устройство и способ для улучшенного наноспектроскопического сканирования

Формула изобретения

1. Аппарат для идентификации химических групп в образце, закрепленном на поверхности, включающий субстрат, имеющий зеркальную поверхность, на которой размещается образец, сформированную из плазмонно-резонансного металла, источник светового луча, линзовый узел, имеющий кончик и нанолинзу, состоящую из одной или нескольких плазмонно-резонансных частиц, размещенных на кончике и расположенных на нем таким образом, чтобы создавать, при направлении светового луча через нанолинзу, моды электромагнитного зазора ближней зоны в пространстве между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектирования на поверхности субстрата, в зазоре между нанолинзой и субстратом, равном 40 нм или меньше, фокусирующий механизм для перемещения линзового узла по направлению к поверхности субстрата и от нее, при величине зазора менее 40 нм, для создания мод электромагнитного зазора, усиливающих спектральные сигналы комбинационного рассеяния, генерируемые образцом на участке детектирования; детектор для улавливания света, излучаемого или рассеиваемого образцом на участке детектирования, и для преобразования принятого света в спектр комбинационного рассеяния с усилением в зазоре, позволяющий идентифицировать химическую группу на участке детектирования, и механизм линейного перемещения для линейного перемещения линзового узла по отношению к указанному субстрату, для позиционирования линзового узла над разными участками детектирования субстрата.

2. Аппарат по п.1, в котором нанолинза в указанном узле включает по меньшей мере три указанные плазмонно-резонансные частицы, расположенные симметрично вокруг центральной оси, перпендикулярной к плоскости поверхности субстрата, причем каждая частица имеет размер менее 200 нм по наибольшей оси, и расстояние между любой парой частиц существенно меньше длины волны светового луча.

3. Аппарат по п.2, в котором указанные частицы имеют сферическую форму.

4. Аппарат по п.2, в котором указанные частицы имеют эллипсоидальную форму и ориентированы таким образом, чтобы их большие оси пересекались с указанной центральной осью.

5. Аппарат по п.2, в котором указанный источник света создает луч циркулярно поляризованного света, плоскость поляризации которого перпендикулярна к указанной центральной оси.

6. Аппарат по п.1, в котором указанный линзовый узел включает консоль, имеющую кончик на своем незакрепленном конце.

7. Аппарат по п.6, в котором указанный фокусирующий механизм включает пьезоэлектрический привод, функционально связанный с указанной консолью.

8. Аппарат по п.7, в котором указанный фокусирующий механизм осуществляет перемещение указанной нанолинзы на заданное расстояние в интервале от 0,1 до 5 нм от поверхности субстрата.

9. Аппарат по п.1, в котором указанный механизм линейного перемещения включает пьезоэлектронный привод.

10. Аппарат по п.1, предназначенный для использования при секвенировании линейной цепи нуклеиновой кислоты путем анализа химических групп оснований цепи нуклеиновой кислоты, в котором субстрат включает молекулярные якоря для удерживания цепи нуклеиновой кислоты в линейно вытянутом состоянии, а механизм линейного перемещения осуществляет перемещение линзового узла вдоль цепи для проведения последовательного анализа и идентификации каждого основания цепи.

11. Аппарат по п.10, предназначенный для одновременного проведения анализа множества по сути линейных образцов, который включает множество линейно ориентированных консольно-линзовых агрегатов, положение каждого из которых в направлении к поверхности субстрата и от нее может индивидуально контролироваться с помощью соответствующего фокусирующего механизма, связанного с каждым линзовым узлом, и которые перемещаются как одно целое единым механизмом линейного перемещения.

12. Аппарат по п.11, предназначенный для использования при секвенировании множества линейных цепей нуклеиновой кислоты путем проведения анализа химических групп оснований цепи нуклеиновых кислот, в котором субстрат включает молекулярные якоря для удерживания каждой цепи нуклеиновой кислоты в линейно вытянутом состоянии, и механизм линейного перемещения осуществляет перемещение линзового узла вдоль цепей для проведения последовательного анализа и идентификации каждого основания цепей.

13. Способ идентификации химических групп в образце, включающий крепление образца к субстрату, имеющему зеркальную поверхность, на которой размещается образец, сформированную из плазмонно-резонансного металла, направление светового луча на нанолинзу в линзовом узле, имеющем кончик и нанолинзу, расположенную на кончике и состоящую из одной или нескольких плазмонно-резонансных частиц, размещенных на кончике таким образом, чтобы создавать моды электромагнитного зазора в ближней зоне в пространстве между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектирования на поверхности субстрата, при величине зазора между нанолинзой и субстратом 30 нм или меньше, перемещение линзового узла по направлению к поверхности субстрата или от нее, при расстоянии между нанолинзой и поверхностью субстрата менее 30 нм, для создания мод электромагнитного зазора, усиливающих спектральные сигналы комбинационного рассеяния, генерируемые образцом на участке детектирования; улавливание света, излучаемого или рассеиваемого образцом на участке детектирования, и преобразование принятого света в спектр комбинационного рассеяния с усилением в зазоре, позволяющий идентифицировать химическую группу на участке детектирования.

14. Способ по п.13, в котором указанное перемещение осуществляется с целью установки указанной нанолинзы с заданной величиной зазора в интервале от 0,1 до 5 нм от поверхности субстрата.

15. Способ по п.13, в котором указанное направление включает направление светового луча на нанолинзу, состоящую из по меньшей мере трех указанных плазмонно-резонансных частиц, расположенных симметрично вокруг центральной оси, перпендикулярной к плоскости поверхности субстрата, причем каждая частица имеет размер менее 200 нм по своей наибольшей оси, и расстояние между любой парой частиц существенно меньше длины волны светового луча.

16. Способ по п.15, в котором указанное направление включает направление на указанную линзу луча циркулярно поляризованного света, плоскость поляризации которого перпендикулярна к указанной центральной оси.

17. Способ по п.15, предназначенный для использования при секвенировании линейной цепи нуклеиновой кислоты, в котором указанное крепление включает растяжение цепи в линейном направлении и фиксацию противоположных концевых участков цепей на указанном субстрате, и который дополнительно включает линейное перемещение линзового узла относительно образца на субстрате для установки нанолинзы в положение, прилегающее к последовательно расположенным химическим группам оснований в цепи.

