штамм бактерий bacillus subtilis, используемый для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis НИИ ККМ ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», В-1149, используемый для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к защите растений от поражения фитопатогенными грибами и бактериями.

Известен ряд штаммов бактерий рода Bacillus, являющихся антагонистами различных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. Например, известен штамм Bacillus subtilis B-40, обладающий противогрибковой активностью (Патент РФ №2094990, кл. А01N 63/00, опубл. 10.11.97). Штамм выделен из почвы Средней полосы России, сильно подавляет рост гриба Fusarium graminearum - возбудителя корневой гнили злаков. Недостатком известного штамма является узкий спектр действия только в отношении фитопатогенных грибов.

Известен штамм Bacillus subtilis 1C-5, обладающий противогрибковой активностью (Патент РФ №2086128, кл. А01N 63/00, опубл. 10.08.97). Штамм выделен из почвы Новосибирской области и обладает антагонистической активностью в отношении возбудителей сухой гнили. Однако данный штамм оказывает ограниченное действие, направленное на отдельных грибковых возбудителей болезней различных сельскохозяйственных культур.

Известен штамм В. subtilis M 22, используемый против возбудителей бактериозов растений, преимущественно томатов (Патент РФ №2084152, кл. А01N 63/00, опубл. 20.07.97). Недостатком известного штамма является узкий спектр действия только в отношении фитопатогенных бактерий.

Наиболее ближайшим к заявляемому штамму - прототипом является штамм Bacillus subtilis ИМП-215, являющийся продуцентом бактофита - препарата для защиты от мучнистой росы огурцов, вертициллезного вилта хлопчатника, корневых гнилей овощных и зерновых культур ("Проблемы создания и применения микроорганических средств защиты растений", M., 1989, с.253, 257-295. Недостатком указанного штамма является его недостаточно высокая эффективность против фитопатогенных бактерий.

Технической задачей изобретения является выделение штамма бактерий с широким спектром действия против фитопатогенных грибов и бактерий и устойчивого к неблагоприятным факторам внешней среды.

Поставленная техническая задача достигается выявлением нового штамма Bacillus subtilis B-14. Новый штамм выделен из рыхлой целинной почвы (выщелаченный чернозем) Ордынского района Новосибирской области.

Основными критериями отбора служили нетребовательность к питательным средам и подавление роста основных фитопатогенов с/х культур в лабораторных и полевых условиях. Идентификацию штамма проводили по «Краткому определителю бактерий Берджи (изд. «Мир», Москва, 1980).

Выделенный штамм Bacillus subtilis B-14 задепонирован в НИИ «Коллекция культур микроорганизмов» ГНЦ ВБ «ВЕКТОР» под регистрационным номером В-1149. Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии.

Штамм Bacillus subtilis B-14 характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками.

Клетки - грамположительные, аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. Клетки подвижны, образуют аэробно эндоспоры, через 18-20 ч роста на МПА в мазках культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки с закругленными краями размером 1,9×0,5 мкм, расположенные одиночно, попарно или в виде цепочек. Хорошо образуют эндоспоры на картофельном агаре. Околоспоральных включений не обнаружено.

Оптимальная температура роста 28-30°С, растет при 5°С и не растет при 45°С. Хорошо растет в пределах рН среды от 6,5 до 7,5. Устойчив к NaCl до 2% концентрации.

При культивировании штамма на питательных средах, содержащих мясо-пептонный агар (МПА), при 30°С через 18-20 ч образуются крупные овальные колонии (до 10 мм), которые сначала блестящие, вязкие светло-телесного цвета, затем становятся шершавыми, складчатыми и белесыми.

Физиолого-биохимические свойства.

Культура ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа, гидролизует крахмал, желатину, утилизирует цитрат. Не растет в анаэробных условиях, не образует индол, сероводород.

Продуцирует индол-уксусную кислоту (ИУК) в умеренных количествах по сравнению с прототипом, обладает меньшей способностью к стимуляции роста растений, но большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям.

Штамм устойчив к новобиоцину (до 100 мкг/мл) и чувствителен к тетрациклину (50 мкг/мл), ампициллину (100 мкг/мл), рифамницину (50 мкг/мл), канамицину (50 мкг/мл).

