консорциум штаммов лактобактерий и способ получения на его основе препарата, используемого в качестве биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов

Формула изобретения

1. Консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 5863), Lactobacillus plantarum П-75 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 3962); Lactobacillus casei Сб (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 5724), используемый для получения в жидкой форме биологически активных добавок и кисломолочных лечебно-профилактических продуктов.

2. Консорциум штаммов лактобактерий по п.1, отличающийся тем, что количество Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75; Lactobacillus casei Сб соотносится как 2:0,5:0,5.

3. Способ получения препарата, используемого в качестве биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов, включающий подготовку молочной питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение до температуры заквашивания, внесение в молочную питательную среду посевной дозы комбинации штаммов бактерий-пробиотиков в количестве не более 5,0 мас.%, сквашивание продукта в течение времени, достаточном для формирования сгустка, и охлаждение готового продукта при температуре не выше 6°С, отличающийся тем, что в качестве комбинации штаммов бактерий-пробиотиков используют консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 5863), Lactobacillus plantarum П-75 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 3962), Lactobacillus casei Сб (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 5724), содержащихся в соотношении 2:0,5:0,5, а в качестве молочной питательной среды используют обезжиренное молоко, нормализованное по сухому остатку до 13,5-15%, в которое дополнительно вводят лактопептон и натрий лимонно-кислый при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Лактопептон	3,5-4,5
Натрий лимонно-кислый	0,15-0,25
Обезжиренное молоко, нормализованное
по сухому остатку до 13,5-15%	остальное до 100%

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что сквашивание производят при температуре 39-40°С в течение 4-5 ч до достижения кислотности готового продукта не менее 90°Т.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и представляет собой консорциум штаммов лактобактерий, который может быть применен для получения на его основе препарата, используемого в качестве биологически активной добавки (БАД) или закваски для производства кисломолочных продуктов в лечебно-диетических целях.

Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая.

Препараты и продукты, содержащие в своем составе лактобактерии, широко используются для профилактики и лечения дисбактериозов и нормализации микрофлоры кишечника людей, перенесших стрессовые воздействия, антибиотико- и химиотерапию.

Предшествующий уровень техники

За рубежом широко используют препараты-пробиотики и продукты лечебного питания на основе консорциумов штаммов лактобактерий видов Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum и Lactobacillus lactis в разных комбинациях (Патент США №6827953, МПК С12N 1/20, А61К 35/72, опубл. 07.12.2004; патент Великобритании №883424, МПК С12С 1/20, опубл. 29.11.1961; патент Великобритании №930107, МПК А61К 35/72, опубл. 03.07.1963), а также на основе консорциумов штаммов бифидо- и лактобактерий (Заявка США №20020090416, МПК A23L 1/00, опубл. 11.07.2002; патент США №5866385, МПК С12N 1/21, А23С 9/123, опубл. 02.02.1999).

Однако консорциумы штаммов лактобактерий и консорциумы штаммов бифидо- и лактобактерий зарубежных фирм-разработчиков ориентированы на создание, преимущественно, лечебно-профилактических препаратов и БАД в сухой форме (таблетки, капсулы). Указанные консорциумы штаммов имеют существенные недостатки, если их использовать для приготовления препаратов и кисломолочных продуктов в жидкой форме: малые сроки хранения указанных препаратов и продуктов, низкие органолептические качества, которые несущественны для препаратов в сухой форме.

Известны консорциумы штаммов бифидо- и лактобактерий, используемые для производства кисломолочных и неферментированных продуктов в жидкой форме (Патент РФ №2180348, МПК С12N 1/20, опубл. 2002 г.; патент РФ №2180914, МПК С12N 1/20, опубл. 2002 г.; патент РФ №2180915, МПК С12N 1/20, опубл. 2002 г.).

