способ спектрофотометрического определения концентрации липосомально инкапсулированных фармацевтических препаратов

Формула изобретения

Способ определения концентрации липосомально инкапсулированных фармацевтических препаратов цитостатиков гидрофильной природы, включающий разрушение липосомальных везикул и последующее измерение концентрации вышедшего в раствор цитостатика, отличающийся тем, что липосомальные везикулы разрушают добавлением к липосомальной суспензии, разбавленной 2М раствором хлорида натрия в соотношении 1:1, 3-кратного объема хлороформа, после чего пробы нагревают до 50-60°С, центрифугируют при 5000 g в течение 5 мин, концентрацию вышедшего в водную фазу цитостатика определяют спектрофотометрически.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области исследования и анализа различных веществ, в частности фармацевтических препаратов, и может быть использовано для определения концентрации исследуемого вещества при разработке новых сложных лекарственных форм с использованием спектрофотометрического метода.

Известен способ спектрофотометрического определения концентраций различных индикаторов в воде, в соответствии с которым водный раствор очищают от механических примесей и осветляют центрифугированием, полученный раствор разделяют на равные порции по числу определяемых индикаторов и в каждую порцию добавляют дополнительные реагенты для анализа соответствующих индикаторов, а количественное содержание отдельных индикаторов в исходной пробе определяют по результатам оптических измерений каждой приготовленной порции раствора относительно величины естественного уровня фона при длинах волн, характерных для исследуемых индикаторов, при этом анализ проводят по результатам трех оптических измерений каждой смеси и измерение концентрации отдельных индикаторов при их совместном присутствии в пробе воды осуществляют интерполяционным методом по результатам трех анализов - исходной пробы без добавки и исходной пробы с двумя добавками, сначала фиксированного количества исследуемого индикатора, затем фиксированного количества воды [1].

Недостатком способа является относительно узкая область применения.

Известен также способ, который заключается в дезинтеграции липосомальных везикул нагреванием до температуры 90-100°С [3].

Недостатком этого способа является относительно низкая точность, поскольку возникает обратная интеграция везикул при остывании смеси. В результате липосомальные везикулы и мицеллы формируются заново и часть препарата попадает обратно в липосомы, поэтому в водном растворе можно измерить лишь оставшуюся часть реальной концентрации препарата.

Заслуживает внимания способ осаждения липосом, нагруженных препаратом с помощью протамин сульфата, с последующим спектрофотометрическим определением неинкапсулированного вещества в полученном супернатанте [5].

Однако метод имеет существенные ограничения, связанные с возможностью соосаждения определяемого вещества.

Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому является способ, основанный на разрушении липидных везикул в водном растворе цитостатиков путем введения в него 0,05% раствора Тритон-100 и последующем флуориметрического измерения концентрации вышедшего в водный раствор препарата [4].

Недостатком метода является относительно низкая точность, вызванная образование различных мицеллярных форм определяемого препарата, что приводит к серьезным погрешностям в измерениях и вызывает трудности в интерпретации получаемых результатов. Кроме того, Тритон-100 обладает широким спектром поглощения и флуоресценции с несколькими максимумами. Способ имеет также относительно ограниченную область применения, поскольку фармпрепарат должен либо обладать собственным спектром флуоресценции в видимой области, либо быть окрашенным флуоресцентным красителем.

Требуемый технический результат заключается в расширении области применения и повышении точности.

Требуемый технический результат достигается тем, что в способе, основанном на разрушении липосомальных везикул и последующем измерении концентрации вышедшего в водный раствор препарата цитостатика, разрушение липидных везикул проводят путем введения трехкратного объема хлороформа с последующим нагревом и центрифугированием, а измерение концентрации вышедшего в водный раствор препарата производят фотометрическим методом.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что разрушение липидных везикул проводят в присутствии 2М раствора хлорида натрия в соотношении 1:1.

Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что нагрев перед центрифугированием проводят до 50-60°С.

Оптическую плотность вышедшего в водную фазу препарата определяют фотометрически по поглощению на спектрофотометре.

