способ получения иммобилизованных физиологически активных веществ

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованных физиологически активных веществ путем взаимодействия физиологически активного вещества с сополимером N-акрилоилгидроксифталимида, имеющем нижнюю критическую температуру смешения, отличающийся тем, что в качестве физиологически активного вещества используют гепарин или гирудин, а в качестве сополимера N-акрилоилгидроксифталимида используют сополимер 1-5 мол.% N-акрилоилгидроксифталимида, 88-98 мол.% N-изопропилакриламида или N,N-диэтилакриламида и 1-7 мол.% акриламида, имеющий молекулярную массу 8900-18000.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу получения иммобилизованных физиологически активных веществ, в частности антикоагулянтов крови, используемых для профилактики и лечения тромбозов, тромбофлебита, тромбоэмболии, тромбоэмболических осложнений и т.д.

Наибольшее распространение в качестве антикоагулянта крови в настоящее время находит гепарин - кислый мукополисахарид, состоящий из остатков глюкуроновой кислоты и глюкозамина, этерифицированных серной кислотой. Относительная молекулярная масса гепарина около 16000. В наибольших количествах он содержится в печени и легких, меньше - в скелетных мышцах, селезенке, мышце сердца. Добывается из легких крупного рогатого скота [Ульянов A.M., Ляпина Л.А. Современные данные о гепарине и его биохимических свойствах. Успехи современной биологии. 1977. Т.83. №1. С.69-85].

Гепарин является естественным противосвертывающим фактором. Механизм действия гепарина, в основном, заключается в нейтрализации свертывающей активности тромбина путем ускорения его реакции с антитромбином III. В наибольшей степени гипокоагуляционный эффект наблюдается при внутривенном введении гепарина. Однако для профилактических целей гепарин часто вводят внутримышечно и подкожно. Применяют для профилактики и терапии различных тромбоэмболических заболеваний и их осложнений: для предотвращения или ограничения (локализации) тромбообразования при остром инфаркте миокарда, при тромбозах и эмболиях магистральных вен и артерий, сосудов мозга, глаза, при операциях на сердце и кровеносных сосудах, для поддержания жидкого состояния крови в аппаратах искусственного кровообращения и аппаратуре для гемодиализа, а также для предотвращения свертывания крови при лабораторных исследованиях [Машковский А.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина. 1993. Т.2. С.79-81].

Гирудин - полипептид, выделяемый из слюнных желез медицинских пиявок или получаемый рекомбинантным способом, состоит из 65 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 12000. Основная биологическая функция гирудина заключается в предотвращение свертывания крови за счет нейтрализации свертывающей активности тромбина при образовании комплекса тромбин-гирудин [Markwardt F. Hirudin as an inhibitor ofthrombin. // Methods in Enzymol. 1970. V.19. P.924-932]. Гирудин является антикоагулянтом прямого действия. В отличие от гепарина он не вступает в реакцию с другими факторами системы свертывания крови и оказывает свое ингибирующее действие на тромбин без участия каких-либо находящихся в крови компонентов. В связи с этим, в последние годы этот препарат получил широкое распространение при лечении заболеваний или состояний, при которых гепаринотерапия оказывается недостаточно эффективной, например, в остром периоде инфаркта миокарда, при нестабильной стенокардии и т.д.

Все известные способы введения антикоагулянтов крови не обеспечивают локальное концентрирование препарата в области тромбообразования, и антикоагулянты распространяются по всему организму, вызывая нежелательное повышение фибринолитической активности во всей кровеносной системе.

В связи с этим, чрезвычайно актуальными представляются работы по созданию препаратов направленного действия. В основе большинства подходов лежит совместная иммобилизация на растворимом носителе лекарственного вещества и молекулы-вектора, специфически взаимодействующего с тканями пораженного органа [Чазов Е.И., Смирнов В.Н., Торчилин В.П. Макромолекулярные лекарственные препараты в кардиологии // ЖВХО им. Д.И.Менделеева. 1985. Т.30. №4. С.365-372].

