стромальные клетки, полученные из жировой ткани, для заживления дефектов роговицы и внутриглазных дефектов и их использование

Формула изобретения

1. Выделенная стромальная клетка, полученная из жировой ткани, подвергнутая дифференцировке для экспрессии по меньшей мере одного ассоциированного с глазной клеткой маркера, характерного для глазной клетки.

2. Полученная из жировой ткани стромальная клетка по п.1, отличающаяся тем, что она подвергнута дифференцировке in vitro.

3. Полученная из жировой ткани стромальная клетка по п.1, отличающаяся тем, что она подвергнута дифференцировке in vivo.

4. Полученная из жировой ткани стромальная клетка по п.1, отличающаяся тем, что экзогенный генетический материал введен в выделенную стромальную клетку, полученную из жировой ткани, перед дифференцировкой.

5. Полученная из жировой ткани стромальная клетка по п.1, отличающаяся тем, что является клеткой человека.

6. Полученная из жировой ткани стромальная клетка по п.1, отличающаяся тем, что имплантирована хозяину.

7. Полученная из жировой ткани стромальная клетка по п.1, отличающаяся тем, что экзогенный генетический материал введен в клетку.

8. Полученная из жировой ткани стромальная клетка по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что является эпителиальной клеткой роговицы.

9. Полученная из жировой ткани стромальная клетка по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что является глазной стромальной клеткой.

10. Композиция, для лечения заболевания глаза, дегенеративного состояния или послеоперационного состояния, содержащая выделенную стромальную клетку, полученную из жировой ткани, подвергнутую дифференцировке для экспрессии по меньшей мере одного ассоциированного с глазной клеткой маркера, характерного для глазной клетки, и биосовместимый материал.

11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что биосовместимый материал выбран из группы, состоящей из амниотической мембраны, коллагена, гидрогеля, полигликолевой кислоты, полимолочной кислоты, полигликолевой/полимолочной кислоты, гиалуроната или фибрина.

12. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что биосовместимым материалом является амниотическая мембрана.

13. Композиция по любому из пп.10-12, отличающаяся тем, что глазной клеткой является эпителиальная клетка роговицы.

14. Композиция по любому из пп.10-12, отличающаяся тем, что глазной клеткой является глазная стромальная клетка.

15. Способ дифференцировки выделенных стромальных клеток, полученных из жировой ткани, для экспрессии ею по меньшей мере одного ассоциированного с глазной клеткой маркера, предусматривающий стадию контактирования выделенной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, с внутриглазной тканью по месту ее расположения у хозяина.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что выделенные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, берут от хозяина.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что стромальные клетки, полученные из жировой ткани, берут от донора, который не является хозяином.

18. Способ дифференцировки in vitro выделенных стромальных клеток для экспрессии ими по меньшей мере одного маркера, характерного для глазной клетки, полученных из жировой ткани, предусматривающий стадию контактирования выделенной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, с веществом, индуцирующим глазную функцию.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что вещество, индуцирующее глазную функцию, находится в среде для культивирования с заданным химическим составом.

20. Способ по п.18, отличающийся тем, что маркером глазной клетки является маркер эпителиальной клетки роговицы.

21. Способ по п.18, отличающийся тем, что маркером глазной клетки является маркер стромальной глазной клетки.

22. Способ лечения заболевания глаза, дегенеративного состояния или послеоперационного состояния у хозяина, предусматривающий

i) индуцирование в выделенной стромальной клетке, полученной из жировой ткани, экспрессии по меньшей мере одного маркера глазной клетки; и

ii) трансплантацию индуцированной клетки хозяину.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что стромальные клетки, полученные из жировой ткани, выделяют из организма хозяина.

24. Способ по п.22, отличающийся тем, что заболеванием глаза, дегенеративным состоянием или операционным состоянием является аниридия, эитрокератодермия, кератит, химические поражения; термические поражения; кератопатия, вызванная ношением контактных линз; повторные операции на лимбе, недостаточность лимбической системы, фоторефракционная кератэктомия, лазерный in situ кератомилез, аутоиммунная дисфункция или вирусная или бактериальная инфекция.

25. Способ лечения заболевания глаза, дегенеративного состояния или послеоперационного состояния у хозяина, предусматривающий

i) выделение стромальной клетки, полученной из жировой ткани; и

ii) трансплантацию клетки во внутриглазное пространство хозяина.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что стромальные клетки, полученные из жировой ткани, выделяют из организма хозяина.

27. Способ по п.25, отличающийся тем, что заболеванием глаза, дегенеративным состоянием или операционным состоянием является аниридия, эитрокератодермия, кератит, химические поражения; термические поражения; кератопатия, вызванная ношением контактных линз; повторные операции на лимбе, недостаточность лимбической системы, фоторефракционная кератэктомия, лазерный in situ кератомилез, аутоиммунная дисфункция или вирусная или бактериальная инфекция.

28. Способ по любому из пп.25-27, отличающийся тем, что стромальную клетку, полученную из жировой ткани, перед трансплантацией хозяину подвергают де-дифференцировке.

Описание изобретения к патенту

Ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке заявлен приоритет на основании патентной заявки США с серийным номером 60/347605, поданной 9 ноября 2001 г.

Область изобретения

В настоящем изобретении представлены выделенные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, у которых индуцируют экспрессию по крайней мере одного признака внутриглазной стромальной клетки. Предлагаются также способы заживления дефектов роговицы глаза и внутриглазных дефектов с использованием дифференцированных или недифференцированных стромальных клеток, полученных из жировой ткани.

Предпосылки изобретения

Глаз является сложным органом, состоящим из разных типов тканей. Глаз составляют три различных оболочки; от внешней к внутренней: склера и роговица, собственно сосудистая оболочка глаза и сетчатка. Внутри трех оболочек находятся преломляющие среды: внутриглазная жидкость, хрусталик и стекловидное тело. Стромальные клетки являются интегральным компонентом каждого слоя глаза и осуществляют важное регуляторное взаимодействие с расположенными рядом эпителиальными, эндотелиальными, нервными и воспалительными клетками. На глаз и выполняемые им функции оказывает влияние ряд состояний. Например, болезни роговицы включают так называемые первичные и вторичные заболевания (Kruse & Volcker, 1997, Curr. Opin. Ophthalmol. 8(4): 46-54). Первичные заболевания глаза включают, однако ими не ограничиваются: аниридию, или отсутствие радужной оболочки; эритрокератодермию, или покраснение и гиперкератоз кожи; и кератит с многочисленными эндокринными недостаточностями. Вторичные заболевания глаза включают, однако ими не ограничиваются: химические поражения, термические поражения; кератопатию, вызванную ношением контактных линз; повторные операции на лимбе и лентовидную кератопатию, дегенеративное состояние, при котором серая полоса вещества развивается от лимба в сторону роговицы.

Многие из указанных заболеваний протекают с участием процесса самообновления стволовых клеток роговицы, располагающихся в базальном слое лимба, который размещается между роговицей и конъюнктивой (Kruse & Volcker, 1997, Curr. Opin. Ophthalmol. 8(4): 46-54). Недостаточность лимбической системы или дисфункция стволовых клеток приводит к таким симптомам, которые включают светобоязнь, воспаление, отек и спазм мускулатуры, регулирующей веко. В некоторых случаях, как, например, при локальных химических ожогах, они могут быть скорректированы трансплантацией здоровой ткани лимба на пораженные участки роговицы. Многочисленные данные свидетельствуют, что для нормального функционирования критичным является взаимодействие между стволовыми клетками роговицы и подлежащей стромой.

Два соседствующих типа клеток демонстрируют специфические аутокринный и паракринный пути метаболизма. Посредниками на этих метаболических путях выступают цитокины, высвобождаемые стромальными клетками, которые включают, однако ими не ограничиваются, трансформирующий фактор роста 1 и 2 (TGF ), инсулиноподобный фактор роста (IGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор роста кератиноцитов (KGF). Рецепторы к каждому из указанных цитокинов синтезируются эпителиальными клетками роговицы. Аналогично эпителиальные клетки роговицы синтезируют TGF 1 и TGF 2, IGF, bFGF и фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF). За исключением рецептора к VEGF, стромальные клетки экспрессируют рецепторы ко всем этим цитокинам, а также фактор роста тромбоцитов (PDGF) и эпидермальный фактор роста (EGF) (Kruse & Volcker, 1997, Curr. Opin. Ophthalmol. 8(4): 46-54).

Роговица играет важную роль в поддержании нормального зрения путем рефракции света на хрусталик и сетчатку. Это требует постоянного самообновления эпителиальных клеток роговицы с целью защиты более глубоко расположенных слоев этих тканей от инфекции (Lu et al., 2001, Exp. Biol. Med. 226(7): 653-64). Хирургические операции, такие как фоторефракционная кератэктомия или лазерный in situ кератомилез, включают удаление части роговицы. Указанные операции проводят для лечения форм миопии или близорукости (Wilson et al., 2001, Arch. Ophthalmol.: 119(6): 889-96).

Заживление после проведения указанных операций требует сокращения стромы, сопровождающегося расслоением эпителия (Taliana et al., 2001, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.; 42(1): 81-9). В процессе заживления многие пациенты испытывают послеоперационное переднее "помутнение стромы", которое проявляется в животных моделях появлением миофибробластов, экспрессирующих альфа-актин гладких мышц ( -SMA) (Nakamura et al., 2001, Br. J. Ophthalmol.; 85(2): 209-13). Указанные миофибробласты индуцируются в культуре TGF и in vivo блокируются анти-TGF антителами (Jester et al., Cornea; 16(2): 177-87; Jester et al., 1999, Prog. Retin Eye Res.; 18(3): 311-56). В то же время они свидетельствуют о том, что прямое взаимодействие между эпителиальными клетками и подлежащей стромой может индуцировать стромальную дифференцировку миофибробластов. На этот процесс оказывает также воздействие присутствие амниотических мембран (Choi & Tseng, 2001, Cornea; 20(2): 197-204). Степень "помутнения стромы" в животных моделях соответствует глубине поражения стромы роговицы в процессе проведения фоторефракционной кератэктомии (Moller-Pedersen et al., 1998, Cornea; 17(6): 627-39). У пациентов степень "помутнения стромы" является той же, независимо от методики удаления эпителиальных клеток (механическим или лазерным воздействием) (Lee et al., Ophthalmology; 108(1): 112-20).

