способ получения дофа и дофамина из культур корневых волосков beta vulgaris

Формула изобретения

1. Способ получения ДОФА и дофамина из культуры корневых волосков Beta vulgaris, включающий стадии:

а) культивирования корневых волосков В.vulgaris с использованием предварительно стерилизованной питательной среды;

б) инокуляции корневых волосков в диапазоне 0,1-0,5 г влажного веса/40 мл культуральной среды, инкубации в течение периода в диапазоне 2-24 дня, при необходимости добавления тирозина в диапазоне 1-5 мг/40 мл культуральной среды;

в) выбора экспоненциальной фазы роста культуры корневых волосков;

г) экстракции ДОФА и дофамина из корневых волосков растворителем.

2. Способ по п.1, в котором на стадии (а) используют питательную среду, включающую среду Мурашиге-Скуга с 2-4% (мас./об.) сахарозой в качестве основного источника углерода.

3. Способ по п.1, в котором на стадии (а) стерилизацию проводят в течение 10-30 мин при температуре в интервале 110-130°С.

4. Способ по п.1, в котором на стадии (б) тирозин добавляют в культуральную среду в возрасте 3-7 дней.

5. Способ по п.1, в котором на стадии (г) растворитель, используемый для экстракции, выбирают из группы, включающей муравьиную кислоту, HCl и горячий этанол.

6. Способ по п.5, в котором на стадии (г) растворитель, используемый для экстракции, представляет собой муравьиную кислоту в диапазоне 1-4% (об./об.), HCl (0,1N) и горячий этанол (80%).

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения ДОФА и дофамина из культур корневых волосков Beta vulgaris.

Уровень техники

L-ДОФА (диокси-L-фенилаланин) и дофамин являются предшественниками нейротрансмиттеров, используемых для облегчения симптомов болезни Паркинсона (Pras, N et al 1989, Biotechnology and Bioengineering 34, 214-22). Высокая цена, спрос и высокая доза препаратов привела к появлению альтернативных и недорогих методов их производства. L-ДОФА продуцируется, главным образом, как вторичный метаболит в культурах растительных клеток Mucuna pruriens (Pras, N et al 1989) и каллуса, а также в трансформированных корневых культурах Stizolobium hassjoo (Sung and Huang 2000. Biothech Prog, 16, 1135-1140). L-ДОФА продуцируется также различными бактериями, а именно Escherichia coli и Erwinia herbicola (Foor et al 1993, Appl. Environ. Microbiol, 59: 3070-3075) и Pseudomonas melanogenum (Tanaka et al 1974, Agri Biol Chem, 38 (3) 633-639).

Можно сделать ссылку на работу Wisher et al (1993) (РСТОС 33, 259-264), в которой ДОФА и дофамин были обнаружены в органах растений, таких как листья, а также в культурах клеток Mucuna pruriens. Они также сообщили, что добавление к клеточным суспензиям 2,4-D увеличивает содержание дофамина, а добавление NaCl в концентрации 0,5 М помогает высвобождению L-ДОФА в среду.

Сообщалось также о различных процессах биотрансформации для продукции L-ДОФА, а именно: биопревращении тирозина в L-ДОФА иммобилизованными клетками Mucuna pruriens (Wicher et al 1983, Planta 158: 482-486), а также иммобилизованными клетками Papaver somniferum (Stano et al, 1995, Phytochemistry, 38 (4) 859-860).