Недостатком этого подхода является его сложность и не универсальность: для каждого конкретного лекарства и органа-мишени необходимо искать или синтезировать свои молекулы-векторы и разрабатывать методы иммобилизации, не изменяющие транспортные свойства носителя и физиологическую активность лекарства.

Концентрирование препарата может быть достигнуто также с использованием внешних воздействий, например магнитного поля. Метод основан на иммобилизации соответствующего лекарственного препарата на носителе, обладающем ферромагнитными свойствами. Препарат вводят в организм, а на определенное место или орган накладывают внешнее магнитное поле, под влиянием которого и осуществляется направленный транспорт лекарства. В качестве магнитоуправляемых носителей используют белковые и полисахаридные микросферы, липосомы, эритроциты и т.д., "нагруженные" мелко дисперсными зернами железа или оксида железа [Chang M.S. Magnetic transport. // In: Drug carriers in biology and medicine// London: - Academic Press. 1981]. Недостатками этого подхода является невозможность получения водорастворимых полимерных производных физиологически активных веществ, а при повышении размеров носителя возникает опасность эмболизации капилляров.

Известен подход к направленному транспорту, основанный на использовании термоактивации в качестве движущей силы процесса. Этот подход заключается в иммобилизации транспортируемого вещества на водорастворимом полимере, имеющем нижнюю критическую температуру смешения (НКТС), и нагревании мишени до температуры выше критической [Л.И.Валуев, О.Н.Зефирова, И.В.Обыденнова, Н.А.Платэ. Водорастворимые полимеры с нижней критической температурой смешения для направленного транспорта лекарственных препаратов и других веществ. Высокомолекулярные соединения. 1993. Т.35. №1. С.83-86]. Использование этого подхода представляется довольно перспективным, поскольку в зонах воспаления или новообразований нередко наблюдается местное повышение температуры, что должно обеспечить самопроизвольное концентрирование лекарства в этих зонах [Чазов Е.И., Смирнов В.И., Торчилин В.П. Макромолекулярные лекарственные препараты в кардиологии // ЖВХО им. Д.И.Менделеева. 1985. Т.30. №4. С.365-372]. Кроме того, всегда существует возможность локального нагревания органа-мишени и принудительного транспорта лекарства в этот орган.

Из приведенных примеров видно, что во всех случаях для придания физиологически активным веществам способности к направленному транспорту их необходимо иммобилизовать на соответствующем носителе.

Известен способ получения иммобилизованных физиологически активных веществ путем взаимодействия физиологически активного вещества с полимерным носителем непосредственно или с помощью специального сочетающего агента [Иммобилизованные ферменты. Под редакцией И.В.Березина, В.К.Антонова и К.Мартинека. Изд-во Московского университета. 1976. T.1. C.213-223]. В качестве физиологически активного вещества используют белки, ферменты, гормоны и т.д., а в качестве полимерного носителя - природные и синтетические полимеры. Среди используемых физиологически активных веществ отсутствуют природные антикоагулянты крови, а среди используемых носителей нет синтетических полимеров, обладающих нижней критической температурой (НКТС). Все это не позволяет использовать полученные иммобилизованные соединения в качестве антикоагулянтов для направленного транспорта.

Известно использование иммобилизованных физиологически активных соединений в качестве гемосовместимых полимерных материалов. Такие материалы получают иммобилизацией ненасыщенного производного гепарина на полимерном носителе [Авторское свидетельство СССР №749071, C08F 267/10, 1980; Авторское свидетельство СССР №1120679, С08F 291/00, 1984]. В результате иммобилизации время свертывания крови при контакте с таким материалом повышается с 3-5 минут (для исходного полимера) до более 20 минут.

Известно использование иммобилизованного гирудина для повышения гемосовместимости полимерных материалов [B.Seifert, P.Romaniuk, T.Groth. Covalent immobilization of hirudin improves the haemocompatibility of polylactide-polyglycolide in vitro. Biomaterials. V.18(22). P.1495-1502. 1997]. Процесс проводят путем иммобилизации гирудина на сополимерах лактидов с гликолидами с помощью глутарового альдегида.