Основным недостатком кисломолочных продуктов, изготовленных на основе консорциумов штаммов бифидо- и лактобактерий является недостаточный срок их хранения (не более 1 месяца) вследствие того, что лактобактерии в процессе хранения продукта способствуют быстрому его закислению. Титр бифидобактерий в закисленном продукте быстро падает, что снижает лечебно-профилактические свойства этого продукта.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus (штамм NCIMB 40354), Lactobacillus plantarum (штамм NCIMB 40356); Lactobacillus casei (штамм NCIMB 40357), используемый для получения кисломолочных лечебно-профилактических продуктов (патент Великобритании №2251864, МПК С12N 1/20, опубл. 22.07.1992).

Однако срок хранения такого консорциума штаммов лактобактерий в кисломолочных продуктах составляет 30 дней, что недостаточно при приготовлении биологически активных добавок в жидкой форме.

Другим наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения препарата из 15-ти симбиотических культур бактерий-пробиотиков как бифидо-, так и лактобактерий, в том числе штаммы Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei (патент РФ №2163445, МПК А23С 9/12, опубл. 27.02.2001 г.), который может быть использован как лечебно-профилактический препарат или биологически активная добавка в жидкой форме. Способ включает размножение каждой монокультуры бактерий-пробиотиков на среде отдельно при оптимальных температурах в диапазоне 20-25°С в течение 12-16 часов до образования сгустка в термосах. Далее производят слив каждой монокультуры в стерильную емкость в соотношении по объему 1:1 и смесь перемешивают. Далее в стерильное обезжиренное молоко или молоко с содержанием жира 0,5-3,2% вносят 3-5% из смеси монокультур, перемешивают и ставят в термостат на 5-7 часов при температуре 32-37°С до образования сгустка и до 10^8-9 клеток в 1 г. Готовый препарат ставят в холодильник при 0-6°С.

Однако препарат, полученный таким способом, имеет низкий начальный титр готового продукта (до 10^8-9 клеток в 1 г) и короткие сроки хранения. Лактобактерии в процессе хранения продукта способствуют его закислению, вследствие чего титр лакто- и бифидобактерий в закисленном продукте быстро падает, что снижает его лечебно-профилактические свойства.

Техническим результатом заявляемых технических решений является повышение сроков хранения заявляемого консорциума лактобактерий в приготавливаемых препаратах, в том числе в БАДах, а также обеспечение более высокого начального титра готовых продуктов после их приготовления.

Указанный технический результат достигается новым консорциумом штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S (депонирован во ВНИИ генетики в ВКПМ под № В 5863), Lactobacillus plantarum П-75 (депонирован во ВНИИ генетики в ВКПМ под № В 3962); Lactobacillus casei Сб (депонирован во ВНИИ генетики в ВКПМ под № В 5724), используемым для получения в жидкой форме биологически активных добавок и кисломолочных лечебно-профилактических продуктов. Количество Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75; Lactobacillus casei Сб соотносится как 2:0,5:0,5.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе получения биологически активной добавки бактерий-пробиотиков в жидкой форме, включающем подготовку молочной питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение до температуры заквашивания, внесение в молочную питательную среду посевной дозы комбинации штаммов бактерий-пробиотиков в количестве не более 5,0 мас.%, сквашивание продукта в течение времени, достаточного для формирования сгустка, и охлаждение готового продукта при температуре не выше +6°С, согласно изобретению, в качестве комбинации штаммов бактерий-пробиотиков используют консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S (депонирован во ВНИИ генетики в ВКПМ под № В 5863), Lactobacillus plantarum П-75 (депонирован во ВНИИ генетики в ВКПМ под № В 3962); Lactobacillus casei Сб (депонирован во ВНИИ генетики в ВКПМ под № В 5724), содержащихся в соотношении 2:0,5:0,5, а в качестве молочной питательной среды используют обрат молока, нормализованный по сухому остатку СОМО 13,5-15%, в которую дополнительно вводят лактопептон и натрий лимоннокислый при следующем соотношении компонентов (мас.%):

Лактопептон	3,5-4,5
Натрий лимоннокислый	0,15-0,25
Обрат молока, нормализованный
по сухому остатку СОМО 13,5-15%	остальное до 100%.

Причем сквашивание производят при температуре (39-40)°С в течение 4-5 часов до достижения кислотности готового продукта не менее 90°Т.