Известно, что культуры корневых волосков Beta vulgaris продуцируют беталаины, которые являются природными красными пигментами. Они окрашены благодаря наличию конъюгированных двойных связей. Наличие беталаинов среди высших растений ограничено порядком центросеменных. Однако сообщалось также о присутствии их в грибе Amanita muscaria. Интересно, что у микроорганизмов и у животных беталаины неизвестны (Bohm and Rink 1988). Беталаины, желтые бетаксантины и красно-фиолетовые бетацианины являются группой водорастворимых пигментов. Бетаксантины являются конъюгатами беталамовой кислоты с аминокислотами и соответствующими аминами (включая дофамин), а бетацианины являются производными бетанидина - конъюгата беталамовой кислоты с цикло-ДОФА. Тирозиназа и ДОФА-диоксигеназа - это основные ферменты, отвечающие за биосинтез основного скелета беталаминов (Mueller et al 1996, Steiner et al, 1996, 1999, Girod and Zryd 1991, Mueller et al 1997). Тирозиназа отвечает за образование ДОФА и ее окисление до цикло-ДОФА, ДОФА-диоксигеназа катализирует расщепление ДОФА-экстрадиола, что приводит к образованию беталамовой кислоты. Высказано предположение, что ключевая стадия - соединение беталамовой кислоты и ДОФА - является неферментативным процессом (Trezzini and Zyrd 1990, Terradas and Wyler 1991). Kobayashi et al (2001) сообщили о формировании бетацианинов из дофамина в клетке и культурах корневых волосков Beta vulgaris.

Можно сослаться на Steiner et al (Planta 1999, 208: 114-124), которые, используя культуры каллуса Portulaca grandiflora, продуцирующие бетацианины, нашли, что тирозиназа участвует в биосинтезе беталаина у высших растений. Они сообщили также, что беталаины образуются под действием тирозиназы в корневых волосках и каллусе Beta vulgaris. Schliemann et al 1998 (Phytochemistry 49 (6) 1593-1598) сообщили об образовании беталаина из ДОФА в опытной модельной системе. В их экспериментах ДОФА инкубировали с ДОФА-диоксигеназой из Amanita muscaria, что приводило к образованию 4,5-секо-ДОФА, которая спонтанно рециклизовалась в беталамовую кислоту.

Во всех сообщениях, цитированных выше, было сказано, что в биосинтетическом пути беталаинов ДОФА является предшественником беталаинов, но до сих пор нет сообщений о накоплении/продуцировании ДОФА и дофамина в культурах корневых волосков Beta vulgaris.

Цели изобретения

Основная цель настоящего изобретения - разработать способ экстракции и получения ДОФА и дофамина из корневых волосков Beta vulgaris.

Другая цель изобретения - создать технологию, обеспечивающую прирост продукции ДОФА и дофамина в корневых волосках Beta vulgaris.

Раскрытие изобретения

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ получения ДОФА и дофамина из корневых волосков Beta vulgaris, где корневые волоски были получены после инфекции экспланта изолятом дикого штамма Agrobacterium rizogenes и поддерживались путем субкультивирования на среде MS (Murashige-Skoog 1962, Physiol plant 15, 473-479) без фитогормонов и с добавлением 3% сахарозы. рН среды был доведен до 5,8 до автоклавирования, и колбы культивировались в темноте на шейкере при 90 оборотах в мин в течение 24 дней. Волоски на различных стадиях роста экстрагировали 2% муравьиной кислотой, 0,1 N HCl и 80% горячим этанолом в ступке с пестиком с использованием стеклянной пудры, фильтровали, экстракт концентрировали под вакуумом, а концентрат фильтровали через мембранный фильтр (0,22 м), после чего подвергали ВЖХ-анализу. Содержание ДОФА и дофамина было определено путем сравнения площадей пиков с аутентичными стандартами (Sigma, StLouis USA). Были проведены эксперименты для того, чтобы узнать, на какой стадии культуры ДОФА и дофамин аккумулировались до максимального уровня, которые включали добавление тирозина в экспоненциальной фазе культуры. Было найдено, что культуры корневых волосков в начальных стадиях аккумулировали больше ДОФА (6-дневная культура), а аккумуляция дофамина была максимальной на 15 день. Когда к культуре был добавлен тирозин (Hi media labs, Mumbai, India) в количестве 3 мг/40 мл культуральной среды, содержание ДОФА было максимальным, а именно 46 мкг/г сухого веса на 15-й день, а содержание дофамина также увеличилось до 1,972 мг/г сухого веса на 20-й день жизни культуры.