Все полученные гемосовместимые материалы не растворимы в крови, и их используют для изготовления протезов кровеносных сосудов, трубок в аппаратах искусственного кровообращения, деталей имплантируемых в живой организм имплантатов.

Известно получение растворимых производных антикоагулянтов крови, например, гирудина [M.D. Phaneuf, С.К. Ozaki, M.T. Johnstone, J.P. Loza, W.C. Quist, F.W. LoGerfo. Covalent linkage of streptokinase to recombinant hirudin: a novel thrombolytic agent with antithrombotic properties. Thromb. Haemost. V.71 (4). P.481-487. 1994]. Растворимые производные получают реакцией гирудина с природным полимером - стрептокиназой, в присутствии сшивающего агента. Получаемые производные обладают тромболитической и антитромбиновой активностью, но не способны к направленному транспорту.

Известен способ получения растворимых производных гирудина путем взаимодействия гирудина с сополимером N-акрилоилгидроксифталимида, имеющем нижнюю критическую температуру смешения (НКТС) [И.Л.Валуев, А.В.Пан, М.А.Розенфельд, Л.И.Валуев, Н.А.Платэ. Полимерные системы с антитромбиновой активностью для термоактивируемого направленного транспорта. Прикладная биохимия и микробиология. Т.39. №3. С.359-362. 2003]. В качестве сополимера N-акрилоилгидроксифталимида используют сополимер 1-5 мол.% N-акрилоилгидроксифталимида с 95-99 мол.% N,N-диэтилакриламида.

Недостатком этого способа является низкая антитромбиновая активность полученного препарата, которая не превышает 1500 антитромбиновых единиц, что составляет около 6% от активности исходного гирудина. Кроме того, полученный препарат имеет молекулярную массу выше 30000. Это приводит к накапливанию полимера в организме после выполнения лекарственной функции, так как известно, что молекулярная масса синтетических полимеров, при которой полимер способен полностью выводиться из организма, не должна превосходить 30000 [Н.А.Платэ, А.Е.Васильев. Физиологически активные полимеры. М.: Химия. 1986. С.45].

Наиболее близким к заявляемому является способ получения иммобилизованных физиологически активных веществ путем взаимодействия физиологически активного вещества с сополимером N-акрилоилгидроксифталимида, имеющим нижнюю критическую температуру смешения [Л.И.Валуев, О.Н.Зефирова, И.В.Обыденнова, Н.А.Платэ. Водорастворимые полимеры с нижней критической температурой смешения для направленного транспорта лекарственных препаратов и других веществ. Высокомолекулярные соединения. 1993. Т.35. №1. С.83-86]. В качестве физиологически активного вещества используют трипсин, а в качестве сополимера N-акрилоилгидроксифталимида - сополимер 1 мол.% N-акрилоилгидроксифталимида с 91-99 мол.% N-изопропилакриламида 0-8 мол.% акриламида. Получаемый препарат имеет нижнюю критическую температуре смешения 32-38°С и способен растворять фибриновые сгустки.

Недостатком известного подхода является высокая молекулярная масса используемого полимера, равная 150000-200000, а также невозможность использования получаемого препарата в качестве антикоагулянта крови.

Целью предлагаемого изобретения является получение полимерных производных антикоагулянтов крови с пониженной молекулярной массой.

Решение поставленной цели достигается тем, что в способе получения иммобилизованных физиологически активных веществ путем взаимодействия физиологически активного вещества с сополимером N-акрилоилгидроксифталимида, имеющим нижнюю критическую температуру смешения, в качестве физиологически активного вещества используют гепарин или гирудин, а в качестве сополимера N-акрилоилгидроксифталимида используют сополимер 1-5 мол.% N-акрилоилгидроксифталимида, 88-98 мол.% N-изопропилакриламида или N,N-диэтилакриламида и 1-7 мол.% акриламида, имеющий молекулярную массу 8900-18000.

