способ получения и препарат аналога рекомбинантного интерферона гамма человека

Формула изобретения

1. Способ получения аналога рекомбинантного интерферона гамма человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli MH-1/pIFD10, разрушение клеток ультразвуком, удаление клеточного дебриса и хроматографию на колонке с сорбентом, отличающийся тем, что для получения инокулята используют высокопродуктивные клоны, которые предварительно отбирают путем электрофоретического анализа в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях на относительное содержание в трансформированных клетках целевого белка, хроматографическую очистку продукта проводят на КМ-сефарозе сначала в линейном градиенте буферов 50 мM трис-HCl, рН 8,3-50 мM цитрат натрия, рН 6,5 с 0,5М NaCl, a затем в экспоненциальном градиенте 50 мM цитрат натрия, рН 6,5-50 мM трис-HCl, рН 8,3 с 1 М NaCl.

2. Препарат аналога рекомбинантного интерферона гамма человека, содержащий следующие компоненты в расчете на одну терапевтическую дозу объемом 1 мл:

аналог рекомбинантного интерферона гамма человека, полученный по п.1, 50 мкг/мл (50000 МЕ/мл);

низкомолекулярный полимерный наполнитель - стабилизатор 50000 мк/мл;

NaCl 8,78 мкг/мл;

КН ₂PO₄ 1,36 мкг/мл, (рН7,0±0,1).

3. Препарат аналога рекомбинантного интерферона гамма человека по п.2, отличающийся тем, что в качестве низкомолекулярного полимерного наполнителя-стабилизатора использован реополиглюкин или поливинилпирролидон (сухой).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, медицине. Предлагается способ получения препарата на основе высокоочищенного генно-инженерного аналога гамма-интерферона человека - дельтаферона с молекулярной массой 16,2 кДа, полученного микробиологическим синтезом с последующей хроматографической очисткой. Получаемый по предлагаемому способу аналог обладает присущими гамма-интерферону антипролиферативной и противовоспалительной активностями и содержит, по данным ПААГ-ДСН электрофореза, не менее 98% основного вещества в форме мономера. Препарат имеет в своем составе низкомолекулярный полимерный наполнитель-стабилизатор (реополиглюкин либо поливинилпирролидон) и солевую буферную систему с рН 7,0-7,1. Препарат обладает высокой активностью, стабильностью и может быть использован для профилактики и лечения онкологических заболеваний, новообразований и воспалительных процессов у людей.

Рекомбинантный человеческий гамма-интерферон (рчИФН- ) является белком с молекулярной массой около 17 кДа, обладающим значительным противоопухолевым, противовоспалительным и противовирусным действием, что делает его применение в медицине весьма перспективным.

Однако широкое применение препаратов рчИФН- в клинической практике ограничено рядом факторов, среди которых наиболее существенным является повышенная чувствительность данного белка к действию протеолитических ферментов как in vitro, так и in vivo [1-3]. Кроме того, при получении рчИФН- необходимо вводить в схемы очистки стадии денатурации и ренатурации белка, поскольку при микробном синтезе рчИФН- накапливается в виде нерастворимых агрегатов, т.н. «тельцах включения», что приводит к существенному снижению выхода целевого продукта, а также увеличению себестоимости препарата из-за значительных временных и материальных затрат.

Известны способы получения рчИФН- и его аналогов из бактериальной биомассы [4, 5, 6, 7]. Общими недостатками представленных способов стали использование высоких концентраций хаотропных агентов (мочевины и гуанидин-гидрохлорида) для экстрагирования и отмывки рчИФН- из нерастворимых агрегатов, а также низкий выход целевого белка - 1 мг на 1 г биомассы [6], использование дополнительных стадий сульфатного переосаждения рчИФН- [5] или введение дополнительной стадии гель-фильтрации [7].