На графических изображениях представлены:

На фиг.1 - кривые выживаемости клеточной линии, чувствительной к воздействию препарат (фиг.1, а - липосомальная форма 1, фиг.1, б - липосомальная форма 2);

на фиг.2 - цитотоксичность липосомальных препаратов с доксорубицином Teva в сравнении с водной формой (гормононезависимая линия аденокарциномы MDA-MB-435S);

на фиг.3 - цитотоксичность липосомальных препаратов с гексопиранозидами ЛХС-1098аиЛХС-1110а.

Способ спектрофотометрического определения концентрации липосомально инкапсулированных фармацевтических препаратов осуществляется следующим образом.

При изготовлении липосомальных препаратов для загрузки водорастворимых фармпрепаратов применяется технология рН-градиента при инкубации на шейкерной платформе при +45°С в течение 30 мин с последующим охлаждением до +4°С. Для определения концентрации фармпрепарата, попавшего в липосомы и оставшегося внутри, липосомальные везикулы в присутствии 2М буферного раствора хлорида натрия в соотношении 1:1 разрушают (дезинтегрируют) добавлением в суспензию 3-кратного объема хлороформа, затем пробы нагревают до 50-60°С с последующим центрифугированием при 5000g в течение 5 мин.

Оптическую плотность вышедшего в водную фазу препарата определяют спектрофотометрически по поглощению на спектрофотометре, используя в качестве контроля водную фазу, полученную после проведения вышеописанных операций с липосомами без препарата.

Концентрация препарата рассчитывается по формуле Бугера-Ламберта-Бера [6]:

где А_{( )} - оптическая плотность (поглощение), нм;

l - оптический путь, см;

С_м - молярная концентрация вещества, выраженная в моль/л;

'Е - молярный коэффициент экстинкции, М^-1 см ^-1;

откуда С_M=А ₎/'El.

Способ дает возможность количественного определения веществ в двух- и мультикомпонентных системах, то есть, если липосомальный препарат включает не одно, а смесь действующих веществ. Тогда если компоненты препарата не вступают между собой в химические реакции, оптическая плотность раствора представляет собой сумму оптических плотностей компонентов и расчет концентраций компонентов А и В происходит при решении системы уравнений:

Откуда

Для некоторых веществ значения коэффициента экстинкции хорошо известны, и при измерениях нужно только точно воспроизвести условия, в которых они были получены. Для других веществ необходимо рассчитывать молярный коэффициент экстинкции. Это можно сделать, взяв точную навеску и приготовив раствор вещества с известной концентрацией С_cm. Рекомендуется снять спектр водного раствора с известной концентрацией вещества, а затем приступать к измерениям на длине волны, соответствующей одному из максимумов поглощения.

Молярный коэффициент экстинкции рассчитывается по формуле

'Е=A( )/С_cml

Или

где A_{( )} - оптическая плотность (поглощение), нм;

M_r - молекулярная масса вещества, моль;

m_в-ва - масса навески сухого вещества, г;

V_p-pa - объем раствора, л.

Закон Бугера-Ламберта-Бера [6] не выполняется в случаях, когда зависимость A_{( )} от С_M отклоняется от линейной. Для того чтобы расчет концентрации фармпрепаратов по результатам фотометрического измерения поглощения был правомерен, должны соблюдаться несколько условий:

а) измеряющий световой пучок является монохроматическим;

б) молекулы вещества распределены по всему объему равномерно (истинный раствор) и их количество в невозбужденном состоянии не меняется в ходе измерения;

в) молекулы вещества не изменяют характер взаимодействий между собой и с молекулами растворителя при определяемой концентрации;

г) ослабление выходящего светового пучка происходит только за счет поглощения фотонов, люминесценция, светорассеяние, отражение и т.д. не оказывают существенного влияния на регистрируемый выходящий поток;

д) измеряющий монохроматический пучок не приводит к фотохимическим превращениям молекул вещества (для фотодинамических агентов метод имеет ограничения).