Пример 1. В реакционный сосуд вносят 150 мл диметилформамида, 0,217 г N-акрилоилгидроксифталимида (АФИ), 11,074 г N-изопропилакриламида, 0,071 г акриламида (АА) и 0,45 г катализатора полимеризации - азо-бис-изобутиронитрила. Сосуд вакуумируют до 1-2 мм рт.ст. и выдерживают при 80°С в течение 8 часов. Диметилформамид удаляют испарением, а сополимер очищают путем растворения в холодной воде (5-10°С) с последующим нагреванием раствора до 45-50°С для осаждения сополимера. Молекулярную массу сополимера определяют методом светорассеяния. НКТС сополимера определяют как точку помутнения 0,3%-ного водного раствора при нагревании со скоростью 1 град./мин.

Примеры 2-12. Процесс проводят по примеру 1, используя различные количества сомономеров и катализатора (табл.1). При использовании N,N-диэтилакриламида вместо N-изопропилакриламида в качестве растворителя применяют тетрагидрофуран, а полимеризацию проводят в течение 24 часов при 65°С.

Таблица 1
№ примера	Состав реакционной смеси, г				Мольное отношение АФИ:I(II):АА	Молекулярная масса	НКТС, °C
	АФИ	I или II*	АА	Кт
1	0.217	11.074(I)	0.071	0.45	1:98:1	8900	26
2	0.651	10.622(I)	0.213	0.45	3:94:3	9100	28
3	0.868	10.396(I)	0.284	0.45	4:92:4	11200	31
4	1.085	11.176(II)	0.497	0.45	5:88:7	10900	36
5	0.217	11.074(I)	0.071	0.30	1:98:1	14400	22
6	0.651	10.622(I)	0.213	0.30	3:94:3	12200	22
7	0.868	11.684(II)	0.284	0.30	4:92:4	15800	27
8	1.085	9.944(I)	0.497	0.30	5:88:7	14100	33
9	0.217	12.446(II)	0.071	0.15	1:98:1	17300	21
10	0.651	10.622(I)	0.213	0.15	3:94:3	17000	20
11	0.868	10.396(I)	0.284	0.15	4:92:4	18000	24
12	1.085	11.176(II)	0.497	0.15	5:88:7	18300	29
* I - N-изопропилакриламид, II - N,N-диэтилакриламид

Пример 13. В 50 мл воды растворяют 0,1 г сополимера, полученного по примеру 1, и 0,01 г гирудина. Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 24 часов. Раствор нагревают до 45°С. Образующийся осадок отделяют фильтрованием.

Примеры 14-24. Процесс проводят по примеру 1, используя сополимеры, полученные по примерам 2-12, соответственно. Количества соединений, вводимых в реакцию, и свойства полученных продуктов приведены в таблице 2.

НКТС продуктов взаимодействия сополимеров с гирудином или гепарином определяют как точку помутнения 0,3%-ного водного раствора при нагревании раствора со скоростью 1 град./мин.

Для определения антикоагулянтной активности гирудина в составе полученного продукта к 10 мл плазмы крови человека добавляют 0,005 мг продукта, содержащего 0,0005 мг иммобилизованного гирудина, и 0,1 мг тромбина. Измеряют время образования сгустка, которое составляет 36 минут. В контрольном эксперименте время образования сгустка в присутствии 0,0005 мг исходного гирудина равно 50 минут. Таким образом, активность гирудина в составе полученного продукта составляет 72% от активности исходного гирудина.

Время образования сгустка при взаимодействии 10 мл плазмы крови человека с 0,1 мг тромбина в отсутствии исходного и иммобилизованного гирудина равно 52 секундам.

Для определения антикоагулянтной активности гепарина в составе полученного продукта в 10 мл плазмы крови человека растворяют 0,005 мг продукта, содержащего 0,0005 мг иммобилизованного гепарина, и 0,02 мг тромбина. Время образования сгустка равно 27 минутам. Время образования сгустка при использовании 0,0005 мг исходного гепарина равно 32 минутам. Таким образом, активность гепарина в составе полученного продукта составляет 84%.