Для того чтобы при получении белка избежать подобных проблем, был создан аналог рчИФН- - дельтаферон, который имеет делецию 10 аминокислотных остатков на C-конце молекулы и замену кластера KRKR на KGSA (см. Фиг.1) [8]. В результате данной модификации у молекулы аналога рчИФН- - дельтаферона - появился ряд отличительных признаков, таких как устойчивость к протеолизу и биосинтез в прокариотических клетках в растворимой форме [9]. Разработчиками описанного аналога были проведены сравнительные исследования биологических функций рчИФН- и дельтаферона. Сохранение у дельтаферона характерной для исходного рчИФН- антипролиферативной активности наблюдали на мононуклеарных клетках человека, где было показано, что белки в равной степени снижали пролиферацию клеток [10] (см. Фиг.2). На экспериментальной модели адъювантного артрита мышей, вызванного внутрикожным введением полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), было установлено, что дельтаферон по уровню противовоспалительной активности существенно не отличался от рчИФН- [10].

Способом-прототипом предлагаемого изобретения является патент RU 2105813 [11, прототип], в котором описан лабораторный способ получения дельтаферона методом ионообменной хроматографии на Mono S HR5/5 колонке (Amersham Pharmacia Biotech). Способ основан на использовании штамма Е. coli MH-1/pIFN D10 (депонирован в коллекции ВНИИГенетики под номером ВКПМ В-6663). При осуществлении данного способа 1 г биомассы продуцента суспендируют в 5 мл буферного раствора (0,01М трис-HCl рН 8,5) и обрабатывают ультразвуком (5 раз по 30 секунд при 0°С с минутными интервалами). Отделение клеточного дебриса осуществляют центрифугированием в течение 30 минут при 17000 об/мин и Т=4°С. Супернатант наносят на колонку Mono S HR5/5, уравновешенную тем же буфером, после чего сорбированные белки элюируют градиентом NaCl от 0 до 1 М, рН 8,5. Фракции, содержащие аналог рчИФН- , выявляют с помощью гель-электрофореза в полностью денатурирующих условиях. Содержащий аналог рчИФН- материал диализуют в течение ночи против 0,01 М ацетата аммония, рН 6,0. Затем диализованный белок наносят на колонку Mono S HR5/5, уравновешенную 0,01 М ацетатом аммония, рН 6,0, и элюируют линейным градиентом NaCl (от 0 до 1 М) в том же буфере. Обнаружение аналога рчИФН- во фракциях проводят, как описано выше. Содержащие целевой белок фракции объединяют и диализуют против 0,01 М ацетата аммония, рН 6,0, стерильно фильтруют и хранят до использования при 4°С.

По утверждению авторов, данный способ обеспечивает высокую чистоту белка (не менее 99%), но он предложен для переработки малых количеств биомассы продуцента (1 г биомассы) и не может быть применен для препаративных объемов. Используемая в способе-прототипе катионоообменная колонка Mono S HR5/5 применяется в аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и не рассчитана на препаративную нагрузку. Также в способе-прототипе не приводятся данные по выходу целевого белка и нет характеристик по наличию примесей ДНК, липополисахаридов (ЛПС) и белков штамма-продуцента в конечном препарате. В то время как присутствие этих клеточных компонентов в препаратах рекомбинантных белков для медицины крайне нежелательно и строго регламентируется [12] - ДНК не более 100 пг/мг белка, примесные белки - не более 200 нг/мг белка, ЛПС - не более 200 нг/мг белка.

Цель настоящего изобретения - получить высокоочищенный препарат аналога рчИФН- - дельтаферона, обладающего антипролиферативной и противовоспалительной активностями, и разработать препаративный способ его получения, который бы гарантировал высокий выход и высокую степень чистоты препарата, необходимую для его медицинского применения, а также его стабильность в процессе хранения.

Поставленная цель достигается увеличением количества синтезируемого целевого белка в клетках и наиболее полным его извлечением в совокупности с очисткой белка путем дезинтеграции клеток ультразвуком, отделением клеточного дебриса центрифугированием и 2-х последующих хроматографий клеточного экстракта на КМ-сефарозе - катионообменном сорбенте, с высокой линейной скоростью потока и подходящим для препаративных нагрузок при разных значениях рН.

Сущность способа заключается в следующем.