Осуществление изобретения

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ получения ДОФА и дофамина из культуры корневых волосков В.vulgaris, включающий стадии:

а) культивирования корневых волосков В.vulgaris с использованием питательной среды, стерилизованной в автоклаве;

б) инокуляции корневых волосков в диапазоне 0,1-0,5 г влажного веса/40 мл культуральной среды и выращивания в течение 2-24 дней для получения максимального роста и метаболитов;

в) выбора правильной стадии развития культуры корневых волосков В.vulgaris для получения максимальной продукции ДОФА и дофамина на основе биосинтетического пути беталаинов;

г) экстракции корневых волосков растворителем для получения ДОФА и дофамина.

В одном воплощении изобретения использовалась питательная среда, содержащая MS среду с 2-4% сахарозой в качестве основного источника углерода.

Другое воплощение изобретения обеспечивает способ, в котором стадия стерилизации проводится в течение 10-30 минут при температуре 110-130°С.

В еще одном воплощении изобретения на стадии (г) корневые волоски экстрагируют с использованием муравьиной кислоты в диапазоне 1-4% об., 0,1 N HCl и 80% горячего этанола.

В еще одном воплощении экстракт центрифугируют, фильтруют и концентрируют под вакуумом.

В еще одном воплощении изобретения добавление муравьиной кислоты в диапазоне концентраций 1-4% об. при экстракции увеличивает продукцию ДОФА и дофамина.

В еще одном воплощении дополнительное добавление тирозина к культуре в возрасте 3-7 дней в диапазоне концентрации 1-5 мг/40 мл культуральной среды приводит к увеличению выхода ДОФА и дофамина.

В еще одном воплощении корневые волоски Beta vulgaris культивируют асептически в питательной жидкой среде и экстрагируют 1-5% муравьиной кислотой в экспоненциальной фазе роста.

В еще одном воплощении на стадии (в) экспоненциальная фаза роста с максимальной аккумуляцией ДОФА в культуре находится в диапазоне 5-8 дней.

В еще одном воплощении на стадии (в) экспоненциальная фаза роста с максимальной аккумуляцией дофамина в культуре находится в диапазоне 12-16 дней.

В одном воплощении настоящего изобретения корневые волоски корней красной свеклы были получены с использованием дикого штамма Agrobacterium rhizogenes.

В еще одном воплощении настоящего изобретения они культивировались на базальной среде Murashige and Skoog в колбах Эрленмейера объемом 150 мл.

В еще одном воплощении настоящего изобретения корневые волоски Beta vulgaris экстрагировали на различных стадиях роста 2% об. муравьиной кислотой, 0,1 N HCl и 80% горячим этанолом.

В еще одном воплощении настоящего изобретения экстракты центрифугировали, фильтровали через фильтровальную бумагу Ватман №1 и концентрировали под вакуумом, растворяли в соответствующем растворителе, таком как 2% об. муравьиная кислота в воде, 0,1 N HCl и 80% горячий этанол для ВЖХ-анализа.

В еще одном воплощении настоящего изобретения ВЖХ-анализ проводили с использованием системы Shimadzu LC-10A (корпорация Shimadzu, Япония), и хроматограф был оснащен колонкой 5 м Nucleosil C₁₈ (длина 250 мм, внутренний диаметр 4 мм. Waters, США) с использованием буфера Мс Ilvaline (0,1 М ацетат аммония/уксусная кислота, рН 4,7) при скорости подачи 1 мл/мин и с детекцией ультрафиолетовым детектором (280 нм) и флуоресцентным детектором (ксеноновая дуговая лампа; возбуждение при 280 нм, эмиссия при 314 нм).

В еще одном воплощении настоящего изобретения тирозин в концентрации 3 мг/40 мл был добавлен к культуре Beta vulgaris, которая находилась в экспоненциальной стадии роста, и было зарегистрировано влияние на накопление ДОФА и дофамина.

Для того чтобы проиллюстрировать настоящее изобретение, даны следующие примеры, и они не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.

