафилококков при применении целевого продукта свидетельствует о его положительном влиянии на раневую поверхность, тогда как на обрабатываемых левомеколем биотопах доминировал золотистый стафилококк (45,1%), осложняющий течение раневого и ожеговых процессов и обуславливающий гнойные осложнения. Из данных табл.6 видно, что из 3-х образцов наименьшее содержание стафилококка золотистого в ранах, обрабатываемых целевым продуктом, что также оказывает положительный эффект на заживление ожоговых поверхностей.
При изучении общей бактериальной обсемененности в динамике установлено, что к 14 суткам эксперимента целевой продукт способствует снижению данного показателя, в отличие от левомеколя. Несмотря на тенденцию в уменьшении микробной плотности на всех биотопах выраженность этого процесса была неодинакова. Наиболее значительная положительная динамика наблюдалась при изучении микробной плотности поверхности раны, подвергнутой лечению целевьм продуктом, - снижение со 139,4±18,9 до 119,7±10,7 КОЕ/см2 . Снижение плотности микробных ассоциаций в динамике на 7 и 14-е сут зафиксировано также на раневых поверхностях, не подвергавшихся лечению, и после применения левомеколя с 254,9±34,5 до 230,2±22,2 КОЕ/см2 и с 200,2±25,5 до 185,2±16,54 КОЕ/см2 соответственно.
Третий критерий - динамика уменьшения площади кожного дефекта (на 3-й, 7-ые и 14-ые сутки эксперимента), из расчета на начало лечения - 0% заживления (табл.7).
Таблица 7 | |||
Площадь кожной раны (% от площади ожога) | |||
Серия | 3 сут | 7 сут | 14 сут |
Контроль (без лечения) | 85,0* | 45,8 | 36,9 |
Целевой продукт | 52,0 | 36,0 | 25,5 |
Левомеколь (препарат сравнения) | 94,5 | 62,1 | 26,7 |
*В ранние сроки в контрольной группе всегда наблюдается стягивание поверхности раны, что приводит к уменьшению площади раны на 10-15% |
Как видно из таблицы 7, использование целевого продукта приводит к более выраженному уменьшению площади кожной раны по сравнению с контрольной группой и животными, получавшими левомеколь.
Таким образом, целевой продукт обладает достаточно выраженной ранозаживляющей активностью, его использование ускоряет процессы эпителизации, приводит к значительному уменьшению площади раны на 3 сутки и отчетливому снижению микробной плотности раневой поверхности.
Приведенные результаты позволяют заключить, что целевой продукт - водное извлечение из шрота яблок - характеризуется отчетливым гепатопротекторным, желчегонным, гипохолестеринемическим, противоожоговым и ранозаживляющим действием в сочетании с низкой токсичностью и может быть предложен в качестве лечебно-профилактического средства.
Таким образом, заявляемый способ позволяет получить полифункциональное средство, характеризуещееся гепатопротекторным, желчегонным, гипохолестеринемическим, ранозаживляющим действием, что обеспечивает перспективность его применения в качестве лечебно-профилактического средства. При этом повышается специфическая активность по сравнению с силибором, фламином, цетамифеном, сапаралом, левомеколем. Выход целевого продукта по заявленному способу в 7-8 раз выше силибора и фламина. Обеспечивается и упрощение процесса получения целевого продукта, при этом исключается использование дефицитного сырья.
ЛИТЕРАТУРА
1. Авторское свидетельство СССР №587940. Опубл. 15.01.78. Бюлл. №2.
2. Авторское свидетельство СССР №2436409. Опубл. 25.04.78. Бюлл. №15.
3. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ. Москва, 1985.
4. Сидоров К.К. Методы определения острой токсичности и опасности химических веществ (токсиметрия). Медицина, Москва, 1970.
5. Саркисов Д.С., Ремезов П.И., Воспроизведение болезней человека в эксперименте. М., 1960.
6. М.Д.Машковский. Лекарственные средства. Москва, ООО «Новая Волна», 2004.
7. Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. Минск, 1982.
8. Методы исследования химии и обмена углеводов и липидов (ЦОЛИУВ). М., 1962.
9. Литвинчук М.Д., Новосилец З.И. Бюлл. экспер. биол. и медицины, 1980, №6, с.750-752.
10. Мирошническо В.П. Исследование холято-холестериновой функции печени при вирусном гепатите и холеимазе новым методом фотометрического анализа (дисс.). Запорожье, 1978.
11. Поляков Э.Д., Климова М.А. Пат. физиология и экспер. терапия, 1973, №1, с.74-77.
Класс A61K36/185 Magnoliopsida (двудольные)
Класс A61P1/16 для лечения печени или расстройств желчного пузыря, например противогепатитные средства, желчегонные средства, средства, способствующие растворению конкрементов
Класс A61P3/06 средства против повышенного содержания жира в крови (гиперлипемии)
Класс A61P17/02 для обработки ран, язв, ожогов, шрамов, келоидов или подобных заболеваний