способ видовой микробиологической диагностики условно-патогенных энтеробактерий

Формула изобретения

Способ видовой микробиологической диагностики условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных с гнойно-септической патологией и из внешней среды путем изучения их биологических признаков, определяющих принадлежность к семейству с использованием питательных сред и режима культивирования, отличающийся тем, что после определения принадлежности к семейству у возбудителей изучают биологические признаки: способность к образованию сероводорода, индола, цитрата, наличие фенилаланиндезаминазы, желатиназы, уреазы, утилизацию лизина, сорбита, орнитина и аргинина, характер реакции с метиловым красным, наличие пигмента и подвижности, и при наличии или отсутствии признаков представителя энтеробактерий включают в одну из групп: энтеробактерии, образующие сероводород; энтеробактерии, не образующие сероводород и обладающие фенилаланиндезаминазой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу и обладающие желатиназой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу, обладающие уреазой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу, уреазу и образующие цитрат; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, положительные в реакции с метиловым красным; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, отрицательные в реакции с метиловым красным, дальнейшую идентификацию проводят по оставшимся неучтенным признакам внутри каждой группы с определением видовой принадлежности возбудителя.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и эпидемиологии, и может быть использовано при бактериологической диагностике и эпидемиологическом анализе внебольничных и нозокомиальных кишечных и гнойно-септических инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями.

На современном этапе роль условно-патогенных энтеробактерий, включающих 27 родов представителей семейства Enterobacteriaceae, возрастает не только как возбудителей острых кишечных заболеваний, но как ведущего фактора при гнойно-септических инфекциях, внутрибольничных вспышках, в большей степени в учреждениях родовспоможения (Л.П.Зуева, Р.Х. Яфаев. Эпидемиология: Учебник. - СПБ: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2005. - С.562-640).

Известен способ родового и видового типирования условно-патогенных энтеробактерий, включающий трехэтапную схему исследований, где на первом этапе определяют продукцию сероводорода, уреазу, способность к разложению лактозы и глюкозы, на втором - наличие капсулы, пигмента, феномена роения, фенилаланиндезаминазы, характер роста на трехсахарном агаре, утилизацию 10% лактозы, глюкозы, образование индола, цитрата, подвижность, на третьем - разложение глютаминовой кислоты, арабинозы, сорбита, муката, маннита, мальтозы и наличие орнитиндекарбоксилазы (Методические рекомендации «Значение условно-патогеных энтеробактерий в патологии и системы их идентификации». - Казань, 1991. - 21 с.). При этом используют 22 дифференциально-диагностических теста.

Недостатком данного метода является отсутствие возможности дифференцировать некоторые роды и многие виды условно-патогенных энтеробактерий (Klebsiella sp, Enterobacter sp, Serratia sp, Proteus sp), а также значительное время на производство анализа (6-7 суток), связанное с большим количеством этапов исследования.

Близким аналогом является метод определения условно-патогенных энтеробактерий, описанный в руководстве «Bergey,s Manual of Sustematic Bacreiology» (John G., Holt, Noel R. Krieg, Peter H.A. Sneath, James T Stanley T. Williams Bergeys Manual of determinative bacterioloji Ninth Edition - Baltimor-Philadelphia-Hon Kong-London et al. - 1997. - V.1. - P.211-229) по микробиологической диагностике возбудителей, выделенных от больных с гнойно-септической патологией, и из внешней среды путем изучения их биологических признаков. Родовую и видовую идентификацию микро-организмов данным способом осуществляют после определения их семейственной принадлежности по 44 биологическим тестам, изучая тинкто-риальные, культуральные и биохимические свойства.

Его недостатком является большое количество идентифицирующих признаков, необходимых при исследовании.

Техническим результатом изобретения является повышение степени достоверности родовой и видовой дифференциальной диагностики условно-патогенных энтеробактерий и сокращение сроков диагностики.

Определение 13 ведущих (из более чем 40) биологических признаков условно-патогенных энтеробактерий (способность к образованию сероводорода, индола, цитрата, наличие фенилаланиндезаминазы, желатиназы, уреазы, утилизация лизина, сорбита, орнитина и аргинина, характер реакции с метиловым красным, наличие пигмента и подвижности) позволяет гарантировать достоверность и сокращение сроков диагностики.