В стандартной обезжиренной молочной среде искусственно увеличивают в 1,3-1,5 раза концентрацию белков и лактозы внесением сухого молока так, чтобы сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО) достигал 13,5-15%. Чем выше содержание СОМО, тем выше содержание казеина, который образует буферную систему, связывая большое количество кислых метаболитов в казеинаты. Тем самым удается сдерживать нарастание кислотности среды при росте биомассы. Кроме того, с увеличением содержания до 15% СОМО в обрате молока увеличивается содержание лактозы на 25-30%, которая повышает ростовые свойства среды, обеспечивающие повышение титра лактобактерий. Для предотвращения коагуляции казеина в молочную основу вводят раствор натрия лимоннокислого, который обладает сильными стабилизирующими и буферными свойствами.

Лактопептон вводят для повышения ростовых свойств молочной питательной среды, который представляет собой гидролизат сывороточных белков ( -лактальбумин, -лактоглобулин, иммуноглобулин, лактоферрин), которые после расщепления дают большое количество незаменимых и серосодержащих аминокислот.

В результате удалось существенно увеличить сохранность лактобактерий консорциума. Оптимизация технологии получения биомассы лактобактерий на обезжиренной молочной среде с повышенным содержанием СОМО и лактопептоном, позволила получать стабильную биомассу с высоким начальным титром и длительным сроком хранения.

Сведения о депонировании штаммов консорциума:

1. Lactobacillus acidophilus 57S (депонирован во ВНИИ генетики в ВКПМ под № В 5863);

2. Lactobacillus plantarum П-75 (депонирован во ВНИИ генетики в ВКПМ под № В 3962).

3. Lactobacillus casei Сб (депонирован во ВНИИ генетики в ВКПМ под № В - 5724). Свойства консорциума определяет штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, содержание которого в консорциуме около 70%.

Культурально-морфологические признаки консорциума

Клетки лактобактерий представляют собой прямые палочки средней длины или крупные (1,0-1,5×3-14 мкм), расположенные цепочками или поодиночке, грамположительные, спор и капсул не образуют. На плотных средах образуют мелкие глубинные колонии, как правило, в виде клубка нитей.

Штаммы не разжижают желатин, не образуют газ, каталазу не продуцируют. Синтезируют молочную кислоту, ассимилируют глюкозу, арабинозу, лактозу, не ассимилируют рафинозу, сахарозу, мальтозу, маннит.

Оптимальная температура для роста штаммов лактобактерий составляет (36-42)°С.

При внесении штаммов в обезжиренное молоко в объеме 3%, сбраживание молока происходит за 4-5 часов. Кислотность консорциума составляет 240-280°Т.

Кислотообразующая активность: к 24 ч - 140° Тернера, к 72 ч - 160-200° Тернера.

Максимальный титр лактобактерий консорциума в молочной среде (стерильное обезжиренное молоко) через 5-6 часов роста составляет 1-2×10⁹ , через 90 дней хранения в этой среде - 1-2×10 ⁸. При добавлении лактопептона через 4-5 ч роста составляет (3-7)·10¹⁰, через 90 дней хранения в этой среде - 2,5-6×10⁹

Антагонистические свойства:

Проявляет активность по отношению к шигеллам Зонне, Флекснера, энтеропатогенным кишечным палочкам, стафилококкам.

Способность консорциума штаммов трех видов лактобактерий наращивать микробную массу в питательных средах, сквашивать молоко в короткие сроки, проявлять специфическую активность делает возможным его использование в приготовлении БАДов, кисломолочных, не ферментированных пищевых продуктов и бактерийных препаратов.

