способ защиты в эксперименте от повреждающего действия ионизирующего излучения

Формула изобретения

Способ защиты в эксперименте от повреждающего действия ионизирующего излучения путем воздействия излучением гелий-неонового лазера, отличающийся тем, что клетки фибробластов облучают дозой 0,99 мДж/см² при мощности лазерного излучения 0,5 мВт и диаметре лазерного пучка 4,4 см.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области радиационной биологии и медицины, а именно защиты биологических объектов от повреждающего действия ионизирующих излучений.

Известно, что повышения выживаемости живых организмов облученных ионизирующим излучением можно добиться применяя радиопротекторы, такой метод защиты называется фармако-химической [1, 2]. Под фармакологической защитой понимают введение в организм протектора, в большинстве случаев перед облучением, приводящее к повышению выживаемости животных по сравнению с контрольным, облученным в той же дозе, но без протектора. Для определения радиационной эффективности радиопротекторов используют коэффициент ФИД (фактор изменения дозы облучения), который показывает, насколько надо увеличить дозу облучения защищенных животных, чтобы смертность среди них сравнялась со смертностью контрольной группе, не получившей до облучения радиопротектор. Интервал времени для получения эффективной защиты радиопротекторов небольшой, обычно он составляет 5-15 минут. Считается, что этого времени достаточно для проникновения протектора в ткани животного и присутствия его в процессе облучения. Известно, что защитный эффект химических протекторов зависит от репарационного генотипа клеток [3], а также от линейной передачи энергии (ЛПЭ) ионизирующих излучений: многие протекторы эффективно защищают клетки от поражающего действия редкоионизирующих излучений, но при действии плотноионизирующих излучений оказываются неэффективными.

На основании литературных данных (клинических и экспериментальных) можно сказать, что в настоящее время наиболее эффективными радиопротекторами являются сульфгидрильные соединения, которые могут быть эффективными также после воздействия радиации, однако существуют две основные проблемы, связанные с их использованием. Первым из них является токсичность этих протекторов, вторым - краткосрочная активность [4, 5]. Единственный радиопротектор, успешно используемый в клинике, это амифостин, однако, по мнению некоторых авторов, его использование для людей нежелательно, поскольку его использование в тех дозах, которые реально защищают организм от воздействия ионизирующей радиации, токсичны [6, 7]. В настоящее время амифостин применяется также в лучевой терапии онкологических заболеваний, поскольку является специфичным для нормальных клеток, а опухолевые клетки от воздействия радиации не защищает.

Необходимо также отметить, что не существуют радиозащитные средства, которые можно использовать локально, т.е. для радиозащиты какой-либо области тела, в частности кожного покрова или слизистых оболочек носовой или ротовой полости. Такая необходимость нередко возникает в процессе лучевой терапии или хирургии онкологических заболеваний. Подобная защита может понадобиться также в некоторых производственных ситуациях, когда какая-то часть тела человека подверглась воздействию ионизирующего излучения с большой линейной передачей энергии (ЛПЭ), например альфа-частиц, которые приникают в тело неглубоко.

Предложенное радиозащитное средство решает проблему токсичности радиопротектов, а также позволяет использовать радиопротектор до, после и одновременно с воздействием ионизирующих излучений на биологические объекты. Кроме этого, донный способ универсален, его можно использовать независимо от генотипа защищаемых клеток и от качества повреждающего ионизирующего излучения. Еще одним преимуществом данного способа радиозащиты является то, что его можно использовать локально и не вводить в организм.

Поставленная цель достигается тем, что биологический объект облучают ионизирующим излучением и для радиационной защиты этого объекта используют радиопротектор, при этом в качестве радиопротектора используется излучение гелий-неонового лазера с длиной волны 633 нм, которым воздействуют на биологический объект перед, после или одновременно с воздействием ионизирующего излучения, а воздействию протектора подвергается только поверхность облучаемого объекта.