Пример 1

Культуры корневых волосков Beta vulgaris были получены при инфекции экспланта диким штаммом Agrobacterium rhizogenes. 300 мг влажного веса корневых волосков Beta vulgaris (в возрасте 4 дня) были инокулированы в 40 мл питательной среды, содержащей соли Murashige and Skoog в Эрленмейеровских колбах объемом 150 мл. рН среды был доведен до 5,8 до автоклавирования, которое проводилось в течение 15 мин при 121°С при давлении 15 lb. Корневые волоски субкультивировали каждые 2 недели в свежей среде MS (Murashige and Skoog) с 3% сахарозой без добавления фитогормонов и выдерживали в темноте на вращающемся шейкере (90 об/мин). Максимальная биомасса была зарегистрирована на 20-й день роста культуры как 6,75 г влажного веса на 40 мл культуральной среды, которая затем уменьшалась, достигая минимума 5,2 г влажного веса/40 мл культуральной среды на 24-й день жизни культуры.

Пример 2

300 мг культур корневых волосков (свежий вес) из 4-дневных культур В.vulgaris были инокулированы в 40 мл питательной среды, содержащей соли Murashige and Skoog, в колбах Эрленмейера на 150 мл. С использованием 80% горячего этанола, 0,1N HCl и 2% муравьиной кислоты из корневых волосков были экстрагированы ДОФА и дофамин на 6, 12, 15, 20 и 24 день культурального периода в ступке с пестиком с использованием нейтрализованной стеклянной пудры. Экстракты центрифугировали, концентрировали и использовали для ВЖХ-анализа ДОФА и дофамина. Содержание беталаина в корневых волосках было измерено после экстракции корней подкисленной водой (аскорбиновая кислота-вода) и центрифугирования при 5000 g в течение 15 мин. Супернатант был собран и его оптическая плотность была определена при длине волны 480 и 540 нм для бетаксантинов и бетацианинов, соответственно.

Содержание ДОФА и дофамина было определено количественно ВЖХ-анализом образцов путем сравнения с аутентичными стандартами. Идентификация пиков была более очевидной при использовании флуоресцентного детектора.

Способность L-ДОФА и дофамина к экстракции из В.vulgaris с использованием различных растворителей показана в таблице 1.

Таблица 1 Способность L-ДОФА и дофамина экстрагироваться из культур корневых волосков Beta vulgaris с использованием различных растворителей
	80% этанол		0,1 N HCl		2% муравьиная кислота
Период времени (дни)	ДОФА (мкг/г сухого веса)	Дофамин (мг/г сухого веса)	ДОФА (мкг/г сухого веса)	Дофамин (мг/г сухого веса)	ДОФА (мкг/г сухого веса)	Дофамин (мг/г сухого веса)
6	17,2	0,217	20	0,375	*30	0,425
12	11	0,413	15,12	0,525	21,2	0,676
15	5	0,512	9	0,732	16	*0,975
20	н.о.	0,312	2,3	0,560	7,4	0,721
24	н.о.	0,191	н.о.	0,213	н.о.	0,312

Было доказано, что среди растворителей, использованных для экстракции ДОФА и дофамина, 2% муравьиная кислота лучше, чем 80% горячий этанол и 0,1N HCl. Продукция ДОФА была проанализирована с использованием 2% муравьиной кислоты в качестве экстрагирующего растворителя, было зарегистровано большее содержание на начальных стадиях культуры (экспоненциальная фаза), а именно на 6-й день времени жизни культуры. Содержание дофамина было больше на 15-й день времени жизни культуры, позднее наблюдалось его снижение. При экстракции 2% муравьиной кислотой уровень экстракции ДОФА был в 1,7 и 1,5 раз выше, чем таковые при экстракции 80% этанолом и 0,1N HCl, соответственно. Даже выход дофамина был выше, когда для экстракции использовалась 2% муравьиная кислота; он был выше в 1,9 и 1,4 раза, чем таковые при экстракции 80% этанолом и 0,1N HCl, соответственно. На основе этих результатов дальнейшая экстракция для получения ДОФА и дофамина проводилась 2% муравьиной кислотой во всех экспериментах с культурами корневых волосков В.vulgaris.