Биомассу клеток E. coli MH-1/pIFN D10, выращенную на среде М9 с добавлением казаминовых кислот, суспендируют в буфере для разрушения (50 мМ трис-HCl, 1 мМ CuCl ₂, 1 мМ ZnCl₂, рН 8,3) до гомогенного состояния. Суспензию подвергают обработке ультразвуком до снижения оптической плотности при длине волны 550 нм до 50-60% от исходного значения. Клеточный дебрис после центрифугирования удаляют, а супернатант наносят на колонку с КМ-сефарозой, уравновешенную буфером А (50 мМ Трис-HCl, рН 8,3). Нагрузка на колонку составляет 6-10 мг белка на 1 мл сорбента. Колонку промывают буфером А до снижения оптической плотности в вытекающем растворе при длине волны 280 нм до исходного значения и белки элюируют линейным градиентом буферов следующего состава: 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3 (буфер А) - 50 мМ цитрат натрия, рН 6,5 с 0,5 M NaCl. Фракции, содержащие дельтаферон, объединяют и диализуют против 2 л буфера Б (50 мМ цитрат Na, рН 6,5) в течение 12 часов при температуре 6°С. Доочистку дельтаферона проводят рехроматографией на КМ-сефарозе, предварительно уравновешенной буфером Б. Значение рН раствора белка перед нанесением доводят до значения рН 6,5, добавляя по каплям 0,1 М раствор соляной кислоты. После нанесения колонку промывают буфером Б до снижения оптической плотности в вытекающем растворе при длине волны 280 нм до исходного значения. Элюцию белка осуществляют экспоненциальным градиентом следующего состава: буфер Б (50 мМ цитрат Na, рН 6,5) - буфер А (50 мМ трис-HCl, рН 8,3 с 1 М NaCl). Фракции субстанции дельтаферона объединяют и диализуют против 1л буфера В (10 мМ КН₂ РО₄, 0,15 М NaCl, рН 7,0) в течение 12 часов при температуре 6°С. После диализа субстанцию дельтаферона стерилизуют ультрафильтрацией, используя мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Электрофоретическая чистота конечного препарата составляет более 98%.

При масштабировании получения рекомбинантного продукта крайне важна надежность технологии очистки целевого продукта. Проведение хроматографии на ионообменнике при различных рН позволяет достичь дополнительного разделения целевого белка и примесных компонентов при использовании одного и того же хроматографического носителя.

Удельная специфическая активность полученной по предлагаемому способу субстанции дельтаферона, определенная по эффекту подавления цитопатического действия вируса энцефаломиокардита на культуре диплоидных фибробластов человека [15], соответствовала активности препарата, полученного по способу-прототипу. Содержание примесных белков Е. coli, определенных методом твердофазного иммуноферментного анализа [16], составляет 40 нг/мг дельтаферона, содержание примесей ДНК, определенных методом молекулярной гибридизации [17], - 80 пг/мг препарата, содержание ЛПС, определенных химико-ферментативным методом [18], - 30 нг/мг препарата. Значения представленных примесей в полученной по предлагаемому способу субстанции дельтаферона гораздо ниже их предельно допустимых значений [12].

Изобретение также включает сухой инъекционный препарат, состоящий из высокоочищенного аналога рчИФН- - дельтаферона, полученного по предлагаемому способу, низкомолекулярного полимерного наполнителя-стабилизатора (реополиглюкин либо поливинилпирролидон) и буферной солевой системы. Количественный состав одной терапевтической дозы препарата объемом 1 мл следующий:

- аналог рчИФН- - дельтаферон - 50 мкг/мл (50000 МЕ/мл);

- реополиглюкин (или поливинилпирролидон) сухой - 50000 мкг/мл;

- NaCl - 8,78 мкг/мл;

- КН₂PO ₄ - 1,36 мкг/мл, (рН=7,0±0,1).

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами

Фиг.1. Аминокислотные последовательности С-концов молекул рекомбинантного человеческого интерферона гамма и дельтаферона.

Фиг.2. Диаграмма влияния рекомбинантного человеческого интерферона гамма и дельтаферона на пролиферативную активность мононуклеарных клеток доноров (доверительный интервал рассчитан при р<0,05).