Штамм Bacillus subtilis В-14 не обладает инфекционным и общетоксическим действием. Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля и некротических пятен на листьях табака при нанесении на них уколом суспензии живых клеток штамма.

Для культивирования штамма Bacillus subtilis В-14 применяют простые и сложные питательные среды, например среду LB следующего состава, г/л: пептон - 10,0, дрожжевой экстракт - 5,0, натрий хлористый - 10,0, вода - до 1 л.

Культивирование проводят при 28-30°С в течение 24-36 часов до достижения плотности культуры (титра клеток) 10 ¹⁰-10¹¹ клеток на мл. Полученную суспензию разводят до титра 10⁶-10 ⁷ кл/мл и используют для защиты растений от фитопатогенов.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от прототипа является более широкий спектр действия на возбудителей грибковых и бактериальных заболеваний растений.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение биомассы.

Перед началом работы клетки штамма Bacillus subtilis В-14 пересевают на агаризованную среду, помещают в термостат при 28°С. После 24-30 часовой инкубации подросшие клетки смывают фосфатным буфером (рН 7,2) или физраствором, переносят в колбы с LB-бульоном и проводят культивирование при 30°С с аэрацией при перемешивании в течение 24 часов. Полученную биомассу центрифугируют и суспендируют в этом же буфере до достижения плотности суспензии (5-9)·10 ¹⁰ жизнеспособных клеток/мл суспензии. Полученную суспензию используют как препарат против фитопатогенных микроорганизмов.

Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Bacillus subtilis В-14.

Культуру бактерий высевали сплошным «газоном» на поверхность питательного агара (среда LB) и выращивали при 28°С в течение 2-3 суток. Затем вырезали диски агаризованной среды (агаровые блочки) с культурой нового штамма и размещали на сплошной «газон» тест-культуры. Для получения сплошного «газона» среду Чапека или картофельный агар засевали глубинным способом тест-культурой из расчета около 100 спор на мл среды. Чашки со сплошным «газоном» тест-культуры с нанесенными на него агаровыми блочками с клетками нового штамма Bacillus subtilis В-14 помещали в термостат при 28-30°С на 3-6 суток. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста гриба или бактерии вокруг диска с клетками штамма. Результаты приведены в табл.1. Из таблицы 1 видно, что новый штамм Bacillus subtilis В-14 оказывает антагонистическое действие относительно широкого спектра фитопатогенных грибов и бактерий.

Пример 3.

В производственных условиях ЗАО «Раздольное» Коченевского района Новосибирской области изучили влияние препарата на основе суспензии клеток нового штамма Bacillus subtilis В-14 на снижение степени поражения сортов пшеницы Алтайская 98 и Омская 18 корневыми гнилями. Для этого провели предпосевную обработку семян из расчета: 50 мл суспензии клеток предлагаемого штамма (титр 10¹⁰ клеток/мл) на 1000 кг зерна. Контрольные семена пшеницы обрабатывали водой. В качестве препаратов для сравнения использовали препарат бинорам (эталон) и препарат Дивидент стар.

Результаты влияния обработки семян пшеницы различными препаратами на проявление корневых гнилей, образование вторичной корневой системы, кустистость и урожайность пшеницы в деляночных опытах (средние результаты 5 деляночных опытов за 16.06.2006 г., фаза кущения) представлены в табл.2.

Из таблицы 2 видно, что обработка семян пшеницы суспензией нового штамма позволяет снизить развитие корневых гнилей у растений пшеницы в 9 раз, а также уменьшить количество зараженных зерен после уборки урожая в 4 раза.

Пример 4.

В производственных условиях ОГУП «Красносибирское» Кочковского района Новосибирской области изучили влияние препарата на основе суспензии клеток нового штамма Bacillus subtilis В-14 на снижение степени поражения сортов пшеницы Контегирская 89 корневыми гнилями. Для этого провели предпосевную обработку семян из расчета: 50 мл суспензии клеток предлагаемого штамма (титр 10¹⁰ клеток/мл) на 1000 кг зерна. Контрольные семена пшеницы обрабатывали водой. В качестве препаратов для сравнения использовали химический фунгицид Виалл-ТТ, препарат бинорам (эталон) и препарат Бактофит (прототип). Дата учета 07.07.2005 г., фаза развития конец выхода в труппку - начало колошения.

