противолучевое средство

Формула изобретения

Применение смеси экдистероидов 20-гидроксиэкдизона и 25S инокостерона, выделеленной из наземной части серпухи венценосной (Serratula coronata L.), в дозе 50 мг/кг в качестве противолучевого средства при субклинических дозах облучения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экдистероидсодержащим биологически активным веществам растительного происхождения и может быть использовано в медицине в качестве нового препарата, обладающего противолучевым действием в условиях длительного низкоинтенсивного гамма облучения.

Известно, что синтетические радиопротекторы обладают значительными побочными эффектами, и применение их при малых дозах облучения не всегда оправдано (Кудряшов Ю.Б. О химической защите от ионизирующей радиации низкой интенсивности // Радиац. биология. Радиоэкология, 1997. - Т.37. - Вып.4. - С.673-675; Заичкина С.И., Кондакова Н.В., Розанова О.И. и др. Тестирование противолучевого действия биологически активных веществ в диапазоне средних и малых доз облучения с использованием цитогенетического показателя микроядерного теста // Хим.-фарм. ж., 2004, Т.38, №8, стр.3-8).

В связи с этим в последнее время большое внимание уделяется поиску и изучению препаратов, обладающих противолучевыми свойствами в области малых доз облучения, особенно перспективно исследование биологически активных веществ (БАВ) природного происхождения (Легеза В.И., Владимиров В.Г. Новая классификация профилактических противолучевых средств // Радиац. биология. Радиоэкология, 1998. Т.38. - Вып.3. - С.416-425; Кудряшов Ю.Б. О химической защите от ионизирующей радиации низкой интенсивности // Радиац. биология. Радиоэкология, 1997. - Т.37. - Вып.4. - С.673-675).

Известно об участии экдистероидов в окислительных реакциях (Осинская Л.Ф., Саад Л.М., Холодов Ю.Д. Антирадикальные свойства и антиокислительная активность экдистерона // Укр. Биохим. Журн., 1992. - Т.64. - №1. - С.114-117.), а также о том, что биологическая активность этих природных соединений связана с воздействием на параметры физико-химической системы регуляции перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах животных тканей (Коцюруба А.В., Буханевiч О.М., Тараканов С.С. Механiзми ранньоi дii бioлогiчно активних оксистеринiв: кальцiтриолу и екдистерону. Модуляцiя внутрiшньоклiтинних пулiв арахiоновоi кислоти та продуктiв ii окиснювального метаболiзму. - Укр. Биохим. Журн., 1995. - Т.67 - №2. - С.45-52; Шишкина Л.Н., Кушнирева Е.В., Володин В.В. Исследование антиоксидантных свойств 20-гидроксиэкдизона в модельных системах // Тез. Междунар. совещ. по фитоэкдистероидам. Сыктывкар, 2-6 сентября 1996. 126 с.; Антиоксидантные свойства экдистероидов в системах in vitro и in vivo / Шишкина Л.Н., Кудяшева А.Г., Загорская Н.Г., Кушнирева Е.В., Шевченко О.Г. // Тез. Док VI Межд. конф. "Биоантиоксидант", М., 16-19 апреля 2002. С.632-633; Involvement of 20-hydroxyecdysone in lipid free-radical oxidation: antioxidizing and protection fanction / A.I.Kuzmenko, R.P.Morozova, I.A.Nikolenko, G.V.Donchenko, A.V.Palladin // Institute of Biochemistry, Ukrainian National Academy of Sciences, 2000.)

В связи с этим, перспективно исследование экдистероидсодержащих препаратов в качестве радиопротекторов, поскольку при низких дозах облучения основной вклад в обеспечение радиорезистентности организма вносят показатели, отражающие состояние мембранных структур (параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ) (Шишкина Л.Н. Особенности функционирования физико-химической системы регуляции перекисного окисления липидов в биологических объектах разной степени сложности в норме и при действии повреждающих факторов: Автореф. дис. д.х.н