средство, обладающее иммуномодулирующей активностью

Формула изобретения

Применение водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев березы, в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, стимулирующего Th1-зависимый тип иммунного ответа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

В настоящее время в целях профилактики и терапии инфекционных и онкологических заболеваний используется ряд иммуномодулирующих лекарственных средств. По происхождению выделяют иммуномодуляторы микробные, тимические, костномозговые, растительные, цитокины, нуклеиновые кислоты, химически чистые вещества [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003]. Из лекарственных средств растительного происхождения наиболее известны препараты на основе эхинацеи пурпурной (иммунал, иммунорм, эстифана таблетки, доктор Тайсс настойка эхинацеи, доктор Тайсс экстракт эхинацеи) [Энциклопедия лекарств, №11, 2004а, б, в]. Препараты Иммунал и Иммунорм содержат сок, полученный из свежесобранной травы цветущей эхинацеи пурпурной [Энциклопедия лекарств, №11, 2004б, в], а доктор Тайсс - экстракт листьев эхинацеи [Энциклопедия лекарств, №11, 2004а]. Поскольку эти препараты содержат смесь биологически активных веществ, то их иммуномодулирующие свойства являются результирующей суммы разнонаправленных эффектов. Так, например, показано, что содержащиеся в эхинацее алкиламиды могут подавлять продукцию интерлейкина-2 [Sasagawa М. et al., 2006]. Отсутствие селективного действия на иммунную систему дало основание [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003] склониться к мнению о том, что такие препараты следует считать скорее биологически активными добавками, чем лекарственными средствами направленного действия.

Наиболее близким (базовым) препаратом является ликопид. Он представляет собой гликопептид, фармакологическая мишень которого - антиген-презентирующие клетки и фагоциты (макрофаги и нейтрофилы) [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003]. Известно, что одним из основных регуляторов развития лимфоцитов 1 типа (Тh1) является интерлейкин-12, который появляется в раннюю фазу инфекции. Главный источник этого цитокина - антиген-презентирующие клетки (макрофаги/моноциты). Ликопид обладает способностью стимулировать эти клетки и повышать продукцию воспалительных монокинов (интерлейкин-1, фактор некроза опухоли, интерферон-гамма, колониестимулирующий фактор) [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003].

Как следует из анализа имеющейся в настоящий момент литературы, взаимодействовать с антигенпрезентирующими клетками могут и полисахариды различного генеза (микроорганизмы, грибы, растения). Однако результаты такого взаимодействия неоднозначны: полисахариды могут стимулировать как воспалительные, так и противовоспалительные свойства макрофагов. Следовательно, эта группа веществ может стимулировать или подавлять Тh1-зависимый тип иммунного ответа.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств растительного происхождения, способных стимулировать Th1-зависимый тип иммунного ответа.

Поставленная задача решается путем применения фракции водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев березы, в качестве стимулятора классической активации антигенпрезентирующих клеток для усиления Тh1 типа иммунного ответа.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев березы.

Новое свойство водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев березы, было обнаружено благодаря экспериментальным исследованиям.

Новое свойство полисахаридов явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники и описание его не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. В качестве иммуномодулирующего средства водорастворимые полисахариды, полученные из листьев березы, можно использовать при лечении хронических, вялотекущих и рецидивирующих инфекционно-воспалительных процессов любой локализации.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Полисахариды получены по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975]. Сырые листья березы измельчали и просеивали через сита с размером пор 1 и 3 мм, экстрагировали водой при перемешивании в течение 30-180 мин, при нагревании на водяной бане (температура 80-100°С), при соотношении сырье:экстрагент от 1:10 до 1:50. После этого сырье с экстрагентом оставляли на время от 6 до 36 часов в прохладном месте для настаивания. Затем экстрагент отделяли от сырья фильтрованием, экстракцию повторяли вновь в тех же условиях. После фильтрации полученные извлечения объединяли и упаривали до 1/5 объема. Полисахариды осаждали добавлением к полученному раствору двукратного количества 96%-ного этанола. Выпавший осадок центрифугировали, отделяли от раствора, промывали 96%-ным этиловым спиртом и высушивали. Выход водорастворимых полисахаридов составлял 0,7 г (7%). Сумма водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев березы, представляла собой медленнорастворимые в воде прозрачные легкие слюдообразные пластинки диаметром до 5 мм светло-желтого цвета, в то время как полисахариды, полученные из листьев календулы, имели вид мелкозернистых тяжелых гранул темно-коричневого цвета с диаметром частиц до 1,5 мм.

Эксперименты проведены на 80 линейных мышах BAlb/с массой 20 г, возраст 8 недель. В предварительных экспериментах было выявлено, что оптимальной суточной дозой полисахаридов, полученных из березы, для иммуномодуляции является 10 мг/кг массы тела.

Для индукции Тh1 типа иммунного ответа животных иммунизировали эритроцитами барана, которые, как известно, вызывает развитие именно этого типа иммунного ответа. Для изучения влияния водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев березы, на гуморальный и клеточный иммунный ответ мышам вводили раствор полисахаридов по 10 мг/кг массы тела ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней. Через 5 дней от начала введения животных иммунизировали эритроцитами барана (по 5×10⁶ внутрибрюшинно при определении числа АОК и титра антител по 1×10 ⁸ при проведении реакции гиперчувствительности замедленного типа).