Для лечения и репарации дефектов роговицы и глаза использовались разнообразные материалы. Внеклеточный матрикс роговицы содержит большое количество коллагена и гликозаминогликанов (Robert et al., 2001, Pathol. Biol. (Paris); 49(4): 353-63). Было показано, что гликозаминогликан, гиалуронан, облегчает заживление эпителия роговицы после ран в крысиных и кроличьих моделях, что оценивали наблюдением за стромальными и эндотелиальными слоями (Nakamura et al., 1997, Exp. Eye Res.; 64(6) 1043-50; Chung et al., 1999, Ophthalmic Res.; 31(6): 432-9). Tseng и др. первыми использовали амниотические мембраны при лечении различных болезней глаз (патент США № 6152142). Амниотическая мембрана является поляризованной и имеет "стромальную" сторону и сторону "базисной мембраны". Стромальная сторона содержит коллаген I и коллаген III и фибронектин с распределенным на нем тонким слоем базальных пластинок коллагена типа IV, ламинин и протеогликан гепаринсульфат. Базисная сторона амниотической мембраны поддерживает рост клеток эпителия, в то время как стромальная сторона поддерживает рост фибробластов аналогично тому, как поддерживается формирование коллагена. Амниотическую мембрану выделяют из плаценты человека, хранят при криогенных температурах, а затем используют для проведения хирургических операций при лечении заболеваний глаз.

Механизм действия амниотической мембраны еще не полностью выявлен. Однако в условиях in vitro получены доказательства того, что присутствие амниотической мембраны в культуре подавляет экспрессию TGF фибропластами (Lee et al., 2000, Curr. Eye Res.; 20(4): 325-334) и интерлейкина-1 и интерлейкина-1 эпителиальными клетками (Solomon et al., 2001, Br. J. Ophthalmol.; 85(4): 444-449).

Амниотические мембраны с успехом использовали для лечения широкого круга дефектов роговицы и глаза. Например, глубокие язвы роговицы и склеры лечили с использованием мультислоев амниотической мембраны для заполнения слоя стромы, базальных мембран и для закрытия ран (Hanada et al., 2001, Am. J. Ophthalmol.; 131(3): 324-31). Было показано, что амниотическая мембрана уменьшает воспаление стромы и образование язв при кератите, вызванном ВИЧ-1, и опосредованных иммунной системой заболеваниях (Heiligenhaus et al., 2001, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.; 42(9): 1969-1974). С помощью амниотической мембраны лечили также тяжелые нейротрофические язвы роговицы (Chen et al., 2000, Br. J. Ophthalmol.; 84(8): 826-833). Амниотическая мембрана восстанавливает поверхность роговицы и конъюнктивы и уменьшает воспаление стромы лимбической системы, вызванное острыми химическими и термическими ожогами (Meller et al., 2000, Ophthalmology; 107(5): 980-989). Амниотическую мембрану использовали в качестве альтернативы лимбическому аутогенному трансплантанту или аллогенному трансплантанту у пациентов с частичной недостаточностью стволовых клеток лимба (Anderson et al., 2001, Br. J. Ophthalmol.; 85(5): 567-575). Амниотическую мембрану использовали также при хирургическом лечении птеригии, крыловидной складки мембраны, которая простирается от конъюнктивы до роговицы, с прикреплением к склере (Solomon et al., 2001, Ophthalmology; 108(3), 449-460). Амниотические мембраны с успехом использовали в качестве альтернативы конъюнктиве в случаях возникновения истечений фильтрационной подушечки при глаукоме (Budenz et al., 2000, Am. J. Ophthalmol.; 130(5): 580-588; Barton et al., 2001, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.; 42(8): 1762-1768), а также для ускорения восстановления стойкого эпителия роговицы и снижения глазной боли, при проведении хирургического лечения лентовидной кератопатии, осаждения кальция в базальной мембране роговицы в результате саркоидоза, хронического увеита и других причин (Anderson et al., 2001, Cornea; 20(4): 354-361).

В связи со сложностями получения амниотических материалов исследователи вели поиски альтернативных источников материала стромы для заживления дефектов глаза и роговицы.

В европейской заявке EP 93830229.6, поданной авторами Cancedda et al., приводятся способы культивирования уже прошедших in vitro дифференцировку клеток эпителия глаза для использования при последующих трансплантациях для лечения дефектов роговицы. Источником эпителиальных клеток является материал, полученный аутогенной биопсией из здорового глаза. Таким образом, пациент одновременно является и донором, и хозяином.

В патенте США № 6117675, выданном авторам Kooy et al., приводятся стволовые клетки, выделенные из сетчатки млекопитающего, которые дифференцируют in vitro в эпителиальные клетки пигмента сетчатки и которые затем трансплантируют индивиду, страдающему заболеваниями сетчатки. Источником стволовых клеток сетчатки являются эмбриональная ткань или ранняя послеродовая ткань.

В патенте США № 5912178, выданном автору Wille, Jr., приводятся среды и способы in vitro формирования различных типов гистологически полного эпителия человека, включая эпидермы, роговицу, десневую ткань и ткань мочеточников. Полученный эпителий выращивают in vitro из выделенных эпителиальных клеток животного или базальных стволовых клеток эпителиальных тканей.

В патенте США № 5942487, выданном авторам Ogawa et al., приводится композиция, включающая фактор стволовых клеток, которую можно наносить на больную ткань роговицы с целью стимулирования роста роговицы. Авторы предполагают, что происходит стимулирование стволовых клеток роговицы к миграции и росту.

В патенте США № 5863531, выданном компании Advanced Tissue Science, Inc., приводится трубчатая жизнеспособная ткань стромы, полученная в условиях in vitro, которая включает стромальные клетки и белки соединительной ткани, обычно естественно секретируемые стромальными клетками, которые присоединены к трехмерному трубчатому каркасу, образованному биосовместимым материалом неживого происхождения, в котором внутритканевые пространства соединены стромальными клетками, и практически обволакивают его.

Целью настоящего изобретения является клетка, материал и способ, способствующий заживлению дефектов глаза, включая дефекты роговицы.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении представлена стромальная клетка, полученная из жировой ткани, которую подвергают дифференцировке с тем, чтобы она обладала по крайней мере одним генотипическим или фенотипическим признаком внутриглазной клетки или стромальной клетки глаза. Эту клетку можно использовать для терапевтического лечения дегенеративных или других заболеваний глаза.

В настоящем изобретении представлены также способы и композиции для использования и культивирования стромальных клеток, полученных из жировой ткани, для лечения внутриглазных дефектов или дефектов глаза любой этиологии.

Другим аспектом настоящего изобретения являются способы и композиции для последовательного количественного и качественного индуцирования у стромальных клеток, полученных из подкожной жировой ткани, жировой ткани молочной железы, гонадной жировой ткани, сальниковой жировой ткани или из любых других мест расположения жировой ткани, экспрессии по крайней мере одного генотипического или фенотипического признака внутриглазной клетки или стромальной клетки глаза.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения выделенные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, подвергают дифференцировке в клетку, которая экспрессирует по крайней мере один признак внутриглазной стромальной клетки, включающей стадии контактирования выделенной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, с веществом, индуцирующим глазную функцию. Указанное вещество содержится в имеющей химически заданный состав среде для выращивания клеточной культуры и включает факторы роста, цитокины, химические агенты и/или гормоны с концентрацией, достаточной для индуцирования у стромальных клеток, полученных из жировой ткани, экспрессии по крайней мере одного маркера глазной клетки.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения стромальные клетки, полученные из жировой ткани, подвергают методам генной инженерии с тем, чтобы они могли экспрессировать белки, которые способны модифицировать фенотип клетки и индуцировать метаболические пути, облегчающие восстановление и залечивание любого внутриглазного дефекта. Указанную процедуру осуществляют путем воздействия на клетку вектором переноса гена, включающего нуклеиновую кислоту, которая содержит трансген, в подходящих условиях таким образом, что требуемая нуклеиновая кислота вводится в клетку. В качестве альтернативы на клетку действуют "голой" нуклеиновой кислотой и дают ей встроиться в клетку.

Далее в изобретении предлагается способ лечения дегенеративного состояния глаза у хозяина, который включает введение стромальных клеток, полученных из жировой ткани, у которых индуцируют экспрессию признака требуемой глазной клетки. Несомненным преимуществом настоящего изобретения является то, что стромальные клетки, полученные из жировой ткани, можно взять непосредственно у хозяина (аутогенная трансплантация) или же в качестве донора может выступать другой хозяин (аллогенная трансплантация).

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения стромальные клетки, полученные из жировой ткани, культивируют в их недифференцированном или дифференцированном состоянии в трехмерной матрице, содержащей натуральный или синтетический биосовместимый материал, который предполагается использовать для хирургической репарации мест внутриглазной стромы, пораженной язвой.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения стромальные клетки, полученные из жировой ткани, прямо используют без дифференцировки для аутогенной или аллогенной трансплантации клеток с целью обеспечения успешного хирургического лечения глаукомы путем коррекции оттока глазной жидкости из камеры. В этом варианте стромальные клетки, полученные из жировой ткани, вводят в глаз, предпочтительно в требуемое место, и дают им возможность дифференцироваться либо (i) с помощью совместно введенных соответствующих цитокинов или других биологических факторов, либо (ii) за счет in vivo факторов, уже присутствующих или индуцированных у хозяина.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения стромальные клетки, полученные из жировой ткани, используют для аутогенной или аллогенной трансплантации клеток для лечения болезненных состояний у человека, включая в том числе, однако этим не ограничиваясь, помутнение роговицы, вызванное фоторефрактивной/терапевтической кератэктомией, заживления в процессе удаления "голой склеры" при птеригии, хирургического лечения лентовидной кератопатии, хирургического удаления опухолей, поражений или рубцовой ткани с поверхности конъюнктивы или роговицы.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения стромальные клетки, полученные из жировой ткани, трансплантируют в пораженный глаз вместе с амниотической мембраной.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения стромальные клетки, полученные из жировой ткани, перед трансплантацией в пораженный глаз подвергают дифференцировке по адипобластному направлению дифференциации.

Наконец, в соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения стромальные клетки, полученные из жировой ткани, подвергают дифференцировке по адипобластному направлению дифференциации и трансплантируют в пораженный глаз вместе с амниотической мембраной.

Клетки по настоящему изобретению используют либо как гомогенную популяцию клеток, либо как часть популяции клеток, в которой другие клетки секретируют вещества, поддерживающие рост или дифференцировку клетки, подобной глазной клетке.

В настоящем изобретении также предлагается набор для выделения стромы или стромальной клетки из жировой ткани, который включает средства для выделения жировой ткани от пациента и средства для отделения стволовых клеток от остальной жировой ткани. Набор также включает среду для осуществления дифференцировки стволовых клеток, при этом среда вызывает в клетках экспрессию по крайней мере одного генотипического или фенотипического признака глазной клетки или в общем случае является окулярогенной.