Сущность изобретения заключается в следующем. Путем определения ведущих биологических свойств (способность к продукции сероводорода и индола, наличие фенилаланиндезаминазы, желатиназы, уреазы, образование цитрата, характер реакции с метиловым красным, наличие подвижности и пигмента, разложение сорбита, аргинина, лизина, орнитина) условно-патогенные энтеробактерии формируют в группы. Они представлены на чертеже и включают: энтеробактерии, образующие сероводород; энтеробактерии, не образующие сероводород и обладающие фенилаланиндезаминазой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу и обладающие желатиназой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу и уреазу; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу и образующие цитрат; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, положительные в реакции с метиловым красным; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, отрицательные в реакции с метиловым красным. Дальнейшую видовую идентификацию проводят по оставшимся неучтенным признакам уже внутри каждой группы.

Способ осуществляется следующим образом.

У культуры-колонии микроорганизма, выросшей на среде первичного посева (обычно это 5% кровяной агар, агар Эндо, Плоскирева, Левина и др.) вместе с определением признаков семейства (при микроскопии грамотрицательные палочки, положительный тест с каталазой, окисление и ферментация глюкозы на среде Хью-Лейфсона) изучают особенности роста на комбинированном трехсахарном агаре Олькеницкого после инкубации в стандартном режиме. Питательный агар Олькеницкого одновременно служит средой накопления и средой по определению продукции сероводорода, что позволит ориентироваться в дальнейшем ходе исследований. В набор дифференцирующих тестов входят: определение фенилаланиндезаминазы, желатиназы, образование кислоты из сорбита, реакция с метиловым красным на среде Кларка, образование индола, определение подвижности, утилизация цитрата натрия на агаре Симонса, разложение лизина, орнитина, аргинина, уреазы, наличие и характер пигмента. Оценку проводят после 18-20 часовой инкубации при температуре 35-37°С. Наличие или отсутствие признаков включают представителя энтеробактерий в одну из групп: энтеробактерии, образующие сероводород; энтеробактерии, не образующие сероводород и обладающие фенилаланиндезаминазой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу и обладающие желатиназой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу, обладающие уреазой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу и образующие цитрат; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, положительные в реакции с метиловым красным; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, отрицательные в реакции с метиловым красным. Дальнейшую идентификацию проводят по оставшимся неучтенным признакам внутри каждой группы с помощью дифференцирующих таблиц (1-9).

Таблица 1

Энтеробактерии, образующие сероводород

Вид

Дифференцирующие биохимические тесты

фенил.

желат.

сорб.

метил. крас.

инд.

подв.

Сим.

лиз.

орн.

арг.

уреаз.

Пигм.

Proteus mirabilis

+

+

-

+

-

+

D

-

+

-

+

Proteus vulgaris

+

+

-

+

+

+

-

-

-

-

+

Proteus renneri

+

D

-

+

+

-

-

-

-

+

Erwinia chrysanthemi

-

+

+

-

+

+

...

...

...

...

-

Erwinia ananas

-

+

+

-

...

...

...

...

...

...

...

Желт.

Erwinia caratovora

-

+

+

-

...

...

...

...

...

...

...

Serratia entomophila

-

+

-

(-)

...

...

...

...

...

...

..

Erwinia nigrifluens

-

-

+

-

-

+

...

...

...

...

+

Erwinia * quercina rhapontici psidii salicis tracheiphila

-

-

+

-

-

+

...

...

...

...

-

Erwinia rubrifaciens

-

-

+

+

-

+

...

...

...

...

-

Citrobacter freundii

-

-

+

+

-

+

+

-

(-)

D

D

Edwardsiella tarda

-

-

-

+

+

+

-

+

+

-

-

Pragia fontium

-

-

-

+

-

+

(+)

-

-

-

-

Leminorella richardii

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Примечание:

«+» - положительный признак

«-» - отрицательный признак

«D» - вариабельный признак (10-20% положительных находок)

«...» - не определен

**внутривидовая идентификация Erwinia quercina, E. Rhapontici, E. Psidii, E. Salicis, E. Tracheiphila проводится по дополнительным биохимическим тестам и не входит в представленный набор дифференцирующих признаков ввиду чрезвычайно редкой встречаемости данного рода энтеробактерий в гнойно-септической патологии у человека, т.к. их представители в основном обитают у растений.