Сущность предлагаемого способа поясняется конкретным примером. Предлагаемый способ был использован для радиационной защиты клеток мышиных фибробластов С3Н10Т1/2. Клетки мышиных фибробластов С3Н10Т1/2 были получены Reznikoff с соавторами [8, 9]. В наших экспериментах использована клеточная линия из коллекции Института Цитологии РАН (Санкт-Петербург). В экспериментах использовались клетки С3Н10Т1/2, прошедшие не более 18 пассажей.

Клетки выращивали в среде Игла, с добавлением телячьей эмбриональной сыворотки (10%), пенициллина (50 ед/мл) и стрептомицина (50 мкг/мл).

Культуру синхронизировали по методу, описанному в работе [10]. Клетки плотностью 2,7·10³ клеток/см ² высевали на пластмассовые флаконы с площадью поверхности 25 см² и выращивали в течение 11 дней в термостате при температуре 37°С. Среду обновляли через 6 суток после посева. Такая 11-дневная культура содержит 94% клеток в фазе G₁ [10]. Непосредственно перед облучением клетки подвергали дисперсии 0,25% раствором трипсина. Полученную суспензию центрифугировали и приготовляли клеточную суспензию в питательной среде для облучения (концентрация суспензии - 1-5·10 ⁵ клеток/мл). Клеточную суспензию облучали в 2 мл пластиковых пробирках. Для определения выживаемости в пять флаконов засевали такое количество клеток, чтобы в результате можно было получить примерно 150-200 клеточных колоний на чашку. После 10-дневной инкубации при 37°С эти колонии фиксировались метанолом и окрашивались красителем Гимза. Колонии, содержащие более 50 клеток, считали выжившими. Выживаемость определяли сравнением количества колоний выросших в облученных и необлученных (контрольных) образцах. Эффективность посева для контрольных клеток составляла примерно 13%.

Облучение клеток проводилось в Медико-техническом комплексе (МТК) Лаборатории ядерных проблем (ЛЯП) Объединенного института ядерных исследований [11]. Выведенные из ускорителя ЛЯП протоны с энергией 660 МэВ замедлялись в углеродных блоках до средней энергии около 150 МэВ. После коллимации и магнитного анализа пучок протонов транспортировался в одну из процедурных комнат МТК, предназначенных для облучения пациентов. Поперечные размеры пучка в точке облучения составляли 5 см × 5 см по 90% - изоуровню.

Поглощенную дозу измеряли с помощью клинического дозиметра CD 27012 (Германия).

Для облучения клеток -лучами использовали гамма-терапевтический аппарат "Рокус-М" фирмы "Равенство" с источником ⁶⁰ Co.

В качестве источника лазерного излучения использовали гелий-неоновый лазер УУЛИ 2 (производство России) с мощностью излучения 0,5 мВт. Длина волны излучения 633 нм. Диаметр лазерного пучка составлял 4,4 см.

Временной интервал между двумя видами облучения не превышал 60 с в случае комбинированных облучений клеток.

Исследовались как предварительное и последующее, так и одновременное с ионизирующим излучением лазерное облучение клеток фибробластов при действии на них протонов и -излучения.

В результате пробных исследований была установлена оптимальная доза лазерного облучения, приводящая к максимальному радиозащитному эффекту при предварительном и последующем лазерном облучениях (фиг.1). На фиг.1 приведены кривые зависимости эффективности радиозащитного действия лазерного излучения на клетки фибробластов при комбинированном облучении лазерным излучением и протонами (в дозе 4 Гр) от дозы лазерного облучения (1 - протоны + лазерное излучение, 2 - лазерное излучение + протоны, 3 - протоны в дозе 4 Гр).

Оказалось, что максимальный радиозащитный эффект наблюдается при плотности энергии лазерного облучения 0,99 мДж/см².

После этого нами были получены кривые выживания клеток фибробластов облученных протонами и -лучами с предварительным и последующим облучением лазерным излучением в оптимальной дозе. Результаты этих исследований представлены на фиг.2 и 3.

На фиг.2 показана выживаемость клеток С3Н10Т1/2 при комбинированном облучении лазерным и -излучениями (1- -излучение, 2 - лазерное излучение + -излучение, 3 - -излучение + лазерное излучение. Доза лазерного облучения - 0, 99 мДж/ см²).