В случае отклонений от закона Бугера-Ламберта-Бера необходимо строить градуировочные графики и рассчитывать относительную ошибку абсорбционного анализа. Например, соотношение между ошибками измерения оптической плотности ( А ) и пропусканием раствора вещества ( Т) выражается

Для оценки достоверности полученных данных с применением разработанного нами метода проводили контрольные измерения количества инкапсулированного в липосомы вещества с применение следующих методов.

1. Метод хроматографического разделения незагруженной в липосомы фракции вещества от включенного в липосомы препарата с последующим фотометрическим определением незагруженной фракции (пример 1).

2. Биологический тест, основанный на оценке цитотоксической активности инкапсулированного препарата (пример 2).

В зависимости от природы инкапсулируемого в липосому вещества (сродства к водной фазе) патентуемый метод определения предполагает возможность оценки концентрации широкого спектра соединений, обладающих различным индексом гидрофильно/гидрофобного баланса).

1. Для оценки соединений гидрофильной природы достаточным является количественное фотометрическое определение концентрации препарата в водной фазе, причем в широком диапазоне поглощения (220-620 нм).

2. Для оценки соединений гидрофобной природы достаточным является количественное фотометрическое определение концентрации препарата в органической фазе хлороформа, в диапазоне поглощения (330-620 нм).

3. Для оценки соединений амфифильной природы необходимо количественное фотометрическое определение концентрации препарата в обоих фазах, в диапозоне поглощения (330-620 нм).

Сужение диапазона длин волн, в которых можно проводить количественное определение концентрации вещества, обусловлено тем фактом, что липиды, стерины и жирные кислоты, входящие в состав липосом, также экстрагируются в органическую фазу применяемого растворителя и поглощают в диапазоне от 260 до 310 нм. Это может внести существенную ошибку в измерения и затруднить интерпретацию полученных результатов.

Во всех случаях необходимо проводить измерение контрольных образцов (липосом без препарата) по вышеприведенной схеме.

Пример 1. Определение содержания доксорубицина в липосомальных препаратах ССЛ-Доксорубицин и АТЛ-25-Доксорубицин

Для определения концентрации загруженного доксорубицина дезинтеграция липосомальных препаратов производилась добавлением 3-кратного объема хлороформа при нагревании до 60°С с последующим центрифугированием при 5000g в течение 5 мин. Это делали следующим образом: в 1,5 мл пробирки эппендорф разливали по 100 мкл образцов липосомальной суспензии, разбавленных 1:1 2М раствором NaCl и для контроля - по 100 мкл раствора доксорубицина известной концентрации в 2М растворе NaCl. Далее добавляли в пробирки по 300 мкл хлороформа (производитель - «Борис Авогадро»), нагревали до 60°С и центрифугировали при 5000 g.

где С_M - молярная концентрация вещества, выраженная в моль/л,

А₍₄₉₅₎ - оптическая плотность (поглощение) при 495 нм,

'Е - коэффициент экстинкции доксорубицина, равный 10650 М ^-1 см^-1,

l - толщина образца (оптический путь), см.

Результаты расчетов приведены в табл.1 в графе «Концентрация цитостатика, М».

В случае сложных лекарственных форм цитостатиков, одни из которых представляют собой липосомальные препараты, при изучении их цитотоксического и цитостатического эффекта необходимо учитывать несколько факторов, оказывающих влияние на эти эффекты. Основной из них - это концентрация загруженного агента, которая должна быть по возможности максимальной от исходной концентрации препарата в буфере при получении суспензии. В то же время по данным литературы число молекул доксорубицина в одной липосоме составляет 10³-10⁴ и концентрация препарата в липосомальной суспензии не может превышать 200 М на мл.