Результаты исследований, подтверждающие полезные свойства заявляемого консорциума штаммов лактобактерий

Для выявления технологических особенностей и свойств заявляемого консорциума штаммов лактобактерий проведены исследования в процессе культивирования заявляемого консорциума, а также его хранения. Культивирование консорциумов проводили в молочной среде, изготовленной по МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов". Для повышения ростовых свойств молочной основы был введен лактопептон (мас.%):

Лактопептон	3,5-4,5
Натрий лимоннокислый	0,15-0,2 5
Обрат молока (основа), нормализованный
по сухому остатку 13,5-15%	остальное до 100%

В стандартной обезжиренной молочной среде искусственно увеличивают в 1,3-1,5 раза концентрацию белков и лактозы внесением сухого молока так, чтобы сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО) достигал 13,5-15%. Чем выше содержание СОМО, тем выше содержание казеина, который образует буферную систему, связывая большое количество кислых метаболитов в казеинаты. Тем самым удается сдерживать нарастание кислотности среды при росте биомассы. Чем выше содержание лактозы, тем выше ростовые свойства среды - увеличение содержания лактозы на 25-30% повышает титр лактобактерий. Для предотвращения коагуляции казеина в молочную основу вводят раствор натрия лимоннокислого, который обладает сильными стабилизирующими и буферными свойствами.

Кроме того, для повышения ростовых свойств молочной питательной среды вводят лактопептон, который представляет собой гидролизат сывороточных белков ( -лактальбумин, -лактоглобулин, иммуноглобулин, лактоферрин), которые после расщепления дают большое количество незаменимых и серосодержащих аминокислот.

В результате удалось существенно увеличить сохранность лактобактерий консорциума. Оптимизация технологии получения биомассы лактобактерий на обезжиренной молочной среде с повышенным содержанием СОМО и лактопептоном позволила получать стабильную биомассу с высоким начальным титром и длительным сроком хранения.

В таблице 1 представлены технологические характеристики заявляемого консорциума штаммов лактобактерий на молочной среде (обрат молока, нормализованный по сухому остатку 13,5-15%) в процессе культивирования и хранения.

Таблица 1 Технологические характеристики заявляемого консорциума штаммов лактобактерий на молочной среде в процессе культивирования и хранения
Производственная закваска		Биомасса лактобактерий на основе консорциума
Виды штаммов лактобактерий в консорциуме	Соотношение штаммов, %	Время культивирования, часы	Кислотность, Т°		Титр (КОЕ/мл) ЖКБ в процессе хранения			Сгусток
			1 сут.	72 сут	1 сут	60 сут	72 сут
В - 5724 В - 3962 В - 5863	0,5:0,5:2	4 ч. 50 м.	140	160	1×1010	6×109	2×109	Нормальный

Исследование антагонистической активности заявляемого консорциума штаммов лактобактерий

Антагонистическая активность штаммов консорциума лактобактерий (таблица 2) была изучена методом in vitro при совместном выращивании с патогенными тест-штаммами по зоне задержки роста тест-микробов методом штриховых кодов

Таблица 2 Исследование антагонистической активности лактобактерий на плотных питательных средах
Наименование тест-микробов	Лактобактерии Lactobacillus casei	Лактобактерии LactobacUlus plantarum	Лактобактерии Lactobacillus acidophilus
E.coli	13 мм	12 мм	13 мм
Sh.flexneri	12 мм	12 мм	12 мм
S.aureus	15 мм	14 мм	14 мм
Proteus vulgaris	11 мм	12 мм	12 мм
Proteus mirabilis	12 мм	13 мм	13 мм

Изучение влияния консорциума лактобактерий на представителей нормальной кишечной микрофлоры в модели in vitro.

Эти исследования проводились Головным испытательным центром при ГУ НИИ Питания РАМН. Объекты исследования - препараты-эубиотики производства АООТ «БИОМЕД» им. И.М.Сеченова:

- Лактобактерин сухой,

- Бифидумбактерин сухой

Таблица 3 Результаты исследований влияния заявляемого консорциума лактобактерий на нормальную кишечную микрофлору в модели in vitro
Показатели Микроорганизмы-эубиотики, КОЕ/г продукта	Эубиотик + БАД	Контроль эубиотика
Лактобациллы, рост на среде MRS микроскопический препарат	1×109 Гр (+) палочки без спор, типичные для лактобацилл	109 КОЕ/Г, Гр (+) палочки без спор, типичные для лактобацилл; отсутствие клеток посторонней микрофлоры
Бифидобактерии Микроскопический препарат	1×108 Гр (+) палочки без спор, изогнутые и с бифуркацией, типичные для бифидобактерий	1×108 КОЕ/г Гр (+) палочки без спор, изогнутые и с бифуркацией, типичные для бифидобактерий; отсутствие клеток посторонней микрофлоры
Колибактерин Е. Coli М-17 Рост в среде Malthus Enterobacteriaceae medium. Микробиологический	1×109 Гр (-) палочки без спор, типичные для колибактерий	1,3×1010 Гр (-) палочки без спор, типичные для колибактерий; отсутствие клеток посторонней микрофлоры