Таблица 2
Энтеробактерии, не образующие сероводород, обладающие фенилаланиндезаминазой
Вид	Дифференцирующие биохимические тесты
	Орнит.	Сорб.	Инд	Метил красн.	Цитрат Симм.	Подв.	Уреаза	Лизин	Арг.	Желат.	Пигм.
Morganella morganii	+	-	+	+	-	+	+	-	-	-
Rhanella aquatilis	-	+	-	+	+	-	-	-	-	-
Providensia rettgeri	-	-	+	+	+	+	+	-	-	-
Providensia alcalifaciens	-	-	+	+	+	+	-	-	-	-
Providensia rustigianii	-	-	+	+	-	D	D	-	-	-
Providensia heimbachae	-	-	-	+	-	D	-	-	-	-
Tatumella ptyseos	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Pantoea agglomerans	D	-	-	D	+	+	-	-	-	-	Желтый

Таблица 3
Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, обладающие желатиназой
Вид	Дифференцирующие биохимические тесты
	аргин.	орнит.	сорбит	цитрат Симон.	индол	подв.	метил. красн.	уреаза	лизин	пигмент
Enterobacter nimipressuralis	+	+	+	+	-	+	-	-	-
Serratia grimesii	+	+	+	+	-	+	+	-	+
Serratia liquefaciens	-	+	+	+	-	+	+	-	+
Serratia marcescens	-	+	+	+	-	+	-	-	4-	Красн.
Serratia odorifera (б.1)	-	+	+	+	D	+	+	-	+
Serratia proteamaculans	-	+	+	+	-	+	D	-	4-
Serratia odorifera (б.2)	-	-	+	+	D	+	+	-	+
Erwinia ananas	-	-	+	...	+	+	...	-	-	Желт.
Erwinia uredevora	-	-	+	...	+	+	...	-	-	Желт.
Serratia ficaria	-	-	+	+	-	+	D	-	-
Serratia rubideae	-	-	-	+	-	+	-	-	D	Красн.
Xenorabdus luminescens	-	-	-	D	D	+	-	-	-	Желт.
Xenorabdus nematophilus	-	-	-	-	D	+	-	-	-	Желт.
Erwinia amylovora	...	...	D	...	-	+	...	-
Arsenophonus nasoniae	...	...	...	...	-	-	-	...	...	Корич.

Таблица 4
Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу и желатиназу, уреазоположительные
Вид	Дифференцирующие биохимические тесты
	лизин	сорбит	подвиж.	метил. красн.	цитрат Симонса	индол	аргинин	орнитин	пигмент
Enterobacter gergoviae	+	+	+	-	+	-	-	+
Klebsiella oxytoca	+	+	-	-	+	+	-	-
Klebsiella planticola	+	-t-	-	+	+	-	-	-
Klebsiella pneumoniae	+	+	-	-	+	-	-	-
Serratia fonticola	+	+	+	+	+	-	-	+
Budvicia aquatica	-	-	D	+	-	-	-	-
Enterobacter hormaechei	-	-	+	D	+	-	+	+
Leclercia(Escherichia) adecarboxylata	-	-	+	+	-	+	-	-	Желт.
Xenorabdus luminescens	-	-	+	-	D	D	-	-	Желт.
Enterobacter cloacae	-	+	+	-	+	-	+	+
Enterobacter dissolvens	-	+	+	-	+	-	-	+
Citrobacter freundii	-	+	+	+	+	-	D	-
Citrobacter diversus	-	+	+	+	+	+	D	+
Citrobacter amalonaticus	-	+	+	+	+	+	+	+
Enterobacter asburiae	-	+	-	+	+	-	-	-