18. Способ по п.17, предназначенный для использования при секвенировании множества образцов линейных цепей нуклеиновых кислот, в котором указанное крепление включает фиксацию образцов в виде множества параллельных цепей, и указанное линейное перемещение включает линейное перемещение линзового узла относительно образцов на субстрате, для установки нанолинзы в положение, прилегающее к последовательно расположенным химическим группам оснований в каждой из цепей.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к области наноспектроскопического сканирования, в частности к способу и аппарату, способному спектроскопически идентифицировать структуры отдельных молекул или отдельных химических групп на субстрате.

Литературные источники

Указанные ниже ссылки приведены как часть известного уровня техники и/или в качестве источников методик, которые могут быть использованы в определенных аспектах настоящего изобретения. Эти ссылки включены в настоящее изобретение.

G.R.Brewer, Electron-Beam Technology in Microelectronic Fabrication, Academic Press, NY (1980).

David Ginger et al., "The evolution of Dip-Pen Nanolithography", Angew. Chem. Int. Ed., v.43, p.30-45 (2004).

S.Hayashi, "Spectroscopy of Gap Modes in Meta Particle-Surface Systems, "TpoicsAppl. Phys., 81:71-95 (2001).

I-K.Kneipp et al., "Ultrasensitive Chemical Analyses by Raman Spectroscopy", Chem. Rev., 1999, vol.99, p.2957-2975, see p.271.

V.Matyushin, A et al., "Tuning the setup of sputter-coated multilayers in nanocluster-based signal enhancing biochips for optimal performance in protein and DNA-assays", J.Nanoscience and Nanotechnology, Volume 4, Number 1/2 (January/February 2004), pp.98-105 (2004).

D.McCamant, "Femtosecond Broadband Stimulated Raman: A new Approach for High-Performance Vibrational Spectroscopy", Applied Spectroscopy, Vol.57, p.1317-1323, 2003.

S.C.Minne et al., "Automated parallel high-speed atomic force microscopy", Applied Physics Letters, Vol.72, p.2340-2342, 1998.

S.C.Minne et al., "Bringing Scanning Probe Microscopy up to Speed", 173 p., Kluwer Academic Publiishers, 1999.

C.M.Niemeyer, "Self-assembled nanostructures based on DNA: towards the development of nanobiotechnology", Current Opinion in Chemical Biology, v.4, p.609-618, 2000.

J.P.Rabe. "Self-assembly of single rrmacromolecules at surfaces". Current Opinion in Colloid and Interface Science. Vol.3, p.27-31, 1998.

F.Wolf et al., Review of Scientific Instruments, 1999, Vol.70, p.2751-2757, "Novel Scanning Near-Field Optical Microscope (SNOM)/scanning confocal optical microscope based on normal force distance regulation and bent etched fiber tips."

Y.Xia et al., Advanced Functional Materials, v.13, p.907-918, 2003 "Template-assisted Self-Assembly of Spherical Colloids into Complex and Controllable Structures"

H.Xu et al. Phys. Rev. E., v.62, p.4318, 2000.

F.Zenhausen, et al., "Scanning Interferometric Apertureless Microscopy: Optical Imaging at 10 Angstrom Resolution", Aug.25, 1995, Science, Vol.269.

Известный уровень техники

Известны различные инструменты и способы исследования поверхностных характеристик и структуры на микро- и даже наноуровне. Сканирующая атомно-силовая микроскопия (AFM) позволяет получать изображение поверхностной топологии на микроуровне путем перемещения кончика детектора, закрепленного на свободном конце консоли над поверхностью или по поверхности анализируемого материала. Такой тип микроскопа может работать путем прямого физического контакта с поверхностью или, в туннельном режиме, путем детектирования туннельного тока, когда кончик детектора находится на заданном расстоянии от поверхности. Этот тип устройств оказался очень полезным для получения изображений поверхностной топографии, например для детектрования дефектов на кристаллах интегральных схем, но не рассчитан и не может быть использован для детектирования конкретных химических соединений или химических групп. Эта концепция была расширена в методе высокоскоростной AFM с параллельным перемещением (например, Minne, 1998; 1999).

Метод сканирующего датчика был также адаптирован для оптического детектирования топографии поверхности. Патент США №6441359, например, описывает систему оптического сканирования в ближней зоне, в которой оптика ближней зоны закреплена на свободном конце консоли. Патент также раскрывает микротехнологии изготовления матрицы таких оптических элементов для системы оптического сканирования.

Расстояние от кончика щупа до образца в аппарате контролируется с помощью оптической системы отклонения уровня, обеспечивающей близкое расположение кончика к поверхности образца. Система способна достигать разрешения меньше длины волны за счет сканирования с апертурой, имеющей размеры меньше длины волны, или путем сканирования твердофазными иммерсионными линзами, расположенными очень близко к образцу. Устройство не рассчитано и не может использоваться для детектирования индивидуальных химических молекул или групп вследствие очень низкого уровня сигнала, который может быть получен при этом. Сканирующие оптические микроскопы ближнего поля (SNOM) были предложены другими авторами (например, Wolf).

Одним из очень чувствительных методов химического анализа является спектроскопия комбинационного рассеяния (рамановская спектроскопия) с поверхностным усилением или SERS (см., например, Kneipp). Кроме того, методика SERS использовалась в сканирующем микроскопе высокого разрешения для достижения высокого разрешения спектроскопической информации о поверхности образца, например, патент США №6002471. Устройство включает небольшой проводящий элемент (плазменная резонансная частица, или PRP) на незакрепленном конце сканирующей консоли, предназначенный для усиления света, излучаемого вблизи датчика. Субстрат образца состоит из стекла. Патент не раскрывает и не предполагает возможности использования мод электромагнитного зазора для увеличения спектроскопического разрешения, которое, вероятно, позволило бы различать отдельные химические структуры, такие как основания ДНК, а также не содержит упоминаний о системе, способной осуществлять параллельный анализ множества образцов, например, вытянутых цепей ДНК.