Настоящее изобретение включает также композиции и способы для тканевой инженерии с использованием клеток по настоящему изобретению, полученных из жировой ткани. Подобные композиции включают полученные из жировой ткани клетки в сочетании с биологически совместимой решеточной структурой, которая позволяет ткани дифференцироваться и размножаться. Указанным образом формируют глазоподобную ткань или орган целиком. Биологически совместимая решетка может быть сама по себе получена из жировой ткани и может включать любой белок человека, молекулу протеогликана, гликопротеина, гиалуронина, фибронектина, а также гормон, цитокины или факторы роста. Решетка может также включать или может быть изготовлена из полимеров, полученных из мономеров, выбранных из группы, состоящей из гликолевой кислоты, молочной кислоты, пропилфумарата, капролактона, гиалуронана, гиалуроновой кислоты или их комбинации. В качестве альтернативы полимерный материал может быть белком, полисахаридом, полиоксикислотой, полиортоэфиром, полиангидридом, полифосфаценом, синтетическим полимером или их комбинацией. Полимерный материал может также быть гидрогелем, полученным сшивкой суспензии полимера, содержащей диспергированные в ней клетки.

Другие цели и особенности настоящего изобретения станут более понятны из следующего описания и прилагающейся формулы изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг.1 показывает результаты анализа методом проточной цитометрии стромальных клеток, полученных их жировой ткани человека. На графиках представлены данные цитометрических анализов для CD9, CD29 (бета 1-интегрин), CD44 (гиалуронатный рецептор), CD49d (альфа-4-интегрин), CD55 (ускоряющий разложение фактор) и HLA-ABC (антиген гистосовместимости 1 класса). Недифференцированные стромальные клетки, выделенные от одного донора, окрашивают моноклональными антителами против указанных антигенов (сплошная линия справа на каждой панели); изотипное моноклональное контрольное антитело (пунктирная линия слева на каждой панели). Представительство n=5 доноров. Черта обозначает интенсивность флуоресценции >99% над контрольным.

На фиг.2 схематически показаны предшественники лимфоидных клеток на 12-й день совместного культивирования. Значительный процент как CD34⁺, так и CD34, экспрессируемых как CD7, так и CD10 антигеном (n=4 стромальных донора, n=2 донора пуповинной крови). Индивидуальные фенотипы показывают следующие процентные отношения из общей популяции кроветворных клеток: ранние предшественники лимфоидных клеток, 20,2% (CD34 ⁺ CD7⁺) и 9,5% (CD34 ⁺ CD10⁺), соответственно; предшественники NK/Т-клеток (CD34CD7⁺), 31,4%; и предшественники В-клеток (CD34CD10⁺), 7,7%.

Подробное описание изобретения

Целью изобретения является стромальная или стволовая клетка, полученная из жировой ткани, у которой индуцируют экспрессию по крайней мере одного генотипического или фенотипического признака клетки глазного происхождения. Более предпочтительно клетка обладает по крайней мере одним генотипическим или фенотипическим признаком эпителиальной клетки роговицы. В качестве альтернативы клетка обладает по крайней мере одним генотипическим или фенотипическим признаком стромальной глазной клетки. Клетки, полученные способом по настоящему изобретению, являются источником частично или полностью дифференцированных или недифференцированных функционально дееспособных клеток, обладающих генотипическим или фенотипическим признаком зрелой глазной клетки, для проведения исследований, трансплантации и развития глазных терапевтических продуктов для лечения болезней животных, преимущественно болезней человека, заживления или улучшения тканей, а также для коррекции дегенеративных заболеваний глаз, предпочтительно эпителия роговицы. Представлены также способы получения и применения указанных клеток.

I. Определения

"Конъюнктива" представляет собой мембрану, которая выстилает веко и покрывает открытые поверхности склеры.

"Роговица" представляет собой прозрачную структуру, образующую переднюю часть фиброзной оболочки глаза. Она состоит из пяти слоев, а именно: 1) переднего эпителия роговицы, переходящего в конъюнктиву; 2) переднего граничного слоя (боуменова мембрана); 3) substantia propria, собственно вещества роговицы, или слоя стромы; 4) заднего граничного слоя (десцеметова оболочка); и 5) эндотелия передней полости или кератодермы.

"Сетчатка" представляет собой наиболее глубоко расположенную из трех оболочек глазного яблока, окружающих стекловидное тело, которая располагается позади глазного нерва. Она делится на зрительную часть (pars optica), располагающуюся собственно на сосудистой оболочке глаза, ресничную часть (pars ciliaris), располагающуюся на ресничном теле, и радужную часть (pars iridica), располагающуюся на задней поверхности радужной оболочки. В целом, сетчатка состоит из внешнего, пигментного слоя (pars pigmentosa) и внутреннего, прозрачного нервного слоя (pars nervosa), которые вместе составляют зрительную часть сетчатки (pars optica). Оптическая часть глаза состоит из 9 слоев, которые перечислены от внутреннего к внешнему: 1) внутренней ограничивающей мембраны; 2) слоя нервных волокон; 3) слоя клеток ганглия; 4) внутреннего сетчатого слоя; 5) внутреннего нуклеарного слоя; 6) внешнего сетчатого слоя; 7) внешнего нуклеарного слоя; 8) внешней ограничивающей мембраны и 9) слоя палочек и колбочек.

"Трансформирующий фактор роста " (TGF ) представляет собой белок массой 55 кДа, из 391 аминокислот, который включает сигнальную последовательность из 23 аминокислот, проучасток из 256 аминокислот и зрелый сегмент из 112 аминокислот. Перед секрецией проучасток отщепляется по сайту RxxR фуриноподобной протеазой. Так образуется негликозилированный связанный дисульфидными мостиками зрелый димер массой 25 кДа, который нековалентно связывается с ранее присоединенными к нему дисульфидными мостиками проучастками с образованием "латентного комплекса". Этот комплекс секретируется. Активация осуществляется внеклеточно в различных условиях, наиболее часто посредством трансмембранной серин/треонинкиназы, с инициированием внутриклеточного сигнального каскада, в котором посредником выступает семейство Smad факторов транскрипции.

"Основной фактор роста фибробластов" (bFGF), известный также как FGF-2, представляет собой негликозилированный полипептид массой 18 кДа, который проявляет как внутриклеточную, так и внеклеточную активность. bFGF секретируется в виде мономера. После секреции bFGF секвестируется либо на сульфате гепарина (HS) на клеточной поверхности, либо на гликозаминогликанах матрикса. Хотя bFGF секретируется как мономер, сульфат гепарина на клеточной поверхности, видимо, димеризует мономерный bFGF по типу нековалентной конфигурации сторона-к-стороне, которая способна легко димеризовать и активировать рецепторы к FGF.

"Фактор роста тромбоцитов" (PDGF) представляет собой гомо- или гетеродимерную комбинацию массой 30 кДа двух генетически разных, но структурно близких полипептидных цепочек, обозначенных как A и B. Он был впервые идентифицирован в сыворотке как фибробластный митоген, полученный из тромбоцитов. Последующие исследования показали, что многие типы клеток секретируют PDGF и что этот цитокин является митогеном для клеток мезодермальной линии (мышечная, костная, соединительная ткань).

"Фактор роста сосудистого эндотелия" (VEGF) был впервые идентифицирован как фактор роста и фактор выживаемости клеток эндотелия. Он индуцирует пролиферацию клеток и регулирует развитие кровеносных сосудов и образование сосудов. VEGF представляет собой гепаринсвязывающий гликопротеин, который секретируется в виде гомодимера массой 45 кДа. VEGF могут секретировать многие типы клеток, но не сами эндотелиальные клетки.

"Фактор роста гепатоцитов" (HGF), известный также, как фактор рассеяния, представляет собой мультифункциональный цитокин, который стимулирует митогенез, миграцию, инвазию и морфогенез. Зависимая от HGF передача сигнала модулирует функцию интегрина путем стимулирования агрегации и слипания клеток. Влияние HGF/SF осуществляется посредством передачи сигнала MET рецептора к тиразинкиназе с последующим связыванием лигандов.

"Фактор роста кератиноцитов" (KGF), или KGF-7, представляет собой одноцепочечный гликопротеин массой 28 кДа, относительно нацеленный только на эпителий. Молекула синтезируется как предшественник, состоящий из 194 аминокислот, который содержит сигнальную последовательность, состоящую из 31 аминокислоты, и зрелый сегмент, составленный из 163 аминокислот. Зрелый фактор роста связывает гепарин и его рецептор (KGFR) посредством дискретных участков молекулы. Взрослые клетки, которые экспрессируют KGF-7, включают фибробласты, Т-клетки, клетки гладких мышц и клетки яичковой оболочки. В эмбриогенезе KGF обнаруживается на многих стадиях развития по всей мезенхиме.

"Инсулиноподобные факторы роста" (IGF), IGF-I и IGF-II, на 50% структурно гомологичны инсулину. Они действуют как митогенные стимуляторы пролиферации клеток, а также как супрессоры апоптотических путей метаболизма клеток. Первичным местом продуцирования IGF под контролем гормона роста (GH) является печень. Уровни IGF-I определяются также стадиями питания и развития. Продукция инсулиноподобных факторов роста аутокринными и паракринными тканями вносит вклад в уровни IGF, доступные для регулирования роста.

"Эволюционный фенотип" обозначает способность клетки приобретать определенный физический фенотип посредством процесса дифференцировки.

"Гормон" представляет собой любое вещество, которое секретируется клеткой и вызывает при контактировании с ним фенотипическое изменение в той же самой или в другой клетке.

"Генотип" обозначает экспрессию по крайней мере одного транскрипта мРНК гена, связанного с направлением дифференцировки.

Термин "трансгенный" используется для обозначения животного или его части, включая, однако этим не ограничивается, клетки, культуры или ткани, которое содержит в своих клетках экзогенный генетический материал. Клетки по настоящему изобретению могут содержать добавленную к ним ДНК, и указанные клетки могут быть затем использованы для трансплантации или для in vitro продуцирования гормонов, клеток или тканей.

"Трансген" обозначает любую часть ДНК, искусственно встроенную в клетку, которая становится частью генома клетки, клеточной линии, ткани или организма (т.е. либо стабильно интегрируется, либо существует в виде устойчивого внехромосомного элемента), который развивается из клетки. Подобный трансген может включать ген, который является частично или полностью гетерологичным или чужеродным по отношению к клетке или организму, в который введен гетерологичный ген, или же может представлять собой ген, который является гомологичным по отношению к эндогенному гену организма. В это определение входит трансген, полученный путем использования последовательности РНК, которая транскрибируется в ДНК, а затем включается в геном. Термин "трансгенный" дополнительно включает любой организм или его часть, в том числе, однако ими не ограничивается, клетки, клеточные линии, клеточные культуры или ткани, ген которых был изменен путем проведения in vitro операций или с помощью методов трансгенной технологии.