Таблица 1
Содержание компонентов препаратов ССЛ, ССЛ-Доксорубицин Лэнс и Teva (Нидерланды), АТЛ-25, АТЛ-25-Доксорубицин Лэнс и Teva
Характеристика	Стерически стабилизированные				Антиген-направленные
	ССЛ "пустые"		ССЛ-Dox		АТЛ-ICO-25 "пустые"		АТЛ-ICO-25-Dox
Серия	19.02	13.04	22.12	24.12	22.12	24.12	07.12	22.12
Концентрация цитостатика, М	-	-	41	71	-	-	64	41
Серия	20.05		22.02	20.05	08.02	02.06	08.02	02.06
Концентрация цитостатика, М	-		147	345	-	-	102	293

Было определено, что в случае больших величин концентрации происходит спонтанное вытекание агента из везикул наружу. По нашим данным для получения устойчивого цитотоксического эффекта in vitro достаточно концентрации инкапсулированного цитостатика 50-100 M на мл, однако для достижения хорошего противоопухолевого эффекта in vivo концентрации должны быть выше.

Пример 2. Определение содержания индолокарбазол-нуклеозидпроизводных в липосомальных препаратах с расчетом коэффициента экстинкции.

В этом примере требовалось снять спектры и рассчитать коэффициенты экстинкции нуклеозидпроизводных. Молярные коэффициенты экстинкции рассчитывали по формуле (6)

'E=A_{( )}V_p-pa/M_r m_в-ваl

Далее по той же методике, что и в Примере 1, проводили измерения оптической плотности на длине волны, соответствующей максимуму поглощения, и рассчитывали концентрации препаратов. Результаты измерений иллюстрируются данными, приведенными в Таблице 2.

Таблица 2
Содержание компонентов стерически стабилизированных липосомальных препаратов с гидрохлоридами индоло[2,3-а]пирроло[3,4-с] карбазол нуклеозид-производных
Характеристика	Гексопиранозиды								Пентопиранозиды
	ССЛ-ЛХС-1098а				ССЛ-ЛХС-1110a				ЛХС-1041а		ЛХС-1063а
Серия	08.02	22.03	25.05	25.0 5	22.02	22.03	20.07	20.07	19.02	07.03	22.02	22.03
Концентрация цитостатика, М	257	119	165	144	128	66	50	32	116	48	99	41
Серия	15.07	19.07	19.07		17.06	17.06	14.07
Концентрация цитостатика, М	74	45	27		95	37	43

Пример 3. Контрольный эксперимент по проверке концентрации инкапсулированного в липосомы препарата

Липосомальный препарат (200 мкл суспензии) наносят на колонку с Sephadex G25 (2 мл), предварительно уравновешенную фосфатно-солевым буфером (рН 7.4). Элюцию липосомальной фракции проводят в объеме 0.3 объема колонки фосфатно-солевым буфером, при наличие проточного фотометра проводят дополнительный контроль полноты элюции по измерению поглощения на 280 нМ. Неинкапсулированную часть вещества (низкомолекулярное соединение (меньше 1 кДа)) элюируют дополнительно 1.5 мл элюирующего буфера. Собранную фракцию не включенного в липосому вещества определяют фотометрически по формуле (1)

A_{( )}='ElC_н,

где С _н - молярная концентрация вещества, не включенного в липосомы, моль/л (М),

откуда С_н=А ⁾/'El

Абсолютное количество вещества, не включенного в липосомы, определяют по следующей формуле:

Н=Сн·V_э·М_r

Где H - количество вещества, не включенного в липосомы (г)

С_н - молярная концентрация в-ва, не включенного в липосомы, моль/л (М),

V _э - объем элюата, содержащего неинкапсулированное вещество,

M_r - молекулярная масса вещества,

Количество вещества, включенного в липосомы, определяют по формуле (5)

где А - количество вещества, включенного в липосомы,

Т - общее количество вещества (г), взятое для получения липосом,

К - пересчетный коэффициент, равный отношению объему суспензии липосом, взятых для исследования количественного содержания инкапсулированного компонента (V₁) к тотальному объему раствора полученных липосом (V₂) k=V ₁/V₂,

Н - количество вещества, не включенного в липосомы (г),

Данный метод контроля имеет ограничения и может быть применен для соединений гидрофильной и амфифильной природы.