Сущность изобретение

В одном аспекте изобретение включает аппарат для идентификации химических групп в образце, закрепленном на поверхности. Аппарат включает плазменный резонансный субстрат, т.е. субстрат с зеркальной поверхностью, на котором крепится образец, источник светового луча, предпочтительно когерентного света, и линзовый узел, имеющий кончик и нанолинзу, состоящую из одной или нескольких плазменных резонансных частиц (PRP). PRP расположены на кончике и предназначены для создания, при прохождении светового луча через нанолинзу, мод ближнего поля электромагнитного зазора в пространстве между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектирования на поверхности субстрата при величине зазора между нанолинзой и субстратом 40 нм или меньше.

Фокусирующий механизм аппарата, такой как пьезоэлектрический привод, способен перемещать линзовый узел в направлении к или от поверхности субстрата, при величине зазора между ними менее 40 нм, для создания мод электромагнитного зазора, усиливающих спектральные сигналы комбинационного рассеяния, создаваемые образцом на участке детектирования. Свет, излучаемый или рассеиваемый образцом на участке детектирования, улавливается детектором, который преобразует улавливаемый свет в характеристический спектр комбинационного рассеяния, позволяющий идентифицировать химическую группу образца на участке детектирования. Аппарат может включать механизм линейного перемещения, такой как пьезоэлектрический привод, для линейного перемещения линзового узла относительно субстрата с целью позиционирования линзового узла над другими участками детектирования субстрата.

Нанолинза в узле предпочтительно включает по меньшей мере три указанных PRP, расположенных симметрично вокруг центральной оси, перпендикулярной к плоскости поверхности субстрата, причем максимальный размер каждого PRP не превышает 50-200 нм, а расстояние между любой парой PRP существенно меньше длины волны светового луча. PRP могут иметь сферическую или эллипсоидальную форму и быть ориентированы таким образом, чтобы их большие оси пересекались с центральной осью. Источник света в данном варианте исполнения может создавать луч циркулярно поляризованного света, предпочтительно когерентного света, плоскость поляризации которого ориентирована перпендикулярно к центральной оси.

Линзовый узел может включать консоль с кончиком на своем незакрепленном конце, причем фокусирующий механизм функционально связан с консолью.

Механизм предпочтительно позволяет устанавливать нанолинзу в положение, находящееся на заданном расстоянии в интервале от 0,1 до 5 нм от поверхности субстрата.

Для использования при секвенировании линейной цепи нуклеиновой кислоты путем последовательного анализа оснований (химических групп) цепи нуклеиновой кислоты субстрат включает молекулярные якоря для удерживания цепи нуклеиновой кислоты в линейно вытянутом состоянии, и механизм линейного перемещения обеспечивает перемещение линзового узла вдоль цепи для последовательного анализа и идентификации каждого основания в цепи. Для одновременного анализа множества образцов, представляющих собой, по сути, нуклеиновые кислоты, аппарат предусматривает множество линейно ориентированных консольно-линзовых агрегатов, перемещение каждого из которых по направлению к поверхности субстрата и от нее может индивидуально контролироваться с помощью соответствующего фокусирующего механизма, связанного с каждым линзовым узлом, которые перемещаются в линейном направлении как одно целое с помощью единого механизма линейного перемещения.

В другом аспекте способ включает способ идентификации химических групп в образце. После закрепления образца на субстрате, имеющем плазмонно-резонансную зеркальную поверхность, световой луч направляется на образец через нанолинзу линзового узла описанного выше типа для создания мод ближней зоны электромагнитного зазора в пространстве между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектирования на поверхности субстрата при величине зазора между нанолинзами и субстратом 40 нм или меньше. Линзовый узел перемещается по направлению к поверхности субстрата или от нее, причем расстояние между нанолинзой и поверхностью субстрата составляет менее 40 нм, для создания мод электромагнитного зазора, усиливающих спектральные сигналы комбинационного рассеяния, генерируемые образцом на участке детектирования. Свет, излучаемый или рассеиваемый образцом на участке детектирования, улавливается детектором и преобразуется в рамановский спектр, характерный для анализируемой химической группы, по которому может быть идентифицирована химическая группа на участке детектирования.

Положение линзового узла может контролироваться для установки нанолинзы с заданным значением величины зазора в интервале от 0,1 до 5 нм от поверхности субстрата. Нанолинза может состоять из по меньшей мере трех PRP, расположенных симметрично вокруг центральной оси, перпендикулярной к плоскости поверхности субстрата, причем каждая частица имеет размер наибольшей оси менее 50-200 нм, а расстояние между любой парой частиц существенно меньше длины волны светового луча.

Свет, направляемый на линзу, предпочтительно представляет собой луч циркулярно поляризованного света, плоскость поляризации которого ориентирована перпендикулярно по отношению к центральной оси.

При использовании для секвенирования линейной цепи нуклеиновой кислоты образец может быть закреплен на поверхности субстрата путем линейного растяжения цепи и фиксации противоположных конечных участков цепей на субстрате. Способ дополнительно включает линейное перемещение линзового узла относительно образца на субстрате в положение, при котором нанолинза расположена рядом с последовательно расположенными химическими группами оснований в цепи. При использовании для секвенирования множества образцов линейных цепей нуклеиновых кислот множество цепей растягивают и закрепляют на субстрате в виде матрицы с параллельной ориентацией. Множество таких линзовых узлов, например матрица консолей, затем линейно перемещается относительно матрицы цепей ДНК для установки связанных с ними нанолинз в положение, прилегающее к последовательно расположенным химическим группам оснований в каждой цепи.