Для изучения возможности термоактивируемого направленного транспорта полученных продуктов было использовано устройство, изображенное на чертеже. Через отдельно термостатированные сосуды А и Б с помощью насоса прокачивают 100 мл плазмы крови человека. К плазме добавляют 0,005 мг исходного гирудина или продукт взаимодействия гирудина с сополимером, полученный по примеру 16 и содержащий 0,005 мг иммобилизованного гирудина, и 1 мг тромбина. Измеряют время образования сгустка в зависимости от температуры в сосудах и в зависимости от природы добавленного антикоагулянта. Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 2
№ примера	Количество сополимера, г	Физиологически активное вещество и его количество, г	НКТС, °С	Активность физиологически активного вещества, % от исх.
13	0,1	Гирудин, 0,01	31	72
14	0,1	Гепарин, 0,02	33	84
15	0,1	Гепарин, 0,02	37	61
16	0,1	Гирудин, 0,02	42	50
17	0,1	Гепарин, 0,01	26	58
18	0,1	Гирудин, 0,01	29	54
19	0,1	Гирудин, 0,01	34	59
20	0,1	Гепарин, 0,03	42	63
21	0,1	Гепарин, 0,02	28	62
22	0,1	Гирудин, 0,02	29	53
23	0,1	Гепарин, 0,03	35	56
24	0,1	Гепарин, 0,03	40	51

Таблица 3
Добавленные к плазме вещества и порядок их добавления	Время образования сгустка в сосудах. В скобках температура сосуда.
	А	Б
Гирудин и затем тромбин	45 мин (37°С)	45 мин (37°С)
Гирудин и затем тромбин	49 мин (43°С)	49 мин (37°С)
Гирудин в составе продукта и затем тромбин	33 мин (37°С)	33 мин (37°С)
Гирудин в составе продукта и затем тромбин	41 мин (43°С)	4 мин (37°С)

Видно, что при использовании исходного антикоагулянта время образования сгустка фибрина в обоих сосудах одинаково, независимо от их температуры. При использовании антикоагулянта в составе полученного продукта время образования сгустка зависит от температуры сосуда. При 37°С (ниже НКТС) время образования сгустка в обоих сосудах одинаково. Если температуру в сосуде А поднять до 43°С, то есть выше НКТС, которая для используемого продукта НКТС равно 42°С, то время образования сгустка в этом сосуде равно 41 минуте, в то время как в сосуде Б сгусток образуется за 4 минуты. Это означает, что практически весь продукт и химически связанный с ним антикоагулянт собирается в сосуде А. Таким образом, осуществляется направленный транспорт антикоагулянта в область с повышенной температурой.

В отличие от известного способа получения иммобилизованных антикоагулянтов [И.Л.Валуев, А.В.Пан, М.А.Розенфельд, Л.И.Валуев, Н.А.Платэ. Полимерные системы с антитромбиновой активностью для термоактивируемого направленного транспорта. Прикладная биохимия и микробиология. Т.39. №3. С.359-362. 2003] использование тройного сополимера строго определенного состава обеспечивает получение препарата, в котором антикоагулянтная активность сохраняется на уровне 50% и выше (в известном способе эта величина равна 6%). В отличие от способа-прототипа предлагаемый способ обеспечивает получение способного к термонаправленному транспорту антикоагулянта крови на полимерном носителе с молекулярной массой не выше 18000. В способе-прототипе эта величина превосходит 150000, что делает невозможным практическое применение полученных продуктов из-за их накапливания в организме.

Количественный состав используемого сополимера определяется растворимостью сополимера в воде (при содержании N-акрилоилгидроксифталимида выше 5% сополимер не растворим в воде), а также значениями НКТС в области 28-42°С (при содержании акриламида выше 7% сополимеры не имеют НКТС, то есть непригодны для направленного транспорта).