Из таблицы 3 видно, что ингибирующего действия консорциума лактобактерий на представителей нормальной кишечной микрофлоры в модели in vitro не выявлено.

Эффективность консорциума штаммов лактобактерий была установлена в результате доклинических исследований, проведенных в ГНЦ ВБ «Вектор» Минздрава РФ на взрослых мышах и молодняке генетически стандартной колонии ICR в соответствии с требованиями РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых иммунобиологических препаратов. Основные положения». Исследования проводились по схеме: общая токсичность (хроническая), эмбриотоксичность и влияние на репродуктивную функцию, общее фармакологическое действие (влияние на пищеварительную систему, формирование адаптационного эффекта).

При изучении хронической токсичности все животные были жизнеспособны, потери массы тела, нарушения двигательной активности, угнетения состояния и гибели не отмечено. Более того, наблюдается стимулирующее действие консорциума на рост, развитие и выживаемость животных. Гематологические показатели крови в пределах физиологической нормы. Гистологические исследования органов-мишеней показали отсутствие токсического воздействия на эти органы. Не выявлено также иммунотоксического воздействия препарата на органы лимфоидной системы при их гистологическом исследовании.

Высокая эффективность консорциума лактобактерий доказана при изучении репродуктивной функции беременных самок - наблюдается заметное улучшение состояния организма самок, снижение поздней эмбриональной смертности после имплантации (3,1%) против (5,3%) в контрольной группе, лучшая выживаемость новорожденных мышат за этот период до 92,5% в сравнении с контролем до 80%. Проверка эффективности физиологического воздействия консорциума на пищеварительную систему мышей показала стабилизирующее влияние на работу ЖКТ и становления микробиоценоза новорожденных мышат за счет колонизационной активности штаммов лактобактерий консорциума.

Консорциум содействует также выживанию мышей в тяжелых ситуациях (условия повышенных температур - 32+2°С), действуя как адаптоген, способствующий сохранению значительных функциональных резервов жизненно важных систем организма.

Примеры предпочтительного осуществления изобретения

Пример 1. Получение на основе заявляемого консорциума лактобактерий БАД «ТРИЛАКТ» или закваски для производства кисломолочных продуктов

Введение культур лактобактерий. Для приготовления первичной (маточной) закваски используют лиофилизированные аттестованные штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus casei Сб и Lactobacillus plantarum П-75 или эти же активированные музейные штаммы, сохраняемые в пробирках в стерильном обезжиренном молоке.

В ампулу с лиофилизированным аттестованным штаммом лактобактерий пипеткой вносят (0,2-0,5) мл стерильного физраствора. После растворения лиофильной массы той же пипеткой содержимое ампулы пересевают (переносят) в пробирку с 9 мл стерильного обезжиренного молока и хорошо перемешивают пипетированием. Посевы инкубируются в термостате ТС26 при температуре (39,0-40,0)°С в течение (20-24) часов. Далее проводят 1-2 пассажа в стеклянных флаконах вместимостью (0,1-0,25) л со стерильным обезжиренным молоком для полной активизации их свойств. Последующие посевы инкубируют в термостате при температуре (39,0-40,0)°С в течение (5-6) часов.

После инкубирования флаконы с культурами передают на охлаждение и хранение в холодильник, после созревания в течение 10-12 часов используются для получения лабораторной закваски.

Первичная (маточная) закваска лактобактерий может храниться в холодильнике при температуре (6-8)°С не более 7 дней.