II. Полученные из жировой ткани стволовые клетки или стромальные клетки

Стволовая клетка, полученная из жировой ткани, или "стромальная клетка, полученная из жировой ткани", обозначают клетки, которые происходят из жировой ткани. Под "жировой" понимают любую жировую ткань. Жировая ткань может быть коричневой или белой жировой тканью, полученной из-под кожи, из сальниковой/висцеральной железы, из молочной железы, из половой железы или другого места расположения жировой ткани. Жировая ткань предпочтительно является белой подкожно-жировой клетчаткой. Подобные клетки могут входить в состав культуры первичной клетки или же иммортализованной клеточной линии. Жировая ткань может быть взята от любого организма, имеющего жировую ткань. Предпочтительно жировую ткань берут от млекопитающего, наиболее предпочтительно берут жировую ткань человека. Удобным источником жировой ткани является хирургическая липосакция, однако источник жировой ткани или способ выделения жировой ткани не является критическим для настоящего изобретения.

Стромальные клетки, полученные из экстрамодулярной жировой ткани взрослого человека, представляют собой источник стромальных клеток, которые можно выращивать рутинными способами с минимальным риском или дискомфортом для пациента. Данные патологии свидетельствуют, что стромальные клетки, полученные из жировой ткани, способны дифференцироваться по многим метаболическим направлениям. Жировые ткани легкодоступны и имеются в изобилии у многих индивидуумов. Ожирение представляет собой состояние, которое приняло масштабы эпидемии в США, где у 50% взрослых людей превышена рекомендованная величина индекса массы тела, рассчитанная на основе их величины роста.

Широко описано, что адипоциты являются восполняемой клеточной популяцией. Даже после хирургического удаления липосакцией или после других процедур с течением времени у пациента обычно наблюдается восстановление адипоцитов. Из этого следует, что жировая ткань содержит стволовые стромальные клетки, которые способны к самообновлению.

Жировая ткань предоставляет многие практические преимущества для применения в тканевой инженерии. Во-первых, она имеется в изобилии. Во-вторых, она доступна для методов выращивания с минимальным риском для пациента. В-третьих, она способна восстанавливаться. В то время как стромальные клетки представляют менее 0,01% популяции ядросодержащих клеток костного мозга, на один грамм жировой ткани приходится 8,6×10 ⁴ стромальных клеток (Sen et al., 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81: 312-319). Ex vivo размножение в течение от 2 до 4 недель позволяет получить до 500 миллионов стромальных клеток из 0,5 кг жировой ткани. Эти клетки можно использовать немедленно или сохранить при криогенном охлаждении для последующих аутогенных или аллогенных применений.

Стромальные клетки, полученные из жировой ткани, экспрессируют также ряд адгезивных белков и поверхностных белков. Они включают маркеры клеточной поверхности, такие как CD9; CD29 (интегрин бета 1); CD44 (гиалуронатный рецептор); SD49d,e (интегрин альфа 4, 5); CD54 (ICAM1); CD55 (фактор распада); CD105 (эндоглин); CD106 (VCAM-1); CD166 (ALCAM) и HLA-ABC (антиген гистосовместимости класса I); и цитокины, такие как интерлейкины 6, 7, 8, 11; колониестимулирующий фактор макрофагов; колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов; гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; фактор ингибирования лейкоза; фактор стволовых клеток и костный морфогенетический белок. Многие из указанных белков потенциально способны выполнять поддерживающую функцию при кроветворении, и все они объединены тем, что характерны для стромальных клеток костного мозга.

Из уровня техники известны способы выделения, размножения и дифференцировки клеток, полученных из жировой ткани человека. См., например, Burris et al., 1999, Mol. Endocrinol 13: 410-7; Erickson et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002 Jan 18; 290(2): 763-9; Gronthos et al., 2001, Journal of Cellular Physiology, 189: 54-63; Halvorsen et al., 2001, Metabolism 50: 407-413; Halvorsen et al., 2001, Tissue Eng. 7(6): 729-41; Harp et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 281: 907-912; Saladin et al., 1999, Cell Growth & Diff 10: 43-48; Sen et al., 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81: 312-319; Zhou et al., 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517. Стромальные клетки, полученные из жировой ткани, получают из измельченной жировой ткани расщеплением с помощью коллагеназы и дифференциальным центрифугированием [Halvorsen et al., 2001, Metabolism 50: 407-413; Hauner et al., 1989, J. Clin. Invest 84: 1663-1670; Rodbell et al., 1966, J. Biol. Chem. 241: 130-139]. Другими показано, что стромальные клетки, полученные из жировой ткани человека, могут дифференцироваться в адипоцитном, хондроцитном и остеобластном направлении дифференциации. [Erickson et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002 Jan 18; 290(2): 763-9; Gronthos et al., 2001, Journal of Cellular Physiology, 189: 54-63; Halvorsen et al., 2001, Metabolism 50: 407-413; Halvorsen et al., 2001, Tissue Eng. 2001 Dec; 7(6): 729-41; Harp et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 281: 907-912; Saladin et al., 1999, Cell Growth & Diff 10: 43-48; Sen et al., 2001, Journal of Cellular Biochemistry 81: 312-319; Zhou et al., 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517; Zuk et al., 2001, Tissue Eng. 7: 211-228].

Взрослые стромальные клетки, полученные из жировой ткани человека, представляют собой источник взрослых стволовых клеток, которые можно собирать рутинными способами с минимальным риском и дискомфортом для пациента. Они могут быть размножены ex vivo, подвергнуты дифференцировке по уникальному направлению дифференциации, сформированы методами генной инженерии и вновь введены индивидуумам в качестве аутогенного или аллогенного трансплантанта.

В международной заявке WO 00/53795, поданной The University of Pittsburgh и The Regents of the University of California, и заявке на патент США № 2002/0076400, поданной The University of Pittsburgh, описываются полученные из жировой ткани стволовые клетки и решетки, по существу не содержащие адипоцитов и эритроцитов, и клональные популяции стволовых клеток соединительной ткани. Клетки могут быть использованы самостоятельно или вместе с биологически совместимыми композициями для генерирования дифференцированных тканей или структур, как in vivo, так и in vitro . Кроме того, клетки можно размножить и культивировать для продуцирования гормонов и для получения кондиционированных сред для культур, поддерживающих рост и размножение других клеточных популяций. В качестве еще одного аспекта эти публикации приводят полученную из жировой ткани решетку, по существу без клеток, которая включает материал внеклеточного матрикса жировой ткани. Решетка может быть использована в качестве субстрата для облегчения роста и дифференцировки клеток, как in vivo, так и in vitro , в зачатки или зрелые ткани или структуры. Ни в одной публикации не приводятся полученные из жировой ткани стромальные клетки, в которых индуцируют экспрессию по крайней мере одного фенотипического или генотипического признака внутриглазной стромальной клетки.

В патенте США № 6391297, выданном компании Artecel Science, приводится композиция выделенных стромальных клеток, полученных из жировой ткани человека, которые подвергают дифференцировке с тем, чтобы они проявляли по крайней мере один признак остеобласта, и которые могут быть использованы для in vivo заживления кости и для лечения болезней костей. Эту остеобластподобную клетку, полученную из жировой ткани, можно по выбору генетически модифицировать или объединить с матриксом.

В патенте США № 6426222, выданном компании BioHoldings International, приводятся способы индуцирования дифференцировки остеобластов из экстрамодулярной жировой ткани человека путем инкубации клеток жировой ткани в жидкой питательной среде, которая должна содержать глюкокортикоид.

В международной заявке WO 00/44882 и патенте США № 6153432, выданном авторам Halvorsen et al., приводятся способы и композиции для дифференцировки преадипоцитов человека, полученных из жировой ткани, в адипоциты, обладающие биохимическими, генетическими и физиологическими признаками, аналогичными тем, которые наблюдаются у выделенных первичных адипоцитов.

В международной заявке WO 01/62901 и опубликованной заявке на патент США № 2001/0033834, поданной компанией Artecel Science, представлены выделенные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, у которых индуцируют экспрессию по крайней мере одного фенотипического признака нейрональной, астроглиальной, печеночной клетки или кроветворной клетки-предшественника. Представлены также выделенные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, которые подвергают дедифференцировке таким образом, чтобы у них отсутствовал фенотипический маркер адипоцитов.

В патенте США № 6429013, выданном компании Artecel Science, приводятся композиции на основе выделенной стромальной клетки, полученной из жировой ткани, у которой индуцируют экспрессию по крайней мере одного признака хрящевой клетки. Приводятся также способы дифференцировки указанных клеток.

В патенте США № 6200606, выданном авторам Peterson et al., указывается, что клетки-предшественники, обладающие потенциальной способностью генерировать кость или хрящ, могут быть выделены из различных кроветворных и некроветворных тканей, включая периферическую кровь, костный мозг и жировую ткань.

Полученные из жировой ткани стромальные клетки, применимые в способах по настоящему изобретению, выделяют с помощью различных способов, известных специалистам в данной области техники, таких как приведенные в международной заявке WO 00/53795, выданной The University of Pittsburgh. В предпочтительном способе осуществления изобретения жировую ткань берут от млекопитающего, предпочтительно человека. Предпочтительным источником жировой ткани является сальниковая железа. У человека жировую ткань предпочтительно выделяют липосакцией. Если клетки по настоящему изобретению предполагается трансплантировать человеку, то жировую ткань предпочтительно берут у того же самого субъекта с тем, чтобы можно было получить аутогенный трансплантат. В качестве альтернативы трансплантированные клетки могут быть аллогенными.

В качестве не ограничивающего настоящее изобретение примера в одном из способов выделения стромальных клеток, полученных из жировой ткани, жировую ткань обрабатывают коллагеназой с концентрацией в диапазоне от 0,01 до 0,5%, предпочтительно от 0,04 до 0,2%, наиболее предпочтительно 0,1%, трипсином с концентрацией в диапазоне от 0,01% до 0,5%, предпочтительно от 0,04 до 0,4%, наиболее предпочтительно 0,2%, при температуре в диапазоне от 25°С до 50°С, предпочтительно в диапазоне от 33°С до 40°С, наиболее предпочтительно при температуре 37°С, в течение времени в диапазоне от 10 минут до 3 часов, предпочтительно в диапазоне от 30 минут до 1 часа, наиболее предпочтительно в течение 45 минут. Клетки пропускают через сетчатый фильтр из нейлона или марли с размером пор в диапазоне от 20 до 800 микрон, более предпочтительно в диапазоне от 40 до 400 микрон, наиболее предпочтительно 70 микрон. Клетки подвергают дифференциальному центрифугированию непосредственно в среде или над фиколлом или перколлом или в другом заданном градиенте. Клетки можно центрифугировать с ускорением в диапазоне от 100 до 3000хg, более предпочтительно от 200 до 1500×g, наиболее предпочтительно при 500×g, в течение времени в диапазоне от 1 минуты до 1 часа, более предпочтительно от 2 до 15 минут, наиболее предпочтительно в течение 5 минут, при температуре в диапазоне от 4°С до 50°С, более предпочтительно в диапазоне от 20°С до 40°С, наиболее предпочтительно при 25°С.

