способ контроля качества вакцинации цыплят против болезни марека

Формула изобретения

Способ контроля вакцинации цыплят против болезни Марека, включающий отбор и исследование биоматериала от цыплят, привитых вакциной против болезни Марека, отличающийся тем, что отбор биоматериала производят из внутренних органов, а исследование на наличие геномной ДНК вакцинного штамма вируса проводят в полимеразной цепной реакции с использованием праймеров со следующими нуклеотидными последовательностями: 5'-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3' (сайт отжига 1210-1231 п.н.) и 5'-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3' (сайт отжига 1567-1549 п.н. от первого ТАТА-сигнала гена гликопротеина А вируса болезни Марека).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к способам контроля качества вакцинации сельскохозяйственной птицы против болезни Марека (БМ).

Известен способ обнаружения ДНК вируса болезни Марека с помощью полимеразной цепной реакции (А.Г.Амниев, С.В.Полехин, В.Г.Андреев, А.А.Гусев. Обнаружение и типирование генома вируса болезни Марека методом полимеразной цепной реакции.// Прикладная молекулярная биология, 1998, том 32, №5, с.916-922). Для проведения реакции используют праймеры MU 906 (GTGGAAAGAGGTGACTGAAATG), MU 1379 (AGAAATTGGAGCATGGCGA), программа амплификации состоит из следующих этапов: 95°С - 40 с; 50°С - 40 с, 72°С - 40 с (30 циклов).

Однако данный способ предназначен для выявления вируса болезни Марека в культуре клеток, либо патологическом материале от заболевших птиц и не используется для контроля вакцинации.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому и взятым за прототип является способ, основанный на иммуноферментном анализе (ИФА). Качество вакцинации определяют по проценту цыплят, имеющих титры антител к вирусу болезни Марека (ВБМ) (Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Быкова Н.Н., Скороходова Л.А., Бобровская И.В., Тетеричев В.И. Экспресс-метод определения специфических антител и прогнозирования эффективности вакцины против БМ//Тез. докл. конф. «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе». М., 1999, с.33-34).

Недостаток данного способа в недостоверности контроля эффективности вакцинации по показателям гуморального иммунитета, т.е. титрам антител, так как иммунитет к болезни Марека преимущественно клеточный и напрямую зависит от наличия вакцинного штамма вируса болезни Марека в клетках организма. Таким образом, наличие антител к вирусу болезни Марека может свидетельствовать о контакте организма с его антигенами, но не дает гарантии что вирус сохранился в клетках птицы.

Технической задачей заявляемого решения является раннее обнаружение вакцинного штамма вируса болезни Марека в организме цыплят и повышение точности исследований.

Поставленная техническая задача решается тем, что в способе контроля качества вакцинации, включающем отбор проб и исследование биоматериала от цыплят, привитых вакциной против болезни Марека, согласно изобретению, отбор биоматериала производят из внутренних органов, а исследование на наличие вакцинного вируса проводят в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Сущность изобретения заключается также в том, что для выявления геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) вируса болезни Марека в ПЦР используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: 5'-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3' (сайт отжига 1210-1231 п.н.) и 5'-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3' (сайт - отжига 1567-1549 п.н. от первого ТАТА-сигнала гена гликопротеина А вируса болезни Марека).

Способ осуществляют следующим образом:

Материал: убитые с диагностической целью цыплята.

Отбор материала: пробы внутренних органов (например, печени) отбирают любым пригодным для последующей постановки ПЦР способом. Традиционным способом производят выделение ДНК.

Для постановки ПЦР реакцию проводят по следующему температурному режиму (Табл.1).

Таблица 1
этап	температура, °С	число циклов	время, мин
1	2	3	4
1	95	1	пауза
2	95	1	5
3	95	40	1
	63	40	1
	72	40	1
4	72	1	5

В реакции используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: 5'-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3' (сайт отжига 1210-1231 п.н.) и 5'-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3' (сайт - отжига 1567-1549 п.н. от первого ТАТА-сигнала гена гликопротеина А вируса болезни Марека).

Продукты ПЦР разделяют методом горизонтального электрофореза в 2% агарозе. Результаты ПЦР учитывают, визуализируя окрашенный бромистым этидием ПЦР-продукт (ампликон) в ультрафиолетовом свете. В случае положительной реакции в электрофорезе появляется фрагмент ДНК размером 358 п.н.