Эти и другие объекты и отличительные признаки изобретения будут более понятными при прочтении приведенного далее подробного описания изобретения в сочетании с прилагаемыми чертежами.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 изображает расположение компонентов в аппарате, сконструированном в соответствии с одним вариантом исполнения изобретения;

Фиг.2а иллюстрирует электромагнитные явления, создающие моды ближней зоны электромагнитного зазора при направлении циркулярно поляризованного светового луча на нанолинзу, сконструированную в соответствии с одним вариантом исполнения изобретения, предусматривающим шестичастичную нанолинзу, а Фиг.2b изображает нанолинзы, содержащие от 2 до 6 PRP;

Фиг.3а и 3b изображают виды в перспективе (3а) и в поперечном разрезе (3b) концевого участка консоли со встроенной нанолинзой в соответствии с изобретением;

Фиг.4 изображает субстрат с матрицей вытянутых цепей ДНК, закрепленных на его верхней поверхности;

Фиг.5а и 5b изображают в перспективе (5а) и в разрезе (5b) оптические явления, используемые в настоящем изобретении для детектрования последовательно расположенных индивидуальных оснований в вытянутом образце ДНК;

Фиг.6а, 6b и 6с показывают результаты численного моделирования серебряной нанолинзы в форме трехлучевой звезды. На Фиг.6а приведена частотная зависимость амплитуды поля в центре нанолинзы, соответствующей плазмонному резонансу 2,45 эВ; Фиг.6b показывает распределение поля вдоль оси y; и на Фиг.6 с приведено топографическое изображение распределения поля на виде сверху;

Фиг.7а, 7b и 7с аналогичны Фиг.6а-6с соответственно, но показывают результаты численного моделирования серебряной нанолинзы в форме четырехлучевой звезды;

Фиг.8 изображает распределение поля в нанолинзе в форме четырехлучевой звезды вдоль оси x с указанием максимума коэффициента усиления, равного 3000, около поверхности PRP.

Детальное описание изобретения

А. Определения

Приведенные ниже термины имеют следующие значения, если не указано иное:

"Плазмонно-резонансный металл" включает любой металл, такой как золото, серебро или алюминий, способный поддерживать поверхностные электромагнитные моды-поверхностные плазменные поляритоны (SPP), которые представляют собой связанные моды фотонов и плазмона.

"Химическая группа" в образце может включать субъединицы или фрагменты субъединиц полимера, такие как основания нуклеиновой кислоты или группы химических заместителей, такие как гидроксильные, аминовые, алкильные, кислотные или альдегидные группы. Такие химические группы характеризуются уникальными спектральными сигнатурами или характеристиками усиленного комбинационного рассеяния.

"Моды зазора" относятся к электромагнитным нормальным модам или электромагнитным собственным модам, возбуждаемым внешним электромагнитным полем в пространстве между двумя или несколькими плазменными резонансными частицами, когда плазменные резонансные частицы расположены возле (на расстоянии менее 40 нм) поверхности металла, предпочтительно поверхности плазмонно-резонансного металла. Примерами плазмонно-резонансных частиц являются частицы серебра или золота, максимальный размер которых находится в интервале размеров от 5 до 200 нм.

"Спектр комбинационного рассеяния с усилением в зазоре" образца относится к спектральным характеристикам спектра комбинационного рассеяния образца, усиленным в присутствии мод зазора вблизи образца.

В. Аппарат для наноспектроскопического сканирования

На Фиг.1 изображен аппарат, обозначенный в целом позицией 35, предназначенный для идентификации химических групп в образце, закрепленном на поверхности. На фигуре изображен столик сканирования 90, на котором размещен кристалл с ДНК 80, имеющий множество вытянутых цепей ДНК, таких как цепи 82, закрепленных на поверхности кристалла и расположенных параллельно друг другу. Способы фиксации вытянутых полимерных цепей, таких как цепи ДНК, на поверхности кристалла будут описаны ниже.

В соответствии с важным признаком данного варианта исполнения поверхность кристалла, на которую нанесен образец, имеет зеркальное покрытие из плазмонно-резонансного металла, например, серебра, золота или алюминия.

Цепи ДНК сканируются с помощью столика сканирования 90, такого как столик с пьезоэлектрическим или электромагнитным управлением перемещениями. Столик с электромагнитным управлением перемещениями позволяет сканировать участок размером до десятков сантиметров и более, что делает возможным сканирование кристалла с отдельными молекулами с полным набором индивидуальных хромосом.

Световой луч, предпочтительно, когерентный и циркулярно поляризованный, генерируется лазером 10. Лазер может включать два лазера для осуществления нелинейной спектроскопии комбинационного рассеяния, такой как CARS (когерентная антистоксовская спектроскопия комбинационного рассеяния) и фемтосекундная индуцированная спектроскопия комбинационного рассеяния (D.McCamant). В типичной лазерной системе используется Ti-сапфировый перестраиваемый лазер с импульсным и непрерывным режимами работы. Длину волны возбуждения светового луча, предпочтительно, выбирают и настраивают так, чтобы она была близка к максимуму спектрального пика в спектрах поглощения плазменного резонанса плазмонно-резонансного субстрата. При сканировании с использованием плазменной нанолинзы для коррекции частоты необходимо принимать во внимание спектры поглощения плазменного резонанса системы в целом (плазменная нанолинза + плазмонно-резонансный субстрат). Важно отметить, что из-за наноскопического сближения плазменной нанолинзы с поверхностью плазмонно-резонансного субстрата спектры плазмонного поглощения меняются.

Световой луч расширяется с помощью расширителя пучка или преобразуется в сканирующий луч в растре луча 20. Таким образом, единый световой луч разделяется на матрицу световых лучей, каждый из которых направлен на индивидуальную плазмоную нанолинзу в матрице нанолинз 60. Каждый индивидуальный световой луч проходит через расщепитель луча 30 и коллиматорную оптику 40 на микронную матрицу 50. Микронная матрица позволяет осуществлять индивидуальный цифровой контроль каждого индивидуального светового луча, направленного на индивидуальные плазменные нанолинзы, такие как линзы 62 в матрице 60, установленные на незакрепленных концах консолей, таких как кронштейн 64, как будет подробнее описано ниже.

Как будет понятно из дальнейшего описания, нанолинза мод плазмонного зазора, раскрытая в настоящем изобретении, основана на способности локализованных плазмонов (коллективных колебаний электронов), возбуждаемых внутри металлических наночастиц внешней электромагнитной волной, усиливать электромагнитные поля в зоне ближнего поля в непосредственной близости от поверхности плазмонного резонанса и локализовать их в крайне малом пространстве, измеряемом нанометрами. Такое нераспространяющееся электромагнитное поле сконцентрировано в непосредственной близости (несколько десятков нанометров 30-40 нм) от поверхности наночастиц и называется "ближним электромагнитным полем" в отличие от распространяющегося электромагнитного поля в дальней зоне.