В еще одном способе выделения стромальных клеток, полученных из жировой ткани, используют механическую систему, приведенную в патенте США № 5786207, выданном авторам Katz et al. Система используется для введения образца жировой ткани в автоматическое устройство и его обработки промывочной фазой и диссоциирующей фазой, в котором клетки перемешивают и вращают таким образом, что полученная суспензия клеток собирается в емкости, готовой к центрифугированию. Указанным образом, выделенные из жировой ткани клетки отделяют от образца ткани, сохраняя клеточную целостность требуемых клеток.

III. Стимулирование полученных из жировой ткани стромальных клеток с целью проявления ими по крайней мере одного признака глазной клетки

Настоящее изобретение включает обработку стромальных клеток, полученных из жировой ткани, с целью индуцировать образование клетки, которая экспрессирует по крайней мере один генотипический или фенотипический признак глазной клетки. Не ограничивающие настоящее изобретение примеры того, как индуцировать дифференцировку стромальных клеток, полученных из жировой ткани, включают: 1) использование клеточных сред; 2) использование поддерживающих клеток; 3) прямую имплантацию недифференцированных клеток в ткань пациента; 4) методы клеточной инженерии.

А) Стимулирование клеточными средами

Хотя настоящее изобретение не опирается на какую-либо практическую теорию, авторы полагают, что обработка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, средой, содержащей комбинацию сыворотки, эмбриональных экстрактов, амниотических тканей/жидкостей, очищенных или рекомбинантных факторов роста, цитокинов, гормонов и/или химических агентов, в двумерной или трехмерной микросреде, способна индуцировать дифференцировку.

Более конкретно, в изобретении предлагается способ дифференцировки полученной из жировой ткани клетки в клетку, имеющую генотипические или фенотипические свойства глазной клетки, который включает: посев выделенных взрослых стромальных клеток, полученных из жировой ткани, с требуемой плотностью, включая, но этим не ограничиваясь, плотность приблизительно от 1000 до приблизительно 500000 клеток/см ², инкубацию клеток в химически заданной среде для культивирования, которая содержит по крайней мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из фактора роста, гормона, цитокина, сывороточного фактора, рецепторного лиганда нуклеарного гормона или любого другого заданного химического агента.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения дифференцированные клетки по настоящему изобретению выращивают в культурах до тех пор, пока не появятся признаки формирования эпителия роговицы. Среды, содержащие эпителий, затем анализируют стандартными биохимическими аналитическими методами, известными специалистам в данной области техники, на присутствие маркеров, которые указывают на наличие функции эпителия роговицы. Слои эпителия роговицы затем имплантируют в ткань пациента с целью генерации или регенерации тканей.

Основные среды, применимые в способах по настоящему изобретению, включают, однако ими не ограничиваются, Neurobasal (дополнительно содержащую или не содержащую сыворотку плода коровы или основной фактор роста фибробластов (bFGF)), N2, B27, минимальную поддерживающую среду Игла, ADC-1, LPM (без бычьего сывороточного альбумина), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, среду BGJ (с или без модификации Фиттон-Джексона), основную среду Игла (с добавлением солевого основания Игла), модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM - без сыворотки), Yamane, IMEM-20, модифицированную по способу Глазго среду Игла (GMEM), среду Лейбовица L-15, среду Маккоя 5A, среду M199 (M199E - с солевым основанием Игла), среду M199 (M199H - с солевым основанием Хэнкса), минимальную поддерживающую среду Игла (MEM-E - с солевым основанием Игла), минимальную поддерживающую среду Игла (MEM-H - с солевым основанием Хэнкса) и минимальную поддерживающую среду Игла (MEM-NAA - с замененными аминокислотами), и среди прочих включают среду 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Предпочтительной средой для использования по настоящему изобретению является DMEM. Эти и другие применимые среды могут быть получены среди прочих от компании GIBCO (Grand Island, N.Y., США) и Biological Industries (Beth Aemek, Израиль). Ряд этих сред собран в монографии Enzymology, Vol. LVIII, "Cell Culture", pp. 62-72, под редакцией William B. Jakoby and Ira H. Pastan, опубликованной Academic Press, Inc.

Предпочтительные среды для культивирования эпителиальных клеток роговицы известны из области техники и включают среды, приведенные в патенте США № 5912175, выданном автору Wille, Jr. В общем случае среды, применимые в способах по настоящему изобретению, должны содержать сыворотку плода коровы или сыворотку другого видового происхождения с концентрацией по крайней мере от 1% до приблизительно 30%, предпочтительно приблизительно от 5% до 15%, наиболее предпочтительно около 10%. Эмбриональные экстракты цыплят или из другого видового происхождения присутствуют в концентрации приблизительно от 1% до 30%, предпочтительно приблизительно от 5% до 15%, наиболее предпочтительно около 10%.

Факторы роста, цитокины, гормоны и другие специфические факторы, применимые по настоящему изобретению, включают, однако ими не ограничиваются, гормон роста, эритропоэтин, тромбопоэтин, интерлейкин 3, интерлейкин 6, интерлейкин 7, колониестимулирующий фактор макрофагов, лиганд c-kit/фактор стволовых клеток, лиганд остеопротегерина, инсулин, инсулиноподобные факторы роста, эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор роста нервной ткани, цилиарный нейротрофный фактор, фактор роста тромбоцитов и костный морфогенный белок, в концентрациях от пикограмм на мл до миллиграмм на мл. Например, по данным анализов на колониеобразующие единицы (CFU) при указанных концентрациях факторы роста, цитокины и гормоны, применимые в способах по настоящему изобретению, способны индуцировать до 100% образование клеток крови (лимфоидного, эритроидного, миелоидного или тромбоцитарного направления дифференцировки) (Moore et al. (1973) J. Natl. Cancer Inst. 50: 603-623; Lee et al. (1989) J. Immunol. 142: 3875-3883; Medina et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 1507-1515).

Следует также понимать, что в среду для культивирования могут быть добавлены другие компоненты. Подобные компоненты включают антибиотики, альбумин, аминокислоты и другие компоненты, известные из области техники для культивирования клеток. Кроме того, могут быть добавлены компоненты для ускорения процесса дифференцировки. Под "химическими агентами" понимают стероиды, ретиноиды и другие химические соединения или агенты, которые индуцируют дифференцировку стромальных клеток, полученных из жировой ткани, по крайней мере на 25-50% по отношению к положительному контролю.

Следует понимать, что условия сред для культивирования, которые приведены выше, позволяют получать клетку, которая экспрессирует по крайней мере один генотипический или фенотипический признак одного из типов глазных клеток. Конкретные типы клеток разделяют любыми способами, известными специалистам в данной области техники. Наиболее применимыми являются средства, которые основаны на использовании генотипических или фенотипических признаков, экспрессируемых дифференцированными клетками. Фенотипические маркеры требуемых клеток, которые приведены ниже, хорошо известны специалистам в данной области техники и широко описаны в литературе. Продолжают открываться дополнительные фенотипические маркеры, или же они могут быть идентифицированы без проведения излишних экспериментов. Любые из указанных маркеров используются для подтверждения того, что у взрослых стволовых клеток, полученных из жировой ткани, индуцировано дифференцированное состояние.

Специфичные для направления дифференцировки фенотипические признаки включают, однако ими не ограничиваются, поверхностно-клеточные белки, цитоскелетные белки, клеточную морфологию и/или продукты секреции. Например, дифференцированные эпителиальные клетки роговицы синтезируют рецепторы к трансформирующим факторам роста 1 и 2 (TGF ), к инсулиноподобному фактору роста (IGF), к основному фактору роста фибробластов (bFGF), к фактору роста гепатоцитов (HGF) и к фактору роста кератиноцитов (KGF) (Kruse & Volcker, 1997, Curr. Opin. Ophthalmol. 8(4): 46-54). Для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что с помощью известных калориметрических, флуоресцентных, иммунохимических методов, полимеразной цепной реакции, химических или радиохимических методов можно легко установить присутствие или отсутствие специфического маркера направления дифференцировки.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается выделенная дедифференцированная взрослая стволовая клетка, полученная из жировой ткани, в которой может быть индуцирована экспрессия по крайней мере одного генотипического или фенотипического признака глазной клетки в среде для культивирования, способной осуществить подобную дифференцировку. Дедефференцированную зрелую стволовую клетку, полученную из жировой ткани, идентифицируют по отсутствию маркеров зрелой жировой клетки.

B) Использование поддерживающих клеток для стимулирования дифференцировки стромальных клеток, полученных из жировой ткани

В другом варианте осуществления настоящего изобретения для стимулирования дифференцировки стромальных клеток, полученных из жировой ткани, используют поддерживающие клетки. Так, полученные из жировой ткани клетки по настоящему изобретению выделяют и культивируют в популяции клеток, при этом наиболее предпочтительно популяция клеток является заданной популяцией клеток. Популяция клеток является гетерогенной и включает поддерживающие клетки для снабжения факторами клеток по настоящему изобретению. Поддерживающие клетки включают другие типы клеток, которые будут стимулировать дифференцировку, рост и поддержание требуемых клеток. В качестве не ограничивающего настоящее изобретение примера, в том случае, если необходимы стромальные клетки, полученные из жировой ткани, которые экспрессируют по крайней мере один генотипический или фенотипический признак эпителиальной клетки роговицы, стромальные клетки, полученные из жировой ткани, вначале выделяют с помощью одного из ранее описанных способов и выращивают в культуре в присутствии других глазных или неглазных поддерживающих клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают из первичной культуры указанных клеточных типов, взятых из культивированной глазной ткани. Наконец, в еще одном способе осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают из линии иммортализованных клеток. В некоторых способах осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают аутогенно. В других способах осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают аллогенно.

В настоящем изобретении предполагается также, что клетки, используемые для поддержки дифференцировки требуемой клетки, могут быть превращены в поддерживающие клетки методами генной инженерии. С помощью любых методов, которые описываются далее, а также хорошо известны специалистам в данной области техники, клетки генетически модифицируются для экспрессии экзогенных генов или для подавления экспрессии эндогенных генов. Один из способов генетической модификации клеток по настоящему изобретению включает воздействие на клетку фрагментом "голой" нуклеиновой кислоты (т.е. ДНК или РНК) таким образом, чтобы нуклеиновая кислота встроилась в геном клетки с тем, чтобы нуклеиновая кислота экспрессировалась в клетке. В качестве альтернативы клетки по настоящему изобретению подвергают воздействию вектора переноса гена, включающего нуклеиновую кислоту, которая содержит трансген, таким образом, что нуклеиновая кислота вводится в клетку в условиях, подходящих для экспрессии трансгена в клетке.