Для иллюстрации способа приведены примеры:

Пример 1. С целью подтверждения специфичности используемой ПЦР, данную реакцию ставили с геномной ДНК различных микроорганизмов и вирусов, которые могут присутствовать в организме птицы (Табл. 2).

Таблица 2
№ трека	Вид микроорганизма	Наличие ампликона специфичного для ВБМ
1	2	3
1	Pseudomonas auregenosa	-
2	S. aureus	-
3	Serratia marcescens	-
4	E. coli ATCC 25922	-
5	Пат. материал от цыпленка положительного на сальмонеллу в ПЦР	-
6	Listeria monocitogenes	-
7	lersinia pseudotuberculosis	-
8	Serratia marcescens	-
9	E. coli (полевой изолят)	-
10	E.coliO157H7	-
11	Пат. материал от цыпленка отрицательный на ВБМ
12	Пат. материал от цыпленка положительный на сальмонеллу в ПЦР и отрицательный на ВБМ
13	Пат. материал от цыпленка отрицательный на сальмонеллу и ВБМ в ПЦР
14	ВБМ 2 и 3 серотипы	+
15	ВБМ + Salmonella	+
16	Отрицательный контроль	-

Таким образом, в приведенном примере видна достаточная специфичность предложенной нами реакции.

Пример 2. Для оценки чувствительности метода была проведена серия десятикратных разведений вируссодержащего материала с начальной концентрацией 1000 БОЕ/мл. После этого с каждым разведением была поставлена ПЦР с использованием заявляемого способа и ПЦР, приведенного в качестве аналога (см. табл.3).

Таблица 3
Концентрация ВБМ в пробе, БОЕ/мл	Результаты ПЦР, заявляемой в нашем способе	Результаты ПЦР, приведенной в аналоге
1	2	3
1000	Положительно	Положительно
100	Положительно	Положительно
10	Положительно	Отрицательно
1	Отрицательно	Отрицательно
0	Отрицательно	Отрицательно

Как следует из таблицы 3, чувствительность заявляемой в нашем способе ПЦР выше в 10 раз по сравнению с аналогичным методом. Этому способствуют 2 фактора - более короткий ампликон (синтезируемый фрагмент ДНК), что повышает эффективность протекания реакции и очень низкий уровень фона, что повышает эффективность использования компонентов реакции только для синтеза специфического ПЦР-продукта и позволяет использовать более высокие концентрации праймеров, не опасаясь появления неспецифических реакций.

Пример 3. Для оценки качества вакцинации птицы против БМ проведены следующие исследования.

Для исследований были отобраны цыплята 8-10-дневного возраста, привитые вакциной «бимарек» производства ВНИИЗЖ, из разных птицефабрик (6 групп). Цыплята были подвергнуты диагностическому убою, из проб печени выделили ДНК и тестировали на наличие вируса болезни Марека с использованием предложенной нами ПЦР. Параллельно из этих же птицефабрик были отобраны пробы крови от цыплят в возрасте 18 суток и поставлена ИФА (иммуноферментный анализ) на наличие антител к ВБМ. Разница в возрасте цыплят (8-10-ти суточные и 18-ти суточные) объясняется тем, что накопление и расселение вируса болезни Марека по организму происходит в более ранние сроки, чем последующая выработка антител к нему.

Таблица 4
группа	Размеры выборки	Результаты ИФА	Результаты ПЦР на ВБМ
1	2	3	4
1	10	100	100
2	10	100	100
3	10	100	100
4	10	90	60
5	10	100	100
6	10	60	50

Анализ таблицы (Табл.4) показывает различный процент инфицированности цыплят ВБМ от 100 до 50%, кроме того, мы видим, что обнаружение антител не всегда сопровождается наличием вируса в организме. В подобной ситуации часть результатов ИФА, в аспекте контроля процента иммунной птицы, можно рассматривать как ложноположительные.

Таким образом, заявляемый способ позволяет более точно и в более ранние сроки контролировать качество вакцинации цыплят против болезни Марека и корректировать противоэпизоотические мероприятия. В связи с этим, мы можем считать целесообразным использование заявленной нами ПЦР с целью оценки качества вакцинации и выявления не иммунных к вирусу болезни Марека цыплят.