Как далее изображено на Фиг.1, световой луч, направляемый на каждую плазменную нанолинзу в консольной матрице может модулироваться с помощью изготовленного методами микромеханической обработки блока зеркал 50, такого как производимый фирмой Texas Instruments, Inc. (Dallas, Texas) под торговой маркой "Digital Micromirror Device". Эта система обеспечивает цифровое управление освещением каждой индивидуальной плазменной нанолинзы и считывание сигнала, рассеиваемого каждой плазменной нанолинзой. Эта система особенно удобна для обеспечения цифрового управления высокоскоростным программируемым индивидуально адресуемым многоканальным импульсным освещением и улавливанием рассеянного сигнала, имеющего решающее значение для реализации сверхбыстрого прямого секвенирования ДНК с прямым преобразованием в цифровую форму информации о последовательности для хранения в машинной памяти.

Расстояние между плазменной нанолинзой и образцом ДНК поддерживается с помощью системы наклона консоли с обратной связью. Такие системы управления хорошо известны и описаны для атомно-силовых микроскопов, например, в патенте США №5883705, или сканирующих оптических микроскопов ближнего поля, например, в патенте США №5354985, которые включены в данное описание. Один из способов индивидуального приведения в действие и управления каждой консолью в матрице 60 в процессе сканирования использует пьезорезисторное управление с обратной связью, как подробнее раскрыто в патенте США №6441359, который также включен в данное описание.

Расстояние между каждой плазменной нанолинзой и соответствующим образцом ДНК, предпочтительно, поддерживается на уровне от 0,1 нм до нескольких нанометров с целью обеспечения оптимального усиления поля и его локализации в зазоре между нанолинзой, и образцом ДНК, и поверхностью субстрата за счет возбуждения мод ближнего поля электромагнитного зазора, как изображено на Фиг.2, и 6а, и 6b. С изменением зазора между каждой нанолинзой и поверхностью субстрата, на которой закреплен образец, локализация и интенсивность мод электромагнитного зазора также меняется. Поэтому путем изменения расстояния между нанолинзой и образцом ДНК (или поверхности субстрата) можно управлять формой и локализацией мод электромагнитного зазора с целью достижения максимального сигнала рассеянного света (считывание) и максимального пространственного разрешения. Благодаря оптимизации этих мод зазора можно достичь уровня разрешения, позволяющего распознавать индивидуальные основания в цепи ДНК, иммобилизованной на поверхности субстрата. В зависимости от уровня растяжения цепи ДНК на микрокристалле требования к пространственному разрешению могут меняться для разных оснований и для разных цепей. Однако величина расстояния находится в интервале значений от нескольких нанометров до менее чем 1 нанометра.

В варианте исполнения, изображенном на Фиг.1, рассеянный при отражении свет от каждой плазменной нанолинзы, взаимодействующий с индивидуальными основаниями ДНК, направляется назад через матрицу микролинз 50, коллиматорную оптику 40 и расщепитель луча 30 на приемный конец плоского волоконно-оптического кабеля 100. Следует понимать, однако, что изобретение не ограничено собиранием рассеянного при отражении света. В других вариантах исполнения изобретения геометрия освещения и собирания может отличаться от геометрии рассеяния при отражении, и в этом случае оптические системы освещения и собирания могут быть разделены.

Рассеянный световой сигнал по плоскому волоконно-оптическому кабелю 100 направляется на щель монохроматора многоканального спектрального анализатора 110. Для исключения падающего света используются узкополосные режекторные фильтры. Дифракционная решетка 120 расщепляет рассеянный световой луч на группу монохроматических световых лучей, которые преобразуются в индивидуальные спектры комбинационного рассеяния. Спектры, полученные на детекторной матрице 130, затем преобразуются в цифровую форму и передаются в компьютер 140, где они обрабатываются для получения информации о последовательности образца ДНК на микрокристалле.

Другая пригодная оптическая схема, не изображенная тут, использует интерферометрический способ детектирования, такой как раскрытый ранее (например, F.Zenhausen).

С.Работа нанолинзы и ее изготовление

Данный раздел описывает детально строение нанолинзы, предназначенной для размещения в непосредственной близости от гладкой металлической поверхности субстрата образца, для получения локализованных мод зазора при освещении линзы световым лучом, например когерентным и/или циркулярно поляризованным световым лучом. Эти моды могут быть использованы для прямого оптического сканирования молекул, расположенных в пространстве между нанолинзами зеркальной поверхности субстрата, с высоким пространственным разрешением для достижения субнанометрового разрешения и с усилением сигнала, позволяющим осуществить детектирование спектральной сигнатуры отдельной малой молекулы, такой как индивидуальные основания цепей ДНК.

Наиболее общая схема нанолинзы включает одну, а предпочтительно множество (например, 2-6) металлических наночастиц, имеющих заданную форму и заданную геометрию взаимного расположения частиц. Предпочтительной геометрией частиц является симметричное расположение частиц вокруг центральной оси, как будет показано ниже, хотя предусматриваются также другие геометрии, такие как неупорядоченный фрактал. Наночастицы, образующие линзу, могут иметь разную форму и размеры и расположены на нанометровом расстоянии друг от друга. Однако наибольший размер каждой наночастицы и системы в целом не превышает длины волны светового излучения. Предпочтительными являются наночастицы в диапазоне размеров 5-200 нм, например, 20-50 нм.

На Фиг.2 представлено детализированное перспективное изображение части консоли 160 с закрепленной на ее свободном (дальнем) конце шестичастичной нанолинзой 180. Видно, что циркулярно поляризованный световой луч 190 от лазерного источника направляется через конфокальную линзовую оптику 50 на нанолинзу 180. Нанолинза установлена на держателе 170, сформированном из прозрачного диэлектрического материала, который в одном варианте исполнения может быть свободным концом консоли 160, используемой для регулирования расстояния между нанолинзой и образцом в устройстве сканирования проб. Нанолинза расположена в непосредственной близости от металлической зеркальной поверхности 200 субстрата образца. Поскольку свет в дальней зоне, направленный с помощью конфокальной оптики, может быть сфокусирован в пятно, имеющее размер около 1 микрона или немного меньше, определяемый пределами дифракционной оптики, а диаметр нанолинзы (диаметр описанной окружности частиц нанолинзы 182), предпочтительно, имеет величину в интервале 50-200 нм, это означает, что он меньше длины волны светового излучения. Как также видно на фигуре, освещаемое поле (окружность, обозначенная пунктирной линией 350) обычно больше площади нанолинзы.