Фиг.3. Профиль первой хроматографии дельтаферона на КМ-сефарозе; номер электрофоретической дорожки соответствует номеру фракции.

Фиг.4. Профиль повторной хроматографии дельтаферона на КМ-сефарозе; номер электрофоретической дорожки соответствует номеру фракции.

Фиг.5. Очистка дельтаферона по стадиям выделения, где:

1 - клеточный лизат после разрушения ультразвуком (5 мкл),

2 - супернатант после центрифугирования (клеточный экстракт 5мкл),

3 - осадок после центрифугирования,

4 - дельтаферон после первой хроматографии (20 мкг),

5 - дельтаферон после рехроматографии (20 мкг).

Фиг.6. Электрофоретический анализ субстанции дельтаферона, где дорожки 1 и 3 - дельтаферон (25 и 45 мкг), а дорожка 2 - белки - маркеры молекулярного веса.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Получение трансформированных клеток, отбор высокопродуктивных клонов и выращивание их в жидкой селективной среде.

Трансформацию компетентных клеток E. coli MH-1 плазмидной ДНК pIFN D10 проводят кальциевым методом, как описано ранее [17]. Суспензию клеток высевают в чашки с агаризованной средой, содержащей тетрациклин в концентрации 15 мкг/мл. Выросшие колонии трансформированных клеток рассевают секторами на чашки с агаризованной средой, содержащей тетрациклин в концентрации 15 мкг/мл. Часть клеток из секторов отбирают микробиологической петлей и анализируют электрофорезом в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [13] на количественное содержание целевого белка. Вычисление относительного содержания целевого белка проводится обработкой электрофореграмм в программе «Gel-pro analyzer, Ver. 3.1» (Media Cybernetics Inc. США). Клоны с наибольшим содержанием целевого белка используют для получения инокулята. Их подращивают в жидкой питательной среде М9 с казаминовыми кислотами (2%), содержащей тетрациклин в концентрации 10 мкг/мл, при 32°С до середины логарифмической фазы роста (Д₅₅₀=0,5-0,6).

Ферментацию проводят в ферментере «Ультраферм» с рабочим объемом 4 л при температуре 31-32°С. Питательная среда - М9 с казаминовыми кислотами (2%), содержащая тетрациклин в концентрации 10 мкг/мл. Скорость вращения мешалки в ферментере от 100 до 200 об/мин, подача воздуха 0,5-1,0 л/мин на 1 л среды. Для засева используют посевной материал, полученный как описано выше. Объем посевного материала 1% (об/об) от объема среды для ферментации. Время ферментации 9-10 ч. Заканчивают ферментацию в конце логарифмической фазы роста. Культуральную жидкость охлаждают до 5-10°С, клетки собирают центрифугированием и хранят при температуре минус 70°С.