C) Имплантация

В соответствии с другим аспектом в настоящем изобретении предлагаются стромальные клетки, полученные из жировой ткани, и дифференцированные клетки, экспрессирующие по крайней мере один генотипический или фенотипический признак глазной клетки, которые применимы при аутогенных и аллогенных трансплантациях. Предпочтительно субъектом является млекопитающее, более предпочтительно субъектом является человек.

Таким образом, в соответствии с еще одним аспектом в настоящем изобретении предлагается способ обеспечения субъекта дифференцированными клетками, способными экспрессировать по крайней мере один генотипический или фенотипический признак глазной клетки, который включает:

a) выделение стромальных клеток, полученных из жировой ткани;

b) высевание и инкубацию клеток в среде, подходящей для дифференцировки клеток;

c) введение дифференцированных клеток субъекту.

В соответствии с еще одним аспектом в настоящем изобретении предлагается способ обеспечения субъекта недифференцированными стромальными клетками, полученными из жировой ткани, который включает:

a) выделение стромальных клеток, полученных из жировой ткани;

b) введение недифференцированных клеток субъекту.

Предполагается, что когда в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения субъекту вводят недифференцированные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, то их вводят непосредственно в пораженный глаз. В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения недифференцированные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, вводят вместе с любыми поддерживающими клетками, или средами, или факторами дифференцировки, приведенными в настоящем изобретении, которые должны обеспечить среду, подходящую для in vivo дифференцировки стромальных клеток. Например, в одном из способов осуществления настоящего изобретения эти поддерживающие клетки являются амниотическими клетками. В другом способе осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают из первичных культур клеток указанных типов, которые взяты от культивированной глазной ткани. Наконец, в еще одном способе осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают от линии иммортализованных клеток. В некоторых способах осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают аутогенно. В других способах осуществления настоящего изобретения поддерживающие клетки получают аллогенно.

В еще одном способе осуществления настоящего изобретения дедифференцированные клетки, полученные из жировой ткани, вводят в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, пригодным для терапевтического применения, которое включает, однако этим не ограничивается, репарацию, регенерацию, реконструкцию или усиление ткани. Полученные из жировой ткани клетки можно культивировать по методу, приведенному в патенте США № 6153432 (который приводится здесь в качестве ссылки), чтобы подвергнуть их дедифференцировке так, чтобы у дедифференцированных взрослых стромальных клеток можно было затем индуцировать экспрессию генотипических или фенотипических признаков, отличных от генотипических или фенотипических признаков клеток, полученных из жировой ткани. Дедифференцированные клетки, полученные из жировой ткани, можно модифицировать таким образом, чтобы включить в них последовательность неэндогенного гена с целью продуцирования требуемого белка или пептида. В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения дедифференцированную клетку, полученную из жировой ткани, можно вводить хозяину в двумерной или трехмерной матрице с целью достижения желаемого терапевтического эффекта. В одном способе осуществления настоящего изобретения дедифференцированную клетку получают аутогенно из собственных клеток пациента. В качестве альтернативы дедифференцированную клетку получают аллогенно.

D) Генетические процедуры с клетками по изобретению, полученными из жировой ткани

Стволовые клетки или их потомство являются важными целями для генной терапии, при которой встроенные гены улучшают здоровье индивида, которому имплантированы стволовые клетки.

В еще одном способе осуществления настоящего изобретения клетки, полученные из жировой ткани, которые экспрессируют по крайней мере один генотипический или фенотипический признак глазной клетки, генетически модифицируют таким образом, чтобы они могли экспрессировать экзогенные гены или могли супрессировать экспрессию эндогенных генов. В настоящем изобретении предлагается способ генетического модифицирования указанных клеток и популяций клеток. Один из способов генетического модифицирования клеток по настоящему изобретению включает воздействие на клетки фрагментов "голой" нуклеиновой кислоты (т.е. ДНК или РНК), таким образом, что нуклеиновые кислоты встраиваются в геном клетки и что в клетке экспрессируются нуклеиновые кислоты.

В качестве альтернативы на клетки по настоящему изобретению действуют вектором переноса гена, включающим нуклеиновую кислоту, которая содержит трансген, так что нуклеиновая кислота вводится в клетку в условиях, подходящих для экспрессии трансгена в клетке. Трансген может представлять собой экспрессирующий кластер, включающий кодирующий полинуклеотид, функционально связанный с подходящим промотором. Кодирующий полинуклеотид может кодировать белок, или же он может кодировать биологически активную РНК (в частности, антисмысловую РНК или рибозим). Так, например, кодирующий полинуклеотид может кодировать ген, который придает резистентность к токсину, гормон, цитокин, прикрепленный к поверхности внутриклеточный сигнальный фрагмент (в частности, адгезивные молекулы клеток, рецепторы и т.п.), фактор, стимулирующий рост или секрецию эндогенного гормона, пептида или другого фактора или же любого другого клеточного продукта. Если для доставки данного трансгена требуется использовать технологию переноса гена, то его последовательность должна быть известной.

Внутри экспрессирующего кластера кодирующий полипептид функционально связан с подходящим промотором. Примеры подходящих промоторов включают прокариотические промоторы и вирусные промоторы (в частности, ретровирусные промоторы, промоторы вируса герпеса, промоторы цитомегаловируса). Другими подходящими промоторами являются эукариотические промоторы, такие как энхансеры, конститутивно-активные промоторы, сигналспецифические промоторы и тканеспецифические промоторы. Специалисты в данной области техники должны легко выбрать соответствующий промотор, подходящий для индуцирования экспрессии гена в заданном клеточном контексте. Экспрессирующий кластер, если необходимо, может включать более одного кодирующего полинуклеотида, а также он может содержать другие элементы (в частности, поли-А последовательности, элементы регулирования транскрипции и т.п.).

Содержащий трансген экспрессирующий кластер должен быть встроен в генетический вектор, подходящий для доставки трансгена в клетки. В зависимости от требуемого применения для генетического модифицирования клеток могут быть использованы любые такие векторы, например плазмиды, "голые" ДНК или вирусы. Для конструирования требуемого экспрессирующего кластера в векторе могут быть использованы любые методы. Эти методы хорошо известны из области техники и включают такие методы, как прямое клонирование, гомологическая рекомбинация и т.п. Для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что выбор вектора в значительной степени определяет метод, который используют для введения вектора в клетки.

Генетически измененные клетки можно разными способами затем ввести в организм в таких условиях, в которых трансген мог бы экспрессироваться in vivo . Так, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения трансген может кодировать факторы роста, такие как TGF . Клетки, содержащие трансген для TGF , можно затем ввести в глаз больного человека или млекопитающего.

В качестве альтернативы чужеродные экзогенные или гомологические нуклеиновые кислоты переносят в клетки по настоящему изобретению другими разными способами, известными специалистам в данной области техники. Так, нуклеиновые кислоты переносят такими способами, однако ими не ограничиваются, как электропорация, осаждение фосфатом кальция, микроинъекция, липофекция, перенос с помощью ретро- или другого вирусного или микробного вектора или любыми другими способами, известными специалистам в данной области техники.

E) Определение свойств клеток

Под "определением свойств" полученных дифференцированных клеток понимают идентификацию поверхностных и внутриклеточных белков, генов и/или других маркеров, которые указывают на коммитирование подвергнутых дифференцировке стромальных клеток определенному терминальному состоянию дифференцировки. Эти способы включают, однако ими не ограничиваются, (a) определение поверхностно-клеточных белков иммунофлуоресцентными методами с использованием белок-специфичных моноклональных антител, присоединенных с помощью вторичной флуоресцентной метки, в том числе с использованием методов проточной цитометрии; (b) определение внутриклеточных белков иммунофлуоресцентными методами с использованием белок-специфичных моноклональных антител, присоединенных с помощью вторичной флуоресцентной метки, в том числе с использованием методов проточной цитометрии; (c) определение генов клетки полимеразной цепной реакцией, in situ гибридизацией и/или анализом по методу нозерн-блоттинга. Определение свойств терминально дифференцированных клеток может быть проведено идентификацией поверхностных и внутриклеточных белков, генов и/или других маркеров, которые указывают на коммитирование стромальных клеток определенному терминальному состоянию дифференцировки. Эти методы, которые приведены выше, включают, однако ими не ограничиваются, (a) определение поверхностно-клеточных белков с помощью иммунофлуоресцентных анализов, таких как проточная цитометрия или in situ иммунное окрашивание белков на поверхности стромальных клеток, полученных из жировой ткани, таких как алкалинфосфатаза, CD44, CD146, интегрин бета 1 или остеопонтин (Gronthos et al., 1994 Blood 84: 4164-4173); (b) определение внутриклеточных белков с помощью иммунофлуоресцентных методов, таких как проточная цитометрия или in situ иммунное окрашивание стромальных клеток, полученных из жировой ткани, с использованием специфических моноклональных антител; (c) определение экспрессии селективных к линии дифференцирования молекул мРНК, таких, которые продуцируются эпителиальными клетками роговицы, включая TGF 1 или TGF 2, IGF, bFGF и фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), такими способами, как полимеразная цепная реакция, in situ гибридизация и/или другой блоттинг-анализ (см. Gimble et al., 1989 Blood 74: 303-311).

F) Использование клеток по настоящему изобретению в качестве терапевтических средств

Наиболее предпочтительно клетки и популяции по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве терапевтических средств. В одном из способов осуществления настоящего изобретения стромальные клетки, полученные из жировой ткани, вводят в глаз, предпочтительно в требуемый участок, и позволяют им дифференцироваться либо (i) за счет совместного введения подходящего цитокина и другого биологического фактора, либо (ii) за счет in vivo факторов, уже имеющихся или индуцированных у хозяина. В общем случае подобные методы включают перенос клеток в требуемую ткань или в депо либо in vitro в качестве трансплантата перед трансплантацией или приживлением, либо in vivo непосредственно животному. Клетки переносят в требуемую ткань любым подходящим способом, который обычно меняется в зависимости от типа ткани. Например, клетки можно переносить на трансплантат методом окунания в ванну или его инфузией средой для культивирования, содержащей клетки. Иначе клетки можно высевать в требуемом месте внутри ткани для создания популяции. Клетки могут быть перенесены в нужные места in vivo с использованием средств, хорошо известных специалистам в данной области техники, например с помощью катетеров, троакаров, канюлей или стентов, на которые высеяны клетки, и т.п.

Дифференцированные или недифференцированные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, по настоящему изобретению находят применение для терапии многих заболеваний. Клетки используют для лечения заболеваний глаза, которые включают, однако ими не ограничиваются: аниридию, или отсутствие радужной оболочки; эритрокератодермию, или покраснение и гиперкератоз кожи; кератит с многочисленными эндокринными недостаточностями; химические поражения, термические поражения; кератопатию, вызванную ношением контактных линз; и повторные операции на лимбе или недостаточность лимбической системы. Кроме того, клетки по настоящему изобретению используют для регенерации роговицы после проведения таких хирургических операций, как фоторефракционная кератэктомия или лазерный in situ кератомилез, обе из которых включают удаление части роговицы. Восстановление после этих операций часто приводит к возникновению послеоперационного переднего "стромального помутнения", характеризующегося в животных моделях появлением миофибробластов, экспрессирующих альфа-астин гладкой мышцы, которое предотвращается использованием клеток и методик по настоящему изобретению. Болезненное состояние, лечение которого проводится, может быть результатом аутоиммунной дисфункции или инфекции вируса или какого-либо другого инфекционного агента.