Однако можно создать нанолинзу диаметром 0,5-1,0 микрон, так чтобы она совпадала по размеру с фокальным пятном. В этом случае нанолинза будет работать как наноантенна, которая будет концентрировать электромагнитную энергию в центре нанолинзы путем возбуждения локализованного плазмона.

В варианте исполнения, изображенном на Фиг.2а, плазменная нанолинза 185 имеет звездообразную структуру, состоящую из шести металлических наночастиц, таких как частицы 182, где каждая частица имеет форму вытянутого сфероида с большим эксцентриситетом (предпочтительно, более 5) или цилиндрического наностержня с полусферическими концами, или металлической нанопроволоки. Эта геометрия частиц показана также позицией 185 на Фиг.2b вместе с конфигурациями частиц нанолинз 195, 205, 215 и 225 для линз, состоящих из пяти, четырех, трех и двух частиц соответственно.

Как было отмечено выше, освещение каждой нанолинзы осуществляется, предпочтительно, лазерным лучом или некогерентными электромагнитными волнами с циркулярной поляризацией. Максимальное усиление электромагнитного поля, обозначенное позицией 200 на Фиг.2а, достигается в центральной части линзы возле оси нанолинзы. Эта область имеет диаметр несколько нм или меньше. Как показывают результаты численного моделирования, описанные ниже со ссылками на Фиг.6а-6с, 7а-7с и 8, в центре нанолинзы может быть достигнут коэффициент усиления поля до 1500-3000.

Этот коэффициент усиления значительно превышает величину усиления, достижимую в конфигурациях, состоящих из сферических наночастиц, и при других формах наночастиц, известных из уровня техники. Максимальное локальное усиление поля, полученное путем численного моделирования и равное 300, было описано в литературе (Н.Xu).

Нанолинза по изобретению может быть изготовлена разными известными способами. В общем, нанолинзу изготовляют заедино с консолью с использованием известных способов нанообработки на основе электроннолучевой литографии, или литографии с фокусируемым ионным пучком (G.R.Brewer), или на основе литографии методом сканирующей туннельной микроскопии. Другой способ изготовления может быть основан на методе матричной самосборки (Y.Xia). Для создания схем плазменных нанолинз на различных материалах подложки могут быть использованы альтернативные способы, такие как нанолитография методом погружного пера (dip-pen) (например, D.Ginger) или метод самосборки на основе ДНК (например, С.М.Niemeyer). В одном варианте исполнения плазменная нанолинза может быть интегрирована в свободный конец консоли, являющейся частью устройства сканирования пробы, и может одновременно выполнять функцию кончика консоли, регулирующего расстояние между нанолинзой и образцом в процессе сканирования в устройствах сканирования пробы, таких как атомно-силовой микроскоп AFM или сканирующий оптический микроскоп ближней зоны SNOM. Один возможный вариант исполнения плазменной нанолинзы, интегрированной в консоль устройства спектроскопического сканирования пробы, представлен на Фиг.3.

Фиг.3 иллюстрирует, как плазменная нанолинза может быть интегрирована в свободный конец консоли устройства спектроскопического сканирования пробы и может одновременно выполнять функции кончика консоли, контролирующего расстояние между нанолинзой и образцом в процессе сканирования образца. Консоль 160 изготовлена из композиционного материала, имеющего участок непрозрачного материала 260 и оптически прозрачный участок 170, образующий оптическое окно 250, позволяющее падающему циркулярно поляризованному свету взаимодействовать с нанолинзой 180 и возбуждать эффективно локализованные плазмы (LP) и моды зазора (GM).

D. Приготовление субстрата, содержащего образец

Субстрат или подложка в аппарате предназначены для усиления электромагнитного поля в непосредственной близости от поверхности и покрыты тонкой пленкой плазмонно-резонансного материала, такого как серебро, золото или алюминий. Толщина пленки составляет, предпочтительно, 25-200 нм, например 50 нм. Пригодный субстрат, например стеклянные субстраты, могут быть покрыты металлической пленкой известными способами, такими как методы вакуумного испарения или высокочастотного ионного распыления. Примеры покрытий субстрата и способов их получения раскрыты в патенте США №5611998 "Оптохимический датчик и способ его изготовления" (Optochemical sensor and method for production), включенном в данное описание, и в ссылке V.Matyushin, также включенной в данное описание.

Цепи ДНК, имеющие длину, например, от 100 нанометров до 2,5 миллиметров, помещают на субстрат, как показано позицией 82 на Фиг.1. Расстояние между цепями должно находиться в интервале 200-300 микрон и должно соответствовать расстоянию между соседними консолями в матрице консолей.

Предпочтительным является расстояние, равное 250 микрон, которое соответствует 250-микронному шагу, являющемуся стандартом в технологиях плоских волоконно-оптических кабелей.

На Фиг.4 изображен типичный кристалл или субстрат 80, предназначенный для использования в аппарате и способе по изобретению. Тут изображены образцы ДНК, полученные, например, из геномной ДНК в форме фрагментов одноцепочечной ДНК длиной до 2,5 миллиметров (5 млн оснований). Цепи, такие как обозначенные позицией 210, помещают на поверхность предметного стекла, обладающего способностью к плазмонно-резонансному оптическому усилению 80. Они размещаются упорядоченно с возможностью адресации. Каждый конец цепи ДНК присоединен к комплементарному олигонуклеотиду на правом/левом штрих-кодовом участке 220а и 220b. Расстояние между цепями должно находиться в интервале 200-300 микрон и соответствовать расстоянию между соседними консолями в матрице консолей. Предпочтительным является расстояние 250 микрон, соответствующее шагу 250 микрон, совпадающему с шагом стандартных плоских волоконно-оптических кабелей.