Приготовление лабораторной и производственной заквасок штаммов лактобактерий. Лабораторные закваски лактобактерий готовят на стерильном обезжиренном молоке из первичной (маточной) закваски отдельно для каждого штамма лактобактерий из расчета недельной потребности и используют в дальнейшем производстве на следующий день после ее приготовления.

Поочередно из флаконов с культурами лактобактерий с характерным ростом в стерильном обезжиренном молоке, отбирают пипеткой культуры каждого из штаммов в количестве 3% посевного материала к объему стерильного обезжиренного молока. Выдерживают в термостате в течение (4-5) ч при температуре (39±1)°С.

Содержание пробиотических микроорганизмов в полученной биомассе лактобактерий составляет lg 8-9 в 1 мл.

Получение консорциума лактобактерий. Для получения консорциума штаммов лактобактерий производят механическое смешивание лабораторных заквасок Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75, Lactobacillus casei Сб в соотношении 2:0,5:0,5.

Содержание пробиотических микроорганизмов в полученной биомассе консорциума ассоциации составляет lg 9 в 1 мл.

Получение закваски или БАД «Трилакт. Приготовление закваски или биомассы БАД «Трилакт» ведется термостатным способом в стеклянных стерильных бутылях вместимостью 15 л. В начале приготавливают в асептических условиях молочную питательную среду на основе обрата молока, нормализованного по сухому остатку СОМО до 13,5-15,0%. В указанную молочную среду дополнительно вводят лактопептон и натрий лимоннокислый в следующем количественном соотношении (мас.%):

Лактопептон	3,5-4,5
Натрий лимоннокислый	0,15-0,25
Обрат молока, нормализованный
по сухому остатку 13,5-15%	остальное до 100%

В асептических условиях в стеклянную бутыль, содержащую 9,5 л нормализованной молочной питательной среды, вносят готовую производственную закваску консорциума лактобактерий в количестве 0,5 л. Микробную смесь лактобактерий осторожно перемешивают круговым вращением бутыли в течение (1-2) минут. Помещают в термостат типа ТС-80М на (4-5) часов при температуре (39-40)°С. Заквашенную смесь оставляют без перемешивания до образования сгустка и достижения кислотности не менее 90°Т. После образования сгустка бутыли с продуктом захолаживают до температуры (4±2)°С в холодильниках. Для стабилизации и упрочения сгустка захолаживание продукта производят в течение (8-10) ч с последующей фасовкой и хранением готового продукта.

Пример 2. Использование консорциума в качестве закваски для приготовления симбиотического кисломолочного продукта лечебно-функционального питания - Бифацила

Закваску консорциума, приготовленную по примеру 1, в объеме 0,5-1% вносят в пастеризованное молоко вместе с бифидобактериями и термофильным стрептококком в объемах заквасок, предусмотренных для приготовления бифацила, перемешивают и культивируют 3-3,5 ч до образования сгустка, после чего продукт охлаждают и фасуют в потребительскую тару. В результате получают лечебно-профилактический кисломолочный продукт с содержанием полезной лактофлоры не менее lg 7-8 в 1 мл симбиотического продукта.

Полученный продукт обладает выраженным иммунокоррегирующим действием.

Пример 3. Использование консорциума штаммов лактобактерий для получения бактерийного препарата

К выращенной биомассе консорциума по примеру 1 добавляют защитные среды высушивания (сахароза 10% и желатина 5%). Полученную суспензию разливают по 2 мл в ампулы или по 5 мл во флаконы, замораживают при t = минус 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10⁹ живых клеток лактобактерий.

Технология производства консорциума в составе продуктов не требует дорогостоящего оборудования (ферментеров) и позволяет получать большие количества биомассы лактобактерий простым термостатным способом без коррекции рН и применения систем газообмена. В то же время концентрация лактобактерий в биомассе консорциума лактобактерий достигает максимальных значений - lg 10. Кислотность биомассы лактокон-сорциума даже при хранении в течение 3 месяцев в жидком состоянии повышается, в допустимых пределах. В результате предлагаемый консорциум более технологичен и экономичен в сравнении с другими формами консорциумов, очень удобен в применении, хранении и транспортировке.