Пример 2. Получение высокоочищенной субстанции дельтаферона

30 г биомассы клеток E. coli MH-1/pIFN D10 суспендируют в 300 мл буфера для разрушения (50 мМ трис-HCl, 1 мМ CuCl ₂, 1 мМ ZnCl₂ pH 8,3) до гомогенного состояния. Затем суспензию помещают в ледяную баню и подвергают обработке ультразвуком (установка УЗДН-2Т) при частоте 22 кГц сеансами по 30 секунд с интервалом по 1 мин, для охлаждения смеси (значение температуры в суспензии не должно превышать 8±2°С). Озвучивание продолжается до снижения оптической плотности при длине волны 550 нм до 50-60% от исходного значения. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием при 12000 об/мин в течение 60 мин (JA-21, ротор JA-14, t=4±2°C), после чего супернатант, содержащий целевой белок, собирают и наносят на колонку с КМ-сефарозой, уравновешенную буфером А (50 мМ трис-HCl, pH 8,3). Нагрузка на колонку составляет 6-10 мг белка на 1 мл сорбента. Колонку промывают буфером А до снижения оптической плотности в вытекающем растворе при длине волны 280 нм до исходного значения. Элюцию дельтаферона с колонки осуществляют линейным градиентом буферов следующего состава: буфер А - 50 мМ цитрат Na, pH 6,5 с 0,5 М NaCl. Вытекающий раствор собирают фракциями, которые затем анализируются электрофорезом в 15%-ном ПААГеле в денатурирующих условиях по Леммли [13]. Вычисление относительного содержания целевого белка проводится обработкой электрофореграмм в пакете программы «Gel-pro analyzer Ver. 3.1» (Media Cybernetics Inc. США). Профиль хроматографии и электрофоретический анализ собранных фракций представлен на фиг.3. Анализ фракций показал, что на этой стадии удалось достигнуть 80% чистоты целевого белка. Фракции, содержащие дельтаферон, объединяют и диализуют против 2 л буфера Б (50 мМ цитрат Na, pH 6,5) в течение 12 часов при температуре 6°С. Доочистку дельтаферона проводят рехроматографией на КМ-сефарозе, предварительно уравновешенной буфером Б. Значение pH раствора белка перед нанесением доводят до значения pH 6,5, добавляя по каплям 0,1 М раствор соляной кислоты. После нанесения колонку промывают буфером Б до снижения оптической плотности в вытекающем растворе при длине волны 280 нм до исходного значения. Элюцию белка осуществляют экспоненциальным градиентом следующего состава: буфер Б - буфер А с 1 M NaCl. Профиль второй хроматографии представлен на фиг.4. Собранные фракции анализируются электрофорезом как описано выше. Фракции, содержащие при анализе одну белковую полосу с молекулярным весом 16,2 кДа, объединяют и диализуют против 1 л буфера В (10 мМ KH₂PO ₄, 0,15 М NaCl, pH 7,0) в течение 12 часов при температуре 6°С. После диализа определяется концентрация белка по методу [14] и далее субстанцию дельтаферона стерилизуют ультрафильтрацией, используя мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Относительный выход дельтаферона составляет 27,3% от содержания его в клеточном экстракте, 185 мг из 30 г биомассы (6,1 мг из 1 г биомассы). Данные по выделению и очистке белка представлены в таблице.

Данные по выделению и очистке дельтаферона из 30 г клеток с исходным содержанием целевого белка 17.7%
Стадия очистки	Объем, мл	Общий белок		Дельтаферон		Выход, %
		мг/мл	мг	%	мг
Экстракт клеток	510	7,5	3825	17,7	677	100
1 хроматография на КМ-сефарозе	70	3,67	256,9	90	231,21	34
Рехроматография на КМ-сефарозе	69	2,75	189	98	185	27,3

Картина очистки по стадиям представлена на фиг.5. Субстанция электрофоретически гомогенна при нагрузке 45 мкг на лунку (фиг.6 дорожка 3). Удельная специфическая активность субстанции дельтаферона, определенная по эффекту подавления цитопатического действия вируса энцефаломиокардита на культуре диплоидных фибробластов человека, составляет не менее 1×10⁶ Ед/мг белка [15]. Содержание примесных белков Е. coli, определенных методом твердофазного иммуноферментного анализа [16], составляет 40 нг/мг дельтаферона, содержание примесей ДНК, определенных методом молекулярной гибридизации [17], - 80 пг/мг препарата, содержание ЛПС, определенных химико-ферментативным методом [18], - 30 нг/мг препарата.

Пример 3. Получение инъекционной формы препарата дельтаферона

Стерильная субстанция дельтаферона используется для приготовления сухого стабильного при хранении инъекционного препарата. Препарат получают путем смешивания концентрированного раствора субстанции дельтаферона в буфере В (10 мМ КН₂PO ₄, 0,15 М NaCl, pH 7,0±0,1) с 10%-ным стерильным раствором низкомолекулярного полимерного наполнителя-стабилизатора (реополиглюкин или поливинилпирролидон) до конечной концентрации дельтаферона 50 мкг/мл (50000 ME одна терапевтическая доза) и содержания реополиглюкина (или поливинилпирролидона) 5%. Полученный раствор разливают в ампулы или флаконы по 1 мл и замораживают при температуре минус 40°С. Режим лиофилизации включает высушивание при температуре минус 40°С в течение 3 часов с последующим постепенным повышением температуры до 30°С. При достижении этого значения температуры препарат досушивается в течение 12 часов до остаточной влажности 2-5%. Полученный сухой инъекционный препарат представляет собой таблетку белого или слегка желтоватого цвета, которая растворяется в воде для инъекций в течение нескольких секунд с образованием прозрачного или желтоватого раствора. Проверка антипролиферативной и противовоспалительных активностей, как было представлено выше, показала их полную сохранность от исходной, при хранении препарата в течение 12 месяцев при температуре 6-8°С.