Способы вытягивания и ориентации образцов линейных полимеров, таких как ДНК, РНК, нуклеиновые аналоги, полипептиды, линейные углеводороды и т.п., являются известными. Например, противоположные концы образца полимера, такого как ДНК, могут быть ковалентно связаны с микросферами, такими как латексные или стеклянные бусины, и бусинами затем манипулируют с помощью импульсно-лазерного молекулярного пинцета до достижения требуемой степени растяжения, предпочтительно, с перетяжкой. Этот подход проиллюстрирован на Фиг.4, где изображены микросферы 290а, 290b, присоединенные к противоположным концам цепи ДНК 210. Каждая сфера "захватывается" лазерным лучем, таким как лучи 300а, 300b, для манипулирования сферами с целью вытягивания и ориентации цепи при ее размещении на поверхности субстрата. После осуществления такого размещения концевые участки цепи крепятся к субстрату путем гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами, присоединеными к субстрату на участке штрих-кода. Способы захвата и манипулирования микросферами в лазерном луче описаны, например, в патенте США №5620857 и в патентной заявке США №20040001371, которые включены в данное описание.

В родственной методике концы полимерной цепи ковалентно связываются с магнитными бусинами или с твердой подложкой и магнитной бусиной, и к бусине (бусинам) прикладывают магнитное поле (поля) до достижения требуемой степени растяжения и ориентации цепи. В более общем случае противоположные концы цепи могут быть присоединены к паре перемещающихся относительно друг друга опор, и опоры устанавливаются в положение, обеспечивающее требуемую степень растяжения и ориентацию, как раскрыто, например, в патенте США №6342353, который включен в данное описание.

Известны также способы растяжения заряженной полимерной цепи в линейную конформацию методом электрофореза в узком микроканале.

После того как полимерные цепи будут вытянуты и ориентированы для закрепления на субстрате, молекулу образца фиксируют на субстрате любым из ряда пригодных способов фиксации. Как указывалось выше, субстрат может быть снабжен конечными участками олигонуклеотидов, способными к гибридизации с последовательностями концевых участков образца цепи ДНК. В тех случаях, когда цепь вытянута путем манипулирования частицами, ковалнтно связанными с концами цепи, субстрат может содержать химические группы или магнитные структуры для крепления частиц к субстрату, когда цепь находится в вытянутом состоянии. Одним из обычных способов химического присоединения для поверхности золота является использование тиольного реагента, ковалентно присоединенного к концевым участкам цепи образца.

В общем, процедуры подготовки поверхности субстрата, на которой должны быть закреплены молекулы ДНК, известны специалистам в области способов детектировании гибридизации ДНК (см., например, J.P.Rabe).

Е. Способ сканирования и детектирования

Как было указано выше, важной областью применения аппарата и способа по изобретению является секвенирование образцов нуклеиновых кислот, таких как хромосомальные или полные геномные ДНК. В данном разделе описана работа вышеупомянутого аппарата и способ по изобретению со ссылками на данное конкретное применение, причем подразумевается, что такой порядок действий и способ будут применимы к исследованиям химических групп в любом образце.

В своем самом простом варианте способ используется для анализа одной или нескольких химических групп отдельной молекулы или группы подобных молекул, локализованной на определенном участке детектирования на субстрате. В этом варианте применения отдельная нанолинза, расположенная, например, на свободном конце консоли перемещается по направлению к образцу, например, на расстояние в интервале менее 10-40 микрон до достижения максимального усиления отличительной характеристики спектра усиленного комбинационного рассеяния.

Альтернативно спектральные характеристики могут регистрироваться при поочередном перемещении нанолинзы к и от поверхности образца с получением спектра образца, переменного во времени. Для генерирования переменного во времени спектра могут быть использованы, например, осцилляции нанолинзы в интервале от 0,1 до 10 нм.

В более общем случае способ идентификации химических групп в образце по изобретению включает стадии сначала крепления образца к субстрату, имеющему зеркальную поверхность, на которой размещается образец и которая сформирована из плазмонно-резонансного металла. Световой луч направляют на нанолинзу описанного выше типа для создания мод электромагнитного зазора в ближней зоне в пространстве между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектирования на поверхности субстрата при величине зазора между нанолинзами и субстратом 30 нм или меньше. Линзовый узел затем перемещают в направлении к или от поверхности субстрата при расстоянии между нанолинзой и поверхностью субстрата менее 40 нм для создания мод электромагнитного зазора, усиливающих сигналы комбинационного рассеяния, генерируемые образцом на участке детектирования. Свет, излучаемый или рассеиваемый образцом на участке детектирования, улавливается детектором и преобразуется в спектр комбинационного рассеяния с усилением в зазоре, позволяющий идентифицировать химическую группу на участке детектирования.

В тех случаях, когда образец содержит множество групп, расположенных в продольном направлении на линейном участке образца молекулы, как в случае идентификации последовательных групп оснований образца нуклеиновой кислоты, вышеописанная процедура применяется последовательно к каждому основанию по мере перемещения нанолинзы относительно субстрата.

Такое перемещение может осуществляться посредством передвижения консоли относительно неподвижного субстрата или передвижения столика субстрата относительно неподвижной нанолинзы. После установки нанолинзы в каждое следующее положение она затем перемещается по направлению к образцу или от него для нахождения оптимального расстояния детектирования или для генерирования изменяющегося во времени спектра, как описано выше. Взаимное расположение линзы и оснований образца может поддерживаться с помощью одной из различных методик приведения. Например, "контрольная" нанолинза может отслеживать детектируемые основания в закрепленном на субстрате образце ДНК с известной последовательностью. Благодаря отслеживанию этой последовательности одновременно с проведением анализа одного или нескольких образцов с неизвестными последовательностями аппарат может подтвердить, что относительное перемещение линзы и субстрата обеспечивает сохранение взаимного расположения образца и последовательных оснований ДНК. Альтернативно одна из консолей аппарата может быть щупом сканирующего атомно-силового микроскопа для детектрования перемещения щупа относительно каждого снования в контрольной цепи ДНК в процессе перемещения матрицы консольных устройств вдоль цепей ДНК.

В более распространенном способе применения множество линейных образцов цепей, например цепей ДНК, размещается на едином субстрате для одновременного считывания множеством нанолинз, как обозначено позицией 82 в аппарате на Фиг.1. Фиг.5а и 5b иллюстрируют данную операцию применительно к считыванию множества вытянутых ориентированных цепей ДНК, таких как цепь 210, нанесенная на субстрат 310. Хотя на фигурах изображен один линзовый узел, состоящий из консоли 160 с установленной на ее свободном конце нанолинзой 180, следует понимать, что аппарат включает матрицу линзовых узлов по одному на каждую из цепей, расположенных с определенной ориентацией на субстрате.