Пример 3

300 мг культур корневых волосков (влажный вес) 4-дневных культур В.vulgaris были инокулированы в 40 мл питательной среды, содержащей соли Murashige and Skoog в колбах Эрленмейера на 150 мл. До автоклавирования в течение 15 мин при 121°С и давлении 15 1b рН среды был доведен до 5,8. На 6-й день культурального периода был добавлен тирозин (растворен в нескольких каплях 0,1N NaOH, затем объем доведен дистиллированной водой) в концентрации 3 мг/40 мл культуральной среды. Корневые волоски экстрагировали 2% муравьиной кислотой в ступке с пестиком с использованием нейтрализованной стеклянной пудры. Экстракты центрифугировали, фильтровали с использованием фильтровальной бумаги Ватман №1, концентрировали и анализировали с помощью ВЖХ. Содержание ДОФА увеличилось от 32 мкг/г сухого веса (СВ) на 6-й день культуры до 46 мкг/г СВ на 15-й день, снизившись затем до 9 мкг/г СВ на 24-й день. Содержание L-ДОФА в этом случае было в 1,53 раза выше, чем в культурах без добавки тирозина. Содержание дофамина увеличилось с 0,412 мкг/г СВ на 6-й день до 1,972 мкг/г СВ на 20-й день и далее снижалось, достигая значения 0,762 мкг/г СВ на 24-й день. Содержание дофамина в этом случае (после добавки тирозина) было в 2,02 раза выше по сравнению с контрольным (без тирозина). Было также показано, что содержание беталаина увеличивается по сравнению с контролем. Максимальная аккумуляция беталаина была зарегистрирована на 20-й день жизни культуры (до 13,1 мг/г СВ с начального значения 3,1 мг/г СВ на 6-й день), а затем содержание беталаина вновь снижалось до 8 мг/г СВ на 24-й день. Таким образом, это исследование обеспечивает ценную информацию о правильном времени (времени культивирования) для сбора корневых волосков для лучшей аккумуляции L-ДОФА и дофамина и подходящем растворителе для экстракции. Результаты показаны в таблице 2.

Таблица 2 Содержание ДОФА и дофамина в культурах корневых волосков В.vulgaris при добавлении тирозина
Период времени (дни)	Влажный вес (г/40 мл объема культуры)	ДОФА (мкг/г СВ)	Дофамин (мг/г СВ)	Беталаин (мг/г СВ)
6	1,91	32	0,412	3,1
12	4,2	44	1,067	7,2
15	5,4	46	1,427	9
20	7,3	22	1,972	13,1
24	6,1	9	0,762	8

Основными преимуществами настоящего исследования являются:

1. Культура корневых волосков in vitro использована для получения ДОФА и дофамина.

2. Поскольку корневые волоски демонстрируют гормональную автотрофию, способ требует относительно более дешевой среды для фитохимической продукции.

3. Более быстрый рост и генетическая, а также биохимическая стабильность корневых волосков являются дополнительным преимуществом.

4. Идентификация правильной стадии культурального времени для максимальной аккумуляции ДОФА и дофамина облегчит переход этого процесса в коммерчески осуществимый.

5. Метаболиты ДОФА и дофамина могут быть легко экстрагированы с использованием 2% муравьиной кислоты, которая является слабой кислотой по сравнению с HCl и 80% горячим этанолом.

6. Использование предшественников типа тирозина, который легко доступен, для лучшей продукции ДОФА и дофамина было бы полезным.

7. Поскольку дофамин водорастворим, его прямое использование после экстракции в воде может быть дополнительным преимуществом.

8. Поскольку корневые волоски более поддаются выращиванию в больших масштабах в биореакторах, добавляют тирозин для максимальной аккумуляции этих фитохимических агентов в больших масштабах.