Пример 4. Исследование длительности хранения консорциума штаммов лактобактерий в жидком БАД «Трилакт»

Исследована длительность хранения консорциума штаммов лактобактерий в жидком БАД «Трилакт» (таблица 4). Значительный срок (до 108 дней) хранения БАД «Трилакт» с титром не ниже 10⁸ КОЕ/мл связан с обеспечением начальной кислотности препарата консорциума лактобактерий не более (120-140)°Т, получением исходного титра лактобактерий (не ниже 10⁹ КОЕ/мл) и использованием оригинальной молочной питательной среды с добавлением лактопептона.

Таблица 4 Данные по сохранности заявляемого консорциума лактобактерий в БАДе «Трилакт»
№	1 сутки		60 суток		108 суток
	Титр (КОЕ/мл)	Кислотность (°Т)	Титр (КОЕ/мл)	Кислотность (°Т)	Титр (КОЕ/мл)	Кислотность (°Т)
1	(2,5-3)×10 9	100-115	(2,5-3)×10 9	190-205	(1,1-2,5)×10 9	210-220
2	(6-7)×109	100-114	(2,5-3)×10 9	180-190	(1,1-2,5)×10 9	190-210
3	(7-6)×109	110-120	(2,5-3)×10 9	195-210	(2,5-3)×10 9	210-225
4	(3-5)×109	115-122	(2,5-3)×10 9	190-215	(1,1-2,5)×10 9	210-230
5	(6-7)×109	95-105	(2,5-3)×10 9	173-180	(1,1-2,5)×10 9	190-205
6	(5-6)×109	97-110	(1,3-3)×10 9	160-180	(1,1-2,5)×10 9	180-204
7	(5-6)×109	110-125	(1,3-3)×10 9	180-190	(1,1-2,5)×10 9	210-223
8	(5-6)×109	95-110	(1,3-3)×10 9	150-178	(1,1-2,5)×10 9	200-221
9	(6-7)×109	105-121	(1,3-3)×10 9	175-193	(1,1-2,5)×10 9	215-230
10	(6-7)×109	100-110	(2,5-3)×10 9	170-187	(2,5-3)×10 9	180-195
11	(6-7)×109	90-115	(2,5-3)×10 9	195-205	(1,1-2,5)×10 9	110-225
12	(6-7)×109	110-120	(2,5-3)×10 9	170-189	(1,1-2,5)×10 9	190-205
13	(6-7)×109	100-117	(2,5-3)×10 9	140-159	(2,5-3)×10 9	165-180
14	(6-7)×109	120-140	(2,5-3)×10 9	200-228	(2,5-3)×10 9	210-235
15	(6-7)×109	100-112	(2,5-3)×10 9	170-185	(1,3-2,5)×10 9	180-191

Пример 5. Применение БАД «Трилакт» для коррекции нарушений кишечного биоценоза при соматических заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции пищеварительной системы.

Клинические исследования проводились на базе Новосибирского Областного детского аллергодерматозного центра, расположенного на базе МУЗ ДГКБ №1, клинико-диагностической и бактериологической лабораторий указанной больницы; Новосибирского центра семейной реабилитации.

Важнейшую роль в жизнедеятельности организма человека играет нормальная микрофлора кишечника, подавляющая рост патогенных, гнилостных и газообразующих микроорганизмов, участвуя в обмене веществ и синтезе витаминов, стимулируя иммунную систему. Нарушение качественного и количественного состава нормофлоры, называемое дисбактериозом, приводит к заболеваниям органов пищеварения, системы кроветворения, иммунной системы, развитию гипотрофии, анемии, ферментопатии, способствует аллергизации организма. Поэтому вопросы профилактики и лечения нарушений кишечного биоценоза является объектом особого внимания.

БАД «Трилакт» представляет собой микробную массу живых лактобактерий, изготовлен по примеру 1 и восстанавливает нормальный состав микрофлоры кишечника.