Пример 4. Контрольный эксперимент по оценке цитотоксической активности липосомально инкапсулированного препарата

Метод тестирования цитотоксического эффекта фармпрепаратов in vitro - МТТ позволяет определить концентрацию цитотоксического агента, необходимую для того, чтобы половина клеток в живой культуре погибла (IC₅₀).

Метод является относительным и основан на данных, полученных при оценке цитотоксической активности липосомальных форм препаратов с разным уровнем инкапсуляции (загрузки). Данный контрольный тест является правомочным для оценки точности получаемых количественных результатов с применением патентуемого метода, поскольку имеется четкая зависимость цитотоксического эффекта препарата от его концентрации. Данный метод контроля может быть применен для соединений гидрофильной, гидрофобной и амфифильной природы.

1. Липосомальную фракцию, полученную после инкапсуляции препарата в липосомы, очищают от неинкапсулированного вещества согласно методу, описанному в примере №1.

2. Снимают кривые цитотоксичности двух липосомальных фракций препарата, отличающихся разной степенью инкапсулирования последнего, используя клеточную линию, чувствительную к воздействию препарата. Для сравнительной количественной оценки содержания препарата в липосомах используют показатель титра липосомального препарата, при котором гибнет 50% клеточной популяции (Ic₅₀) (фиг.1).

Вычисляют корреляционный коэффициент K, равный

где X1 - титр липосомального препарата 1,

Х2 - титр липосомального препарата 2.

Такое же соотношение оценивали с помощью патентуемого нами способа определения концентрации инкапсулированного препарата.

где С1 - концентрация инкапсулированного препарата в липосомальной форме 1,

С2 - концентрация инкапсулированного препарата в липосомальной форме 2.

Сравнение полученных корреляционных показателей K1 и K2 показало что данные величины различаются менее чем на 7% (таблица 1, фиг.2, 3).

Таким образом, в предложенном способе достигается требуемый технический результат, заключающийся в расширении области применения и повышении точности, поскольку исключается требование, что фармпрепарат должен либо обладать собственным спектром флуоресценции в видимой области, либо быть окрашенным флуоресцентным красителем. Отсутствие необходимости использования Тритон-100 для дезинтеграции также повышает точность измерений.

При этом для измерения концентрации используется спектрофотометрическое, а не флуориметрическое оборудование, например спектрофотометр Ultraspec-1100 (Amersham). Метод не требует использования дорогостоящих корреляционных спектрофотометров, поэтому стоимость оборудования для пользования им в 3-5 раз меньше, чем при использовании спектрофлуориметрического метода.

Кроме того, расширяется область применения способа, поскольку реализуется возможность определения концентраций как гидрофольных, так и амфифильных и гидрофобных веществ, а также их содержания в мультикомпонентных системах, когда действующий компонент фармпрепарата представлен не одним, а двумя-тремя веществами.

Источники информации

1. RU 2275619 С2, G01N 21/17, 2006.

2. Goren D, Horowitz AT, Tzemach D, Tarshish M, Zalipsky S, Gabizon A. "Nuclear delivery of doxorubicin via folate-targeted liposomes with bypass of multidrug-resistance efflux pump", Clin Cancer Res. 2000 May; 6(5): 1949-57.

3. Gardner S.C. "Delipidation treatment for large-scale protein purification processing" Thesis for MS in Chem. Engineering, Virginia Polytechnic Inst., 1996.

4. Lukyanov AN, Elbayoumi ТА, Chakilam AR, Torchilin VP. "Tumor-targeted liposomes: doxorubicin-loaded long-circulating liposomes modified with anticancer antibody", J. Control Release. 2004 Nov 5; 100(1): 135-44.

5. V.Torchilin and V.Weissig, "Liposomes 2^nd eds., A Practical Approach" ed. Oxford Univercity Press, 2003, 384 pp.

6. Дункан А., Горди В., Джонс Н., Матсен Ф., Сандорфи К., Вест В. «Применение спектроскопии в химии». /Под ред. В.Веста. - М.: ИЛ, 1959, с.659-61.