IV. Тканевая инженерия

Клетки, рассматриваемые в настоящем описании, могут быть использованы для тканевой инженерии. В изобретении предлагаются способы продуцирования животного вещества, которые включают поддержание клеток по настоящему изобретению в условиях, достаточных для их размножения и дифференцировки в требуемое вещество. Вещество может включать, например, часть глаза. В этом качестве клетки, приведенные в настоящем описании, полезны в сочетании с любыми известными методами тканевой инженерии, включая, однако этими примерами не ограничиваются, технологии, предлагаемые в следующих публикациях: U.S. Patent Nos. 5,902,741 and 5,863,531 to Advanced Tissue Sciences, Inc.; U.S. Patent No. 6,139,574, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,759,830, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,741,685, Vacanti; U.S. Patent No. 5,736,372, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,804,178, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,770, 417, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,770,193, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,709,854, Griffith-Cima et al.; U.S. Patent No. 5,516,532, Atala et al.; U.S. Patent No. 5,855,610, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,041,138, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 6,027,744, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 6,123,727, Vacanti et al.; U.S. Patent No. 5,536,656, Kemp et al.; U.S. Patent No. 5,144,016, Skjak-Braek et al.; U.S. Patent No. 5,944,754, Vacanti; U.S. Patent No. 5,723,331, Tubo et al.; and U.S. Patent No. 6,143,501, Sittinger et al.

Для получения подобных структур клетки и популяции поддерживают в условиях, подходящих для их размножения и деления с образованием органа. Это может быть осуществлено путем переноса клеток или популяций клеток животному, обычно в то место, в котором необходимо новое вещество. Так, использование настоящего изобретения может ускорить регенерацию части глаза животного в том месте тканей, куда имплантированы клетки.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетки заставляют дифференцировать и размножаться с образованием ткани in vitro. В этом качестве клетки могут быть введены самостоятельно или в смеси клеток или в качестве альтернативы могут быть культивированы на субстратах, которые облегчают формирование трехмерной структуры, способствующей развитию тканей. Так, например, клетки можно культивировать или высевать на биосовместимую решетку, например такую решетку, которая включает материал внеклеточного матрикса, синтетические полимеры, цитокины, факторы роста и т.п. Такой решетке можно придать желаемые формы с целью облегчения развития типов тканей.

Таким образом, в настоящем изобретении предлагается композиция, включающая клетки и популяции клеток по настоящему изобретению и биологически совместимую решетку. Решетку можно изготовить из полимерного материала, содержащего волокна в виде сетки или губки, при этом расстояния между волокнами обычно составляют порядка от 100 мкм до приблизительно 300 мкм. Такая структура обладает достаточной поверхностью, на которой могут расти и пролиферировать клетки. Желательно, чтобы решетка была биоразлагаемой с течением времени с тем, чтобы она поглотилась животным веществом по мере его развития. Применимые решетки из полимеров или сополимеров могут быть получены из таких мономеров, как гликолевая кислота, молочная кислота, пропилфумарат, капролактон и т.п. Другие решетки могут включать белки, полисахариды, полиоксикислоты, полиортоэфиры, полиангидриды, полифосфоцены или синтетические полимеры, в частности биоразлагаемые полимеры, или любые их сочетания. Решетка может, если необходимо, включать также гормоны, такие как факторы роста, цитокины, морфогены (например, ретиновую кислоту и т.п.), требуемые материалы внеклеточного матрикса (например, фибронектин, ламинин, коллаген и т.д.) или другие материалы (например, ДНК, вирусы, клетки других типов и т.д.).

Для получения композиции клетки вводят в решетку таким образом, чтобы они проникали в ее интерстициальное пространство. Например, матрицу можно опустить на некоторое время в раствор или суспензию, содержащую клетки, или же клетки можно ввести в матрицу путем инфузии или инъекции. Предпочтительно используют гидрогель, который получают путем сшивки суспензии, содержащей полимер, а также диспергированные в ней клетки по настоящему изобретению. Такой способ получения позволяет диспергировать клетки по всей решетке и тем самым обеспечивает более равномерное проникновение клеток в решетку. Композиция, конечно, может включать зрелые клетки требуемого фенотипа или их предшественники, в частности, с тем, чтобы обеспечить возможность активирования внутри решетки клеток по настоящему изобретению или способствовать продуцированию гормонов внутри решетки.

Для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что решетки, подходящие для включения в композицию, могут быть получены из любого подходящего источника, например матригеля, и могут, конечно, включать коммерческие источники подходящих решеток. Другую подходящую решетку получают из неклеточной части жировой ткани, например жировой ткани внеклеточного матрикса, по существу без клеток. Обычно подобная решетка, полученная из жировой ткани, включает белки, такие как протеогликаны, гликопротеины, гиалуронин, фибронектины, коллагены и т.п., которые все служат превосходными субстратами для роста клеток. Кроме того, подобная решетка, полученная из жировой ткани, может включать гормоны, цитокин, фактор роста и т.п. Специалистам в данной области техники известны способы выделения подобной решетки, полученной из жировой ткани, например, описанные в международной заявке WO 00/53795, подданной The University of Pittsburgh, которая приводится здесь в качестве ссылки.

Клетки, популяции, решетки и композиции по настоящему изобретению используют в тканевой инженерии и для регенерации тканей. Таким образом, в настоящем изобретении рассматриваются пригодные к имплантации структуры, обладающие любыми из рассмотренных в настоящем изобретении особенностей. Конкретный тип имплантанта будет изменяться в зависимости от назначения. Имплантант может включать зрелую ткань или может включать незрелую ткань или решетку. Так, например, имплантант может содержать популяцию клеток по настоящему изобретению, которые претерпевают дифференцировку и которые необязательно высеяны внутри решетки подходящего размера и формы. Подобный имплантант вводят с помощью инъекции или вживляют хозяину для стимулирования генерации или регенерации у пациента глазной ткани.

Полученную из жировой ткани решетку удобно использовать как часть набора клеточной культуры. Соответственно, в настоящем изобретении предлагается набор, включающий полученную из жировой ткани решетку по настоящему изобретению и один или более других компонентов, таких как гидратирующие агенты (например, воду, физиологически совместимые солевые растворы, приготовленные среды для культивирования клеток, сыворотку, или их сочетания, или их производные), субстраты для культивирования клеток (например, чашки, пробирки для планшетов и т.д.), среды для культивирования клеток (как в жидкой, так и в порошкообразной форме), антибиотики, гормоны и т.п. Хотя набор может включать любые из указанных ингредиентов, он предпочтительно содержит в правильной комбинации все ингредиенты, необходимые для культивирования и поддержания роста требуемых клеток. Требуемый набор может также включать клетки, которые высевают на решетку, как уже было описано ранее.

В качестве альтернативы, клетки по настоящему изобретению дифференцируют в клетки, обладающие по крайней мере одним признаком эпителиальной клетки роговицы, которые размножают in vitro, с целью получения эпителиальной ткани роговицы для последующей имплантации пациенту. Клетки имплантируют отдельно или в сочетании с другими тканями, такими как ткань амниотической мембраны.

Настоящее изобретение теперь будет рассмотрено более подробно с помощью следующих примеров. Настоящее изобретение однако может быть осуществлено во многих различных формах, и его не следует рассматривать как ограниченное приведенными в описании вариантами его осуществления. Эти варианты осуществления настоящего изобретения приведены для того, чтобы описание было доскональным и законченным и полностью раскрывало специалистам в данной области техники объем притязаний по настоящему изобретению.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Методы in vitro индуцирования

Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, выделяют из отходов липосакции по описанной методике (Sen et al., 2001, J. Cell Biochem. 81, 312-319). Эти клетки можно продолжить культивировать в присутствии следующих сред, однако ими не ограничиваются: Neurobasal (InVitrogen), дополнительно содержащая или не содержащая сыворотку плода коровы (FBS), N2, B27 (InVitrogen), и основной фактор роста фибробластов (bFGF). Проводят также модуляцию уровней глюкозы в средах. Клетки высевают с различной плотностью и подкармливают с интервалами в 3-6 дней. Более предпочтительно их высевают с плотностью приблизительно от 1000 до 500000 клеток/см ².

В течение периода культивирования кондиционированную среду анализируют с помощью коммерчески доступного радиоиммунного анализа или твердофазного иммуносорбентного анализа на биологические маркеры и экспрессию фенотипических маркеров, связанных со стромальными клетками глаза или эпителиальными клетками роговицы. Иммуногистохимические (IHC) анализы проводят с использованием антител (однако ими не ограничиваются) против любого из описанных выше фенотипических маркеров.

Пример 2

Использование клеток, полученных из жировой ткани, вместе с биосовместимой мембраной

Предлагаются подходы к использованию стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в их недифференцированном состоянии или в состоянии адипоцитного направления дифференцировки в композиции с биосовместимым материалом, с целью трансплантации для заживления внутриглазных повреждений. Оперируемым пациентам проводили фототерапевтическую кератэктомию с помощью эксимерного пучка с длиной волны 193 нм, генерируемого эксимерным лазером VISX Star S2 (VISX, Inc., Санта-Клара, Калифорния), с частотой импульсов 10 Гц и плотностью потока 160 мДж/см ², как описано Lee et al. (2001, Journal of Cellular Biochemistry 81: 312-319). Стандартную лазерную фотоабляцию с диаметром пятна 6 мм осуществляли по центру на глубину 45 мкм с обычной обработкой операционного поля в эпителии и с использованием подходящих приспособлений для абляции стромы. После проведения фоторефракционной кератэктомии в абляцированную область вводили либо недифференцированные взрослые стромальные клетки, либо дифференцированные в адипоциты взрослые стромальные клетки, полученные из жировой ткани, вместе с биосовместимым материалом. Перед введением полученные из жировой ткани клетки культивировали непосредственно на поверхности биосовместимой мембраны, включая, однако этим не ограничиваются, амниотическую мембрану, взятую от свиньи подслизистую интестинальную основу, Ampligraft , Dermagraft или аналогичный продукт. Полученные из жировой ткани клетки культивировали либо как недифференцированные фибробластоподобные клетки, либо у них индуцировали дифференцировку в адипоцитном направлении, используя методику, приведенную Halvorsen et al. (2001, Metabolism 50: 407-413). Композит клетка/биоматериал разрезали на кусочки, соответствующие размеру дефекта. Поверхность клеток, полученных из жировой ткани, помещали на обнаженную область роговицы. Композит клетка/биоматериал пришивали к роговице и лимбу, накладывая узловые или непрерывные нейлоновые швы 10-0; любой избыток композита отдрезали (Anderson et al., 2001, Br. J. Ophthalmol; 85(5): 567-575). По завершении операции устанавливали одноразовую бандажную контактную линзу и проводили местную инстилляцию антибиотиками. Послеоперационное наблюдение пациентов проводили в течение от 1 до 4 дней, и пациенты получали лечение антибиотиками в течение соответствующих периодов времени (до 1 месяца). Последующие контрольные обследования, которые проводили спустя 1, 3 и 6 месяцев, включали определение остроты зрения, истинной рефракции глаза, исследование с помощью щелевой лампы и in vivo конфокальной микроскопии.