Таблица 5
Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу и уреазу, образующие цитрат, орнитинотрицательные
Вид	Дифференцирующие биохимические тесты
	подвиж.	сорбит	метиловый красный	индол	лизин	аргинин	пигмент
Citrobacter freundii	+	+	+	-	-	D
Cedecea neteri	+	+	+	-	-	+
Erwinia persicinus	+	+	-	-	-	-	Красн.
Enterobacter amnigenus(61)	+	-	-	-	-	-
Pantoae agglomerans	+	-	D	-	-	-	Желт.
Pantoae dispersa	+	-	D	-	-	-	Желт.
Ervinia cacticida	+	-	-	-	-	...
Ervinia mallotivora	+	-	-	-	...	...
Buttauxella agrestis	+	-	+	-	-	-
Xenorhabdus luminescens	+	-	-	D	-	-	Желт.
Klebsiella terrigena	-	+	D	-	+	-
Ervinia stewartii	-	+	+	-	-	-	Желт.
Klebsiella ozaenae	-	D	+	-	D	-
Ewingella americana	D	-	+	-	-	-
Serratia plymuthica	D	D	+	-	-	-	Красн.
Cedecea lapagei	+	-	...	-	-	+

Таблица 6
Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу и уреазу, орнитинположительные
Вид	Дифференцирующие биохимические тесты
	подвиж.	лизин	сорбит	индол	метиловый красный	аргинин	пигмент
Enterobacter asburiae	-	-	+	-	+	-
Klebsiella terrigena	-	+	+	-	D	-
Escherichia blattae	-	+	-	-	+	-
Klebsiella mobilis	+	+	+	-	-	-
Serratia fonticola	+	+	+	-	+	-
Kluyvera ascorbata	+	+	D	+	+	-
Escherichia fergusonii	+	+	-	+	+	-
Yokenella regensburgei	+	+	-	-	+	-
Enterobacter amnigenus (6.2)	+	-	+	-	D	D
Enterobacter cloacae	+	-	+	-	-	+
Enterobacter intermedius	+	-	+	-	+	-
Citrobacter freundtt	+	-	+	-	+	D
Citrobacter amalonaticus	+	-	+	+	+	+
Citrobacter diversus	+	-	+	+	+	D
Enterobacter sakazakii	+	-	-	-	-	+	Желт.
Enterobacter taylorae	+	-	-	-	-	+
Enterobacter hormaechei	+	-	-	-	D	+
Enterobacter amnigenus (6.1)	+	-	-	-	-	-
Cedecea divisae	+	-	-	-	+	D
Pantoae agglomerans	+	-	-	-	D	-	Желт.
Kluyvera cryocrescens	+	-	D	+	+	-
Erwinia mallotivora	+		-	-	...	...

Таблица 7
Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу и уреазу, не образующие цитрат, положительные в реакции с метиловым красным, лизинположительные
Вид	Дифференцирующие биохимические тесты
	подвижность	индол	сорбит	орнитин	аргинин	пигмент
Klebsiella terrigena	-	-	+	-	-
Escherichia blattae	-	-	-	+	-
Escherichia coli (неак.)	-	+	+	-	-
Escherichia coli	+	+	+	D	-
Escherichia fergusonii	+	+	-	+	-
Edwardsiella tarda (б.1)	+	+	-	+	-
Kluyvera cryocrescens	+	+	D	+	-
Edwardsiella hoshinae	+	-	-	+	-
Escherichia vulneris	+	-	-	-	D	Желт.
Erwinia mallotivora	+	-	-	...	...
Hafnia alvei	+	-	-	+	-

Таблица 8
Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу и уреазу, не образующие цитрат, положительные в реакции с метиловым красным, лизинотрицательные
Вид	Дифференцирующие биохимические тесты
	подвижность	индол	сорбит	орнитин	аргинин	пигмент
Citrobacter amalonaticus	+	+	-	+	+
Escherichia hermannii	+	+	-	+	-	Желт.
Kluyvera cryocrescens	+	+	D	+	-	Желт.
Escherichia vulneris	+	-	-	-	D
Erwinia mallotivora	+	-	-	...	...
Enterobacter intermedius	+	-	+	+	-
Erwinia stewartii	-	-	+	-	-	Желт.
Klebsiella rhinoscleromatis	-	-	+	-	-
Escherichia coli (неактивная.)	-	+	+	-	-
Moellerella wisconsensis	-	-	-	-	-
Leclercia adecarboxylata	+	+	-	-	-	Желт.
Budvicia aqvatica	D	-	-	-	-
Serratia plymuthica	D	-	D	-	-	Красн.