Влияние полисахаридов на гуморальное звено иммунитета оценивали по изменению числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных мышей и по титру антител в сыворотке крови [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Для этого животных забивали через 5 дней после иммунизации, лимфоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе, после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным изотоническим раствором хлорида натрия, ресуспендировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53°С, вносили 0,9 мл среды культивирования (среда 199, 0,7% агар «Difco»), 0,2 мл 20%-ной взвеси эритроцитов барана, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента. После ресуспендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 ч при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа. Титр антител в сыворотке крови определяли в реакции агглютинации [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Для этого животных забивали цервикальной дислокацией, вскрывали грудную полость и забирали кровь из сердца, после чего клеточные элементы осаждали центрифугированием. Полученную сыворотку раститровывали в 96-луночном планшете с шагом 1/2, добавляли эритроциты барана, инкубировали при 37°С 2 часа и учитывали реакцию. За титр принимали то последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще наблюдается агглютинация.

Для оценки действия исследуемого вещества на клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Для этого на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (10⁸ эритроцитов барана в 0,02 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,02 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия («контрольная лапа»). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 часа по разнице массы опытной (Мо) и контрольной (Мк) лап. Животных забивали, обе лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Индекс реакции (ИР, %) вычисляли для каждой мыши по формуле:

Статистическую обработку проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при р<0,05.

Пример 1

Курсовое введение полисахаридов, полученных из листьев березы, привело к увеличению в 2,8 раза числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенках мышей (табл.1). У животных, не получавших исследуемого вещества, количество АОК составило 179,6 тыс. из расчета на 1 селезенку, в то время как у мышей после курсового введения полисахаридов их число составило 506,0 тыс. на 1 селезенку. Количество антител, вырабатываемых В-лимфоцитами в ответ на введенный антиген (эритроциты барана), под влиянием курсового введения полисахаридов повышалось на 40% (табл.1). Как видно из табл.1, стимулирующая активность полисахаридов не уступала таковой фармакопейному препарату Ликопиду. Полученные результаты свидетельствуют о том, что изучаемое вещество обладает способностью стимулировать гуморальный иммунный ответ, повышая количество антителообразующих клеток и их функциональную активность.

Таблица 1. Влияние курсового введения полисахаридов (ПС), полученных из листьев березы, на количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенках мышей и продукцию ими антител (Х±m)
Группа	Число АОК, 103 /селезенку	Титр антител, log2
Контроль (физ. р-р)	36,7±6,0	5,50±0,51
Ликопид (10 мг/кг)	66,9±9,3*	6,0±0,8*
Ликопид (2 мг/кг)	72,9±9,7*	8,5±0,5*
ПС березы (10 мг/кг)	82,9±7,6*	7,67±0,44*
Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Пример 2

Курсовое введение полисахаридов, полученных из листьев березы, усиливало эффекторную фазу реакции клеточного ответа на эритроциты барана (табл.2).

Таблица 2. Влияние курсового введения полисахаридов (ПС), полученных из листьев березы, на реакцию гиперчувствительности замедленного типа на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана (Х±m)
Группа	Индекс реакции (%)
Контроль (физ.р-р) n=10	9,85±1,73
ПС календулы n=10	11,46±2,71
ПС березы (10 мг/кг) n=10	17,77±3,78*
Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

У мышей, которым вводили только растворитель (изотонический раствор хлорида натрия), индекс реакции составил 9,85%. У животных в результате курсового введения полисахаридов, полученных из листьев березы, индекс реакции был увеличен в 1,8 раза и составил 17,77%. Водорастворимые полисахариды, выделенные таким же способом, но из другого растительного сырья - листьев календулы, стимулирующей активности в данной иммунологической реакции не проявили.

Таким образом, экспериментально установлено, что полисахариды, полученные из листьев березы, стимулируют протекание иммунного ответа, вызванного эритроцитами барана. Известно, что эритроциты барана вызывают развитие иммунного ответа Тh1-зависимого типа.

Водорастворимые полисахариды, полученные из листьев березы, являются активаторами Тh1-зависимого типа иммунного ответа и могут расширить арсенал средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при хронических, вялотекущих и рецидивирующих инфекционно-воспалительных процессах любой локализации.

Литература

1. Методы исследования углеводов (пер. с английского В.А.Несмеянова, под. ред. проф. Харлина). М.: Мир, 1975. С.274.

2. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов (методические рекомендации) // Ведомости Фармакологического комитета. 1999. №1. С.31-36.

3. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения. // Клиническая медицина. 1996. №8. С.7-12.

4. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение. // Иммунология. 2003. №3. С.196-202.

5. Энциклопедия лекарств. 2004а. №11. М.: Изд-во ООО «РЛС-2004». С.320.

6. Энциклопедия лекарств. 2004б. №11. М.: Изд-во ООО «РЛС-2004». С.360.

7. Энциклопедия лекарств. 2004в. №11. М.: Изд-во ООО «РЛС-2004». С.362.

8. Sasagawa M., Cech N.B., Gray D.E. et al. Echinacea alkylamides inhibit interleukin-2 production by Jurkat Т cells // Int. Immunopharmacol. 2006. Vol.6, №7. P.1214-1221.