Под наблюдением находилось 30 больных: дети в возрасте от 6-ти месяцев и взрослые в возрасте до 50 лет, имеющие дисбактериоз кишечника не выше 3 степени, не болевшие вирусными гепатитами и давшие информированное согласие на проведение исследований. Группу сравнения составили 30. Клинические симптомы заболевания до лечения были недомогание, слабость, головная боль, нарушение сна (73,3%); диспептический синдром в виде снижения аппетита, метеоризма, тошноты (53,3%); боли в животе (50,0%); расстройство стула в виде хронического запора (53,3%) и диареи (13,3%), чередования запора и поноса (3,3%). У 53,3% испытуемых отмечался кожный синдром в виде крапивницы и очагов атопического дерматита в подострой стадии и стадии обострения. У всех 30 человек, включенных в эксперимент (100,0%), были выявлены дисбиотические нарушения кишечника: дисбактериоз I степени у 24 (80,0%), дисбактериоз II степени у 6 (20,0%). 19 человек из 30 (63,3%) имели повышенный титр условно-патогенных бактерий в составе микрофлоры кишечника, 20 (66,7%) - атипичных и ферментативно неполноценных штаммов кишечной палочки.

Курс лечения с использованием БАД «Трилакт» составил 14 дней в возрастной дозе, предусмотренной инструкцией по применению:

- детям от 6-ти месяцев до 1 года - по рекомендации врача - до 5 мл (1 чайная ложка) в день на 2 приема,

- детям от 1 года до 7 лет - по 5 мл на 1 прием 2 раза в день,

- детям от 7 до 12 лет - по 5 мл на 1 прием 3 раза в день,

- взрослым и детям старше 12 лет применять по 10 мл (1 десертная ложка) на 1 прием 3 раза в день.

Лицам контрольной группы было проведено стандартное лечение.

В исследовании использовался препарат, близкий к окончанию срока годности. Согласно результатам оценки клинической эффективности исследуемого препарата оказалось, что улучшение самочувствия в виде нормализации сна, прекращения головных болей и недомогания отмечено у 18 человек из 22 (81,8%), имевших данные симптомы, у 4 человек они значительно уменьшились. Уменьшение диспептического синдрома (исчезновение тошноты, снижение метеоризма и улучшение аппетита) наблюдалось у 9 из 16 (56,3%); прекращение болей в животе у всех 15 человек (100,0%) с данной симптоматикой. Нормализация частоты и консистенции стула отмечена у 17 из 21 (80,9%) испытуемого, отчетливая положительная динамика кожного синдрома наблюдалась у 10 из 16 (62,5%) детей с атопическим дерматитом и рецидивирующей крапивницей улучшалась функция кишечника, у 22 больных исчезли дискомфорт, вздутие кишечника и урчание в животе. У 5 больных отмечали прекращение диареи в первые сутки, у 18 больных купированы запоры. У всех наблюдавшихся больных улучшился состав микрофлоры толстой кишки. К концу лечения у 24 больных достоверно увеличивалось количество анаэробных микроорганизмов бифидо- и лактобактерий, уменьшилось количество условно-патогенных микроорганизмов.

Таким образом, исследуемый препарат прошел клинические испытания и может считаться безвредным и обладающим высокой активностью в отношении восстановления нормобиоценоза кишечника и ускорения саногенеза при соматических заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции пищеварительной системы.

Приведенные примеры показывают, что предлагаемый консорциум штаммов трех видов лактобактерий активно размножается в питательных средах с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования. Продукт сквашивает молоко с образованием сгустка с хорошими вкусовыми и органолептическими свойствами; обладает специфической активностью. Консорциум штаммов можно рекомендовать в составе заквасок для приготовления БАД «Трилакт», кисломолочных лечебно-диетических продуктов, неферментированных пищевых продуктов и бактерийных препаратов.

Промышленная применимость

Приведенное описание изобретения излагает весь технологическийй процесс получения консорциума и продуктов на его основе, которые могут производиться как на молочных кухнях, так и на крупных молочных заводах. Используемые питательные среды и реактивы общедоступны. Средства и приемы для получения и выращивания биомассы консорциума, в том числе в виде лабораторной и производственной заквасок, а также средства и приемы, обеспечивающие замораживание и лиофилизацию сухого бактерийного препарата, традиционно используются в медицинской промышленности и биотехнологии.