Таблица 9
Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу и уреазу, не образующие цитрат, отрицательные в реакции с метиловым красным
Вид	Дифференцирующие биохимические тесты
	лизин	сорбит	подвижность	орнитин	агринин	индол	пигмент
Klebsiella terrigena	+	+	-	+	-	-
Obesumbacterium proteus	+	-	-	+	-	-
Hafhia alvei	+	-	+	+	-	-
Edwardsiella ictaluri	+	-	-	D	-	-
Xenorabdus luminescens	-	-	+	-	-	D	Желт.
Xenorabdus nematophilus	-	-	+	-	-	D	Желт.
Erwinia stewartii	-	+	-	-	-	-	Желт.
Erwinia mallotivora	...	-	+	...	...	-

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

При посеве крови у больного Р. (ист. бол. №455) с деструктивной госпитальной пневмонией через 48 часов инкубации на поверхности агара из комбинированной двойной среды выросли колонии микроорганизмов и произошло помутнение бульона. После пересева культуры на чашку кровяного агара и 18-часовой инкубации в режиме 37°С обнаружили образование крупных серых слизистых колоний с зоной гемолиза диаметром 4 мм, склонных к сливному росту. При микроскопии - грамотрицательные палочки, окруженные капсулой. Проба с каталазой отрицательная. После пересева культуры на среду Олькеницкого произошло окисление глюкозы с образованием большого количества газа. Лактоза не разложилась, образование сероводорода не произошло. На среде Хью-Лейфсона - полное окисление и ферментация глюкозы. После постановки дифференцирующих тестов через 18 часов инкубации: отрицательный тест с фенилаланином, желатиной, положительный - с мочевиной. Культура неподвижная. Произошло разложение лизина, сорбита, цитрата с изменением цвета среды. Тесты на образование индола, проба с метиловым красным, аргинином и орнитином были отрицательными.

Таким образом, у больного Р. с деструктивной пневмонией из крови был выделен возбудитель из семейства энтеробактерий, не образующий сероводород, не обладающий фенилаланиндезаминазой и желатиназой, уреазоположительный, разлагающий лизин, сорбит и цитрат натрия, неподвижный, не образующий индол, не утилизирующий аргинин и орнитин, что позволяет его отнести к роду Klebsiella, виду К.pneumoniae (sub. pneumoniae)

Пример 2.

У больного М. (ист. бол. №569) с перитонитом после посева содержимого дренажной трубки из брюшной полости через 20 часов инкубации на поверхности агара Эндо обнаружен «вуалеобразный» рост микроорганизмов с гнилостным запахом, затянувший всю чашку с питательным агаром. При пересеве колоний на среду Олькеницкого прозошло образование сероводорода без разложения глюкозы и лактозы. Положительный O/F тест (на среде Хью-Лейфсона). Из дифференцирующих признаков: положительные тесты с фенилаланином, желатиной, метиловым красным, орнитином и мочевиной. Отрицательные - с сорбитом, индолом, цитратом, лизином, аргинином.

Таким образом, у больного М. с клиническим диагнозом «перитонит» из содержимого дренажа брюшной полости был выделен высокоподвижный представитель семейства энтеробактерий, образующий сероводород, имеющий фенилаланиндезаминазу, желатиназу, уреазу, орнитиндекарбоксилазу, положительный в реакции с метиловым красным, не утилизирующий аргинин, лизин и цитрат натрия, что позволило его отнести к роду Proteus, виду Р.mirabilis.

Используемый метод видовой дифференциальной диагностики энтеробактерий, указанный в заявке, проверен на штаммах Escherichia coli АТСС 29212, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, других контрольных штаммах НИИ им. Тарасевича и более чем на 800 культурах энтеробактерий, выделенных из клинического материала от больных с кишечными, гнойно-септическими инфекциями и с объектов внешней среды стационаров лечебно-профилактических учреждений.

Предложенный способ видовой дифференциальной диагностики условно-патогенных энтеробактерий информативен, так как позволяет отнести микроорганизм к одному из 27 родов и 85 видов семейства. Он достоверен, укорачивает сроки проведения анализа (2-3 дня вместо 4-5 дней при использовании прототипа), так как предполагает одновременную постановку и оценку всех идентифицирующих признаков. Относится к классическим бактериологическим методам исследования, не требует при постановке и идентификации дорогостоящего оборудования, удобен в работе, несложен в методическом плане. Поэтому без значительных материальных затрат и в короткие сроки может быть внедрен в работу любой бактериологической лаборатории.