Результаты влияния обработки семян пшеницы различными препаратами на проявление корневых гнилей, образование вторичной корневой системы и кустистость в полевых условиях представлены в табл.3.

Из таблицы 3 видно, что обработка семян пшеницы суспензией нового штамма позволяет снизить развитие корневых гнилей у растений пшеницы в 5-7 раз.

Пример 5.

В производственных условиях ОАО «Ярковское» Новосибирской области изучили влияние препарата на основе суспензии клеток нового штамма Bacillus subtilis В-14 на снижение степени поражения бактериозом капусты в условиях естественного фитопатогенного фона.

Рассаду капусты сорта «Белорусская» обрабатывали суспензией штамма Bacillus subtilis В-14 с плотностью 10 ⁷ клеток/мл при средней инокуляционной нагрузке 10 ⁶ клеток на одно растение. Повторная обработка - через месяц. Контрольные растения капусты обрабатывали водой. В качестве препаратов сравнения использовали препарат бинорам (эталон) и ТМТД. Через два месяца, в фазу проявления бактериоза, проводили учет заболеваемости растений.

Двойная обработка капусты штаммом Bacillus subtilis В-14 привела к снижению заболевания капусты бактериозом в естественных условиях на 60-65% и увеличению урожая на 30-35%.

Таким образом, предлагаемый штамм Bacillus subtilis НИИ ККМ ГНЦ ВБ «ВЕКТОР» В-1149 позволяет подавлять широкий спектр фитопатогенных микроорганизмов и может быть использован в сельском хозяйстве для повышения урожая злаковых культур и других растений.

Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий.

Таблица 1
Тест - культуры	Радиус зоны подавления роста тест - культуры (мм)
Фитопатогенные грибы
Alternaria alternata	18-22
Alternaria solani	20-22
Botrytis sinerea	14-16
Bipolaris sorokiniana	22-24
Fusarium oxysporum	12-13
Fusarium graminearum	12-14
Fusarium oxysporum (люпин)	10-11
Rhizoctonia solani	13-14
Бактерии
Ervinia carotovora	20-24
Pseudomonas cepacia	10-12
Pseudomonas syringae	10-12
Xanthomonas campestris	20-24
Xanthomonas phaseol	20-22

Таблица 2 Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий.
Сорт пшеницы	Обработка семян	Высота растений (см)	% вторичных корней	Кустистость	Корневые гнили (распространение/развитие, %)	Масса зерна с 1 кв.м. (при уборке урожая в сентябре, г)	Процент зараженных зерен по результатам фитоанализа после уборки урожая
«Алтайская-98»	без обработки	28-32	Нет	1,2-1,3	78/50,5	200-215	40-50
«Алтайская-98»	Дивидент стар	30-35	3-5	1,0-1,1	76/48	190-200	30-35
«Алтайская-98»	Бинорам	39-40	50-70	1,4-1,6	27/12,5	280-350	15-20
«Алтайская-98»	Штамм Вас. subtilis В-14	38-39	50-60	1,4-1,5	20/5,5	300-350	10-12
Омская-18	без обработки	30-34	Нет	1,2-1,3	76/44
Омская-18	Дивидент стар	30-35	20-25	1,2-1,3	68/36
Омская-18	Бинорам	39-41	44-45	2,0-2,2	28/10,2
Омская-18	Штамм Вас.subtilis В-14	38-40	44-46	1,6-2,0	20/4,5

Таблица 3
№№ пп	Сорт пшеницы, площадь	Семена протравлены	Предшественник	Дата сева	Высота растения	Ширина листа	% вторичных корней	Кустистость	% корневых гнилей
1.	«Контегирская-89», 96 га	Виалл-ТТ	Пшеница 1-го года	25 мая	43-51 см	6-7 мм	100	1,2	53-58
2.	«Контегирская-89», 70 га	Бинорам	Пшеница 3-го года	31 мая	47-50 см	6-9 мм	100	1,55	12-16
3.	«Контегирская-89», 60 га	Бактофит	Пшеница 3-го года	31 мая	49-50 см	6-8 мм	100	1,35	26-28
4.	«Контегирская-89», 35 га	Штамм Вас. subtilis В-14	Пшеница 3-го года	31 мая	48-52 см	6-8 мм	100	1,35	8-10