При перемещении группы линзовых узлов вдоль субстрата положение каждого линзового узла регулируется по вертикали (по направлению к субстрату) с целью оптимизации спектрального сигнала. Как видно на Фиг.5b, такое вертикальное перемещение позволяет эффективно разместить моды зазора, создаваемые путем концентрирования электромагнитных мод, в ближней зоне между линзой, сформированной из PRP, таких как обозначенные позицией 185, и плазмонно-резонансной поверхностью, обозначенной позицией 310.

Спектры усиленного комбинационного рассеяния химических групп (оснований) каждой цепи последовательно регистрируются с помощью многоканального рамановского спектрографа и оцифровываются с помощью двумерной интегральной матрицы ПЗС (ICCD) с цифровой записью. Сигнал, поступающий от рамановского спектрометра, сохраняется в памяти компьютера для дальнейшего анализа. Конечные результаты получают в форме последовательность нуклеотидных оснований А, Т, G, С. В ходе процедуры сканирования нанолинзовый щуп осуществляет детектирования каждого основания (А, Т, G, С) в цепи ДНК как спектроскопически, так и топографически.

Спектры SERS регистрируются последовательно для каждого основания, что позволяет идентифицировать каждое отдельное основание (А, Т, G, С) в цепи ДНК по его уникальной сигнатуре усиленного спектра, характерной для данного основания, обеспечивая возможность прямого поэлементного (de novo) секвенирования индивидуальных фрагментов молекулы ДНК. Известно, что спектроскопия SERS А, Т, G и С, проведенная на плазмонно-резонансном субстрате, дает различающиеся спектры, позволяющие идентифицировать разные основания. Настоящее изобретение позволяет идентифицировать индивидуальные основания ДНК за счет фокусирования поля возбуждения в узком зазоре между линзой и субстратом и использования усиления сигналов комбинационного рассеяния в зазоре, что дает возможность производить прямое последовательное определение оснований ДНК.

Число консолей с волоконно-оптическими кончиками, которые могут быть использованы в матрице, в принципе неограничено, однако для однопроходного секвенирования самой большой хромосомы человека (хромосома человека №1, содержащая примерно 263 миллиона оснований) аппарат должен иметь примерно 100 линзовых узлов, каждый из которых осуществляет считывание фрагмента размером примерно 2,5-3,0 млн оснований. Принимая время замера, равным 0,01 с, получаем, что аппарат завершит определение последовательности этой хромосомы менее чем за примерно 10 часов сканирования. При практическом использовании такого устройства возможно использовать параллельно до нескольких сотен каналов в матрице (по 1 цепи ДНК на канал) при скорости проведения замера от 0,01 до 1 секунды на основание.

В более широком смысле способ идентификации химических групп в образце по изобретению включает стадии сначала крепления образца к субстрату, имеющему зеркальную поверхность, на которой размещается образец, сформированную из плазмонно-резонансного металла. Световой луч направляется на нанолинзу описанного выше типа для создания мод электромагнитного зазора в ближней зоне в пространстве между нанолинзой и прилегающим к ней участком детектирования на поверхности субстрата при величине зазора между нанолинзой и субстратом 4 нм или меньше. Линзовый узел затем перемещается по направлению к поверхности субстрата или от нее, при величине расстояния между нанолинзой и поверхностью субстрата менее 40 нм, для создания мод электромагнитного зазора, усиливающих спектральные сигналы комбинационного рассеяния, генерируемые образцом на участке детектирования. Свет, излучаемый или рассеиваемый образцом на участке детектирования, улавливается детектором и преобразуется в спектр комбинационного рассеяния с усилением в зазоре, позволяющий идентифицировать химическую группу на участке детектирования.

Степень усиления спектров комбинационного рассеяния, достижимую в соответствии с настоящим изобретением, можно оценить с помощью Фиг.6-8. На этих фигурах напряженность электромагнитного поля Е рассчитывали путем моделирования системы и решения уравнений Максвелла в приближении ближней зоны методом интегрального приближения.

Фиг.6а показывает изменение Е в виде функции, эВ, для линзы, состоящей из трех частиц. Распределение поля в центральной области линзы изображено на Фиг.6с. Фиг.6b изображает график зависимости напряженности поля вдоль оси у на Фиг.6с по линии х=0. Видно, что степень усиления напряженности поля достигает максимума, равного примерно 1400 (усиление по сравнению с падающим светом), в точке y=0,5 рядом с верхней частицей на Фиг.6с.

Аналогичный набор графиков приведен на Фиг.7а-7с, но в этом случае линза сконструирована из четырех симметричных частиц, как видно по диаграмме распределения поля на Фиг.7с. Фиг.7b изображает симметричное распределение Е вдоль линии x, равной нулю, при изменении координаты y от дна до потолка. При построении графика вдоль диагональной линии между точками -1, -1 и +1, +1 получаем график, представленный на Фиг.8 и имеющий коэффициент усиления, равный почти 3000, в точках, расположенных между частицами на некотором расстоянии от центра.

Согласно преобладающему мнению усиление комбинационного рассеяния имеет электромагнитный механизм, причем сигнал комбинационного рассеяния пропорционален Е⁴ (M.Moskovits, Rev. Mod. Phys., v.57, p.783, 1985), где Е обозначает локальное усиление поля в области молекулы. В случае коэффициента усиления поля, равного 500, усиление сигнала комбинационного рассеяния составит 500⁴=6,25×10¹⁰ , что намного превышает значения, описанные в литературе. Для достижения такого усиления молекула образца должна находиться в центре нанолинзы, состоящей из нескольких частиц. Однако, если молекула находится также рядом с плазмонно-резонансной поверхностью, коэффициент усиления поля может достигать значения 3000, что соответствует усилению сигнала комбинационного рассеяния до 8,1×10 ¹⁵, позволяющему детектировать химические группы отдельной молекулы.

Хотя изобретение было описано по отношению к конкретным вариантам исполнения и областям применения, следует понимать, что могут быть сделаны различные изменения и модификации, не выходящие за пределы изобретения.