Пример 3

Методы генотерапии

Далее приводятся способы превращения стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в клетки, экспрессирующие по крайней мере один фактор роста или белок, ускоряющий внутриглазную репарацию (белок, блокирующий TGF ), с помощью векторного подхода (вирусного, трансфекционного и др.). Оперируемым пациентам проводили фототерапевтическую кератэктомию с помощью эксимерного пучка с длиной волны 193 нм, генерируемого эксимерным лазером VISX Star S2 (VISX, Inc., Санта-Клара, Калифорния), с частотой импульсов 10 Гц и плотностью потока 160 мДж/см ², как описано Lee et al. (2001, Ophthalmology; 108(1): 112-20). Стандартную лазерную фотоабляцию с диаметром пятна 6 мм осуществляли по центру на глубину 45 мкм с обычной обработкой операционного поля в эпителии и с использованием подходящих приспособлений для абляции стромы. После проведения фоторефракционной кератэктомии в абляцированную область вводили либо недифференцированные взрослые стромальные клетки, либо дифференцированные в адипоциты взрослые стромальные клетки, полученные из жировой ткани, вместе с биосовместимым материалом. Перед введением клетки подвергали трансфекции или трансдукции соответствующим вектором нуклеиновой кислоты, экспрессирующим растворимый белок, рецептор к трансформирующему фактору роста бета типа II. Этот белок связывается с цитокином, трансформирующим фактором роста бета, и ингибирует его способность инициировать сигнальный каскад трансдукции на клеточном уровне (Rowland-Goldsmith et al., 2001, Clin. Cancer Res., 2001, 7(9): 2931-40). Известно, что трансформирующий фактор роста бета является помехой при реабилитации после проведения операций на роговице и способствует фиброзу роговицы (Jester et al., 1997, Cornea; 16(2): 177-87).

Полученные методами генной инженерии клетки затем культивировали непосредственно на поверхности биосовместимой мембраны, включая, однако этим не ограничиваются, амниотическую мембрану, взятую от свиньи подслизистую интестинальную основу, Ampligraft , Dermagraft или аналогичный продукт. Клетки культивировали либо как недифференцированные фибробластоподобные клетки, либо у них индуцировали дифференцировку в адипоцитном направлении, используя методику, приведенную Halvorsen et al. (2001, Metabolism 50: 407-413). Композит клетка/биоматериал разрезали на кусочки, соответствующие размеру дефекта. Поверхность клеток помещали на обнаженную область роговицы. Композит клетка/биоматериал пришивали к роговице и лимбу, накладывая узловые или непрерывные нейлоновые швы 10-0; любой избыток композита отдрезали (Anderson et al., 2001, Br. J. Ophthalmol; 85(5): 567-575). По завершении операции устанавливали одноразовую бандажную контактную линзу и проводили местную инстилляцию антибиотиками.

Послеоперационное наблюдение пациентов проводили в течение от 1 до 4 дней, и пациенты получали лечение антибиотиками в течение соответствующих периодов времени (до 1 месяца). Последующие контрольные обследования, которые проводили спустя 1, 3 и 6 месяцев, включали определение остроты зрения, истинной рефракции глаза, исследование с помощью щелевой лампы и in vivo конфокальной микроскопии.

Пример 4

Простая трансплантация

Стромальные клетки, полученные из жировой ткани, трансплантировали только внутриокулярно. Оперируемым пациентам проводили фототерапевтическую кератэктомию с помощью эксимерного пучка с длиной волны 193 нм, генерируемого эксимерным лазером VISX Star S2 (VISX, Inc., Санта-Клара, Калифорния), с частотой импульсов 10 Гц и плотностью потока 160 мДж/см ², как описано Lee et al. (2001, Ophthalmology; 108(1): 112-20). Стандартную лазерную фотоабляцию с диаметром пятна 6 мм осуществляли по центру на глубину 45 мкм с обычной обработкой операционного поля в эпителии и с использованием подходящих приспособлений для абляции стромы. После проведения фоторефракционной кератэктомии в абляцированную область вводили либо недифференцированные взрослые стромальные клетки, либо дифференцированные в адипоциты взрослые стромальные клетки, полученные из жировой ткани, с помощью прямой инъекции. Клетки вводили либо в виде суспензии отдельных клеток, либо в виде пласта клеток. По завершении операции устанавливали одноразовую бандажную контактную линзу и проводили местную инстилляцию антибиотиками. Послеоперационное наблюдение пациентов проводили в течение от 1 до 4 дней, и пациенты получали лечение антибиотиками в течение соответствующих периодов времени (до 1 месяца). Последующие контрольные обследования, которые проводили спустя 1, 3 и 6 месяцев, включали определение остроты зрения, истинной рефракции глаза, исследование с помощью щелевой лампы и in vivo конфокальной микроскопии.

Пример 5

Цитокиновый профиль экспрессии стромальных клеток человека, полученных из жировой ткани

Устанавливали цитокиновый профиль экспрессии стромальных клеток человека, полученных из жировой ткани разных доноров. В этих экспериментах конфлюэнтные неактивные стромальные клетки человека, полученные из жировой ткани, стимулировали действием липополисахарида (LPS, 100 нг/мл) и кондиционированной среды и тотальную РНК собирали через интервалы времени от 1 до 24 часов. По аналогии как со стромальными клетками, полученными из костного мозга мыши, так и со стромальными клетками, полученными из костного мозга человека, стромальные клетки, полученные из жировой ткани, экспрессировали следующие цитокиновые мРНК: интерлейкины 6, 7, 8 и 11, фактор ингибирования лейкоза (LIF), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), лиганд flt-3, фактор стволовых клеток, фактор некроза опухоли альфа (TNF ) и костные морфогенетические белки 2 и 4t (BMP-2, -4).

Пример 6

Способность стромальных клеток, полученных из жировой ткани человека, поддерживать пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников крови из пуповины человека

Способность стромальных клеток, полученных из жировой ткани человека, поддерживать пролиферацию и дифференцировку кроветворных клеток-предшественников CD34 ⁺ из пуповины человека определяли в культурах. Конфлюэнтные культуры стромальных клеток, полученных из жировой ткани, готовили в 24-луночных планшетах (6×10⁴ клеток на лунку). Образцы пуповинной крови (USB) освобождали от загрязняющих эритроцитов обработкой гидроксилированным крахмалом, а от загрязняющих гранулоцитов - центрифугированием в градиенте плотности фиколла. Оставшиеся одноядерные клетки USB очищали дифференцировкой по протоколу StemSep (StemCells, Ванкувер, Британская Колумбия); результаты подтверждены отрицательной иммуномагнитной селекцией клеток с использованием коктейля антител, направленных против CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b и гликофорина А. На последней стадии очистки клетки lin из USB окрашивали антителами CD34 и отсортировывали методом проточной цитометрии. Вплоть до 10000 итоговых CD34⁺ клеток USB в индивидуальных лунках получали совместным выращиванием с конфлюэнтным слоем стромальных клеток, полученных из жировой ткани. Культуры содержали в условиях отсутствия экзогенных цитокинов в течение 12 дней, 3 недель или 6 недель. По окончании указанных периодов отбирали клетки из каждой лунки обработкой трипсином/ЭДТА и анализировали методом проточной цитометрии с использованием комбинации следующих антител (флуоресцентные метки приведены в скобках): CD45 (FITC), CD34 (APC) и либо CD7, CD10, либо CD28 (PE). Результаты приведены ниже.

В указанных экспериментах исследовали размножение популяции кроветворных клеток USB в совместной культуре с 12-девными стромальными клетками, полученными из жировой ткани. В отсутствие экзогенных цитокинов стромальные клетки, полученные из жировой ткани, поддерживали 5,1-кратное увеличение общего количества кроветворных клеток (в среднем, n=4 стромальных донора, n=2 донора USB; диапазон 2-9,4). Это соответствовало 2,4-кратному увеличению популяции CD34⁺ клеток USB (в среднем, n=4 стромальных донора, n=2 донора USB; диапазон 1,4-3,3). Значительный процент как CD34⁺ клеток, так и CD34 клеток экспрессировали либо антиген CD7, либо антиген CD10 (фиг.4, в среднем, n=4 стромальных донора, n=2 донора USB). Индивидуальные фенотипы составляли следующие процентные отношения к общей популяции кроветворных клеток: ранние предшественники лимфоидных клеток, 20,2% (CD34⁺ CD7⁺ ) и 9,5% (CD34⁺ CD10⁺ ) соответственно; предшественники NK/T-клеток (CD34CD7 ⁺), 31,4%; и предшественники В-клеток (CD34CD10 ⁺), 7,7%.

Дальнейший анализ показал, что наблюдалось значительное размножение ранних предшественников лимфоидных клеток. Популяция CD34⁺ CD7⁺ размножилась в 4,8±2,2 раз по сравнению с 12-дневными клетками-предшественниками (среднее ± стандартное отклонение, n=4 стромальных донора, n=2 донора USB). Аналогично, популяция CD34⁺ CD10⁺ размножилась в 3,5±1,6 раз (среднее ± стандартное отклонение, n=4 стромальных донора, n=2 донора USB). Эти значения превзошли степень размножения популяции CD34⁺ в целом и свидетельствовали о том, что при таком подходе можно обогатить популяцию предшественников лимфоидных клеток человека. Полученные результаты показали, что стромальные клетки, полученные из жировой ткани, могут поддерживать in vitro дифференцировку предшественников кроветворных клеток.

После ознакомления с представленным выше описанием и чертежами для специалистов в области техники, к которой относится настоящее изобретение, должны быть очевидны модификации и другие варианты осуществления настоящего изобретения. Следует поэтому понимать, что приведенные специфические варианты его осуществления не ограничивают настоящее изобретение и что модификации и другие варианты осуществления настоящего изобретения должны быть включены в объем притязаний, изложенных в приведенной далее формуле изобретения. Хотя в описании изобретения приведены специфические термины, они используются лишь как общие и описательные, а не с целью ограничить настоящее изобретение.