Таким образом, предложен препаративный способ получения высокоочищенного аналога рчИФН- , с антипролиферативной и противовоспалительной активностями, который обеспечивает высокий выход препарата также как и его стабильность в процессе хранения. Предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет:

- достигать повышенного выхода целевого продукта (от 6 мг и выше с 1 г биомассы);

- получать высокоочищенный белок, отвечающий всем показателям, требуемым для медицинских генно-инженерных препаратов;

- использовать повышенные количества биомассы (30 г и больше), легко масштабировать процесс;

- использовать на стадиях хроматографической очистки коммерчески доступный сорбент с высокой линейной скоростью потока (КМ-сефароза);

- обеспечивать высокую стабильность и сохранность препарата в процессе его хранения.

Литература

1. Cantell К., Schellekens H., Hitroven S., Van der Meide., De Reus A. "Pharmacokinetic studies with human and rat interferons in different species". // II J. Interferon Res., 1986, v.6, p.671-675.

2. Dobeli H., Gents R., Jucker W., Garotta G., Hartmann D.W., Hochuli E. "Role of the carboxy-terminal sequence of the biological activity of human immune interferon". // J.Biotechnology, 1988, v.7, p.199-216.

3. Rutenfranz I., Bauer A., Kirchner H. "Pharmacokinetic study f liposome-encapsulated human interferon-g after intravenous and intramuscular injection in mice". // J. lEN. Res., 1990, v.10, p.337-341.

4. Патент РФ №2214832, кл. А61К 38/21, опубл. 27. 10. 2003 г.

5. Патент РФ №2097428, кл. С12N 15/23, опубл. 27. 11. 1997 г.

6. Патент РФ №2054044, кл. С12Р 21/00, опубл. 10. 02. 1996 г.

7. Патент РФ №2046144, кл. С12N 15/23, опубл. 20. 10. 1995 г.

8. Смирнова О.Ю., Татьков С.И., Петренко В.А. и др. // Докл. АН. - 1994, Т.337. - №3, С.405-406.

9. Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Цивковский Р.Ю., Ильичев А.А. Гамма-интерфероны человека с измененным С-концом и их свойства // Мол. биология. - 1995. - Т.29. - С.1095-1101.

10. Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Цивковский Р.Ю., Кочнева Г.В., Кузьмичева Г.А., Христофоров B.C., Косарев И.С., Черных Е.Р., Хонина Н.А., Лебедев Л.Р., Даниленко Е.Д., Фадина В.А., Пустошилова Н.М., Масычева В.И., Сандахчиев Л.С. Мутантный гамма-интерферон человека с укороченным С-концом и его свойства // Докл. РАН. - 2000. - Т.372, №6. - С.833-835.

11. Патент РФ №2105813, кл. С12N 15/00, опубл. 27. 02. 1998 г.

12. МУК 4.1/4.2.588-96 Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. Минздрав РФ, Москва 1998 г.

13. Laemmli U.К. // Nature. - 1970. - V.227. - P.680-685.

14. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. // Справочник биохимика. - М.: Мир, 1991, с.466-467.

15. Yousefi S., Escobar M.R., Gouldin C.W// Am.J.Clinical Pathol. - 1985. - V.83. - P.735-740.

16. Новое в клонировании ДНК. Методы. // Под ред. Д.Гловера. - М.: Мир, 1989.

17. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - c.480.

18. Денисова Л.Я., Батурина И.И., Закабунин А.И. и др. // Журн микробиол. эпидемиол. и иммунобиологии. - 1999. - №5. - С.109-112.