На фиг.3 показана выживаемость клеток С3Н10Т1/2 при комбинированном облучении лазерным излучениями и протонами (1 - облучение протонами, 2 - лазерное излучение + протоны, 3 - протоны + лазерное излучение. Доза лазерного облучения - 0,99 мДж/см²).

Из этих чертежах видно, что лазерное излучение оказывает довольно эффективное радиозащитное действие во всех вариантах комбинированных облучений. Об этом свидетельствуют значения факторов изменения доз (ФИД), рассчитанных по ЛД₅₀ (таблица 1). Надо отметить, что эффективности известных химических радиопротекторов, оцениваемые по ФИД, также лежат в таких пределах.

Проведенные эксперименты также показали, что лазерное излучение оказывает радиозащитное действие на фибробласты при одновременном облучении клеток протонами с энергией 150 МэВ и лазерным излучением (фиг.4). На фиг.4 приведена кривая выживания клеток фибробластов при одновременном облучении протонами и лазерным излучением (1 - облучение протонами, 2 - одновременное облучение протонами и лазерным излучением. Плотность энергии лазерного облучения составляла 1,55; 3,1; 6,2; 12,4 мДж/см² для доз облучения протонами 1, 2, 4 и 8 Гр соответственно). Нетрудно заметить, что ФИД в этом случае тоже достаточно высокий (таблица 1).

Таблица 1
Значения ФИД при комбинированном облучении клеток фибробластов С3Н10Т1/2 лазерным и ионизирующим излучениями
Схема облучения	ФИД, рассчитанный по ЛД 50
Лазер, изл + протоны	1.8±0.08
Протоны + лазер. изл.	2.2±0.09
Лазер, изл. + -изл.	1.3±0.04
-изл. + лазер, изл.	1.8±0.03
Одновременно лаз. изл. и протоны	1.9±0.05

ЛИТЕРАТУРА

1. Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных. - М.: Высшая школа, 1977. - 367 с.

2. Кудряшов Ю.Б., Беренфельд Б.С. Основы радиационной биофизики. - Изд-во МГУ, 1982. - 251 с.

3. Bresler S.E., Sverdlov A.G., etc. Influence of genotype of bacterial cells on radioprotective action ofindolylalkylamins. - Studia Biophisica, 1975, V.53, № 1, P.163-166.

4. Bondaruk О.S., Moskalets О.I. Current status and perspectives of using radioprotectors in clinical practice. Lik Sprava, 2003, Oct-Nov: № 7, P. 3-12.

5. Kutta H., Kampen U. Sagovski et al Amifostin is a potent radioprotectorof selivery gisnds in radioiodine therapy Structural and ultrastructural findings Strahlenther Onkol. 2005. Fpr; 181 (4) P.237-245.

6. Santini V. Amifostin: chemotherapeutic and radioprotecting protective effects. Expert Opin Pharmacother 2001 Mar; 2 (3) p.479-489

7. Wasserman Т.H., Brizel D.M. The role of amifostin as a radioprotector. Oncology (Willison Park). 2001 Oct; 15 (10) P.1349-1354.

8. Reznikoff С., Bertram J., Brankov D.W., and Heidelberger С. Quantitative and qualitative studies of chemical transformation of cloned C3H mouse embryo cells sensitive to post - confluence inhibition of cell division//Cancer Res. 1973. №33. P.3239-3249.

9. Reznikoff С., Bertram J., Brankov D.W., and Heidelberger С. Establishment and characterization of a cloned line of C3H mouse embryo cells sensitive to post - confluence inhibition of cell division //Cancer Res. 1973. №33. P.3231-3238.

10. Terasima Т., Yakusava M., and Kimura M. Neoplastic Transformation of plateau-phase mouse 10T1/2 cells following single and fractionated doses of X-rays // Cancer Res. 1985. №102. P.367-377.

11. Savchenko O.V. // Status and prospects of new clinical methods of cancer diagnostics and treatment based on particle and ion beams available at JINR. - Communication of the Joint Institute for Nuclear Research, Dubna. - 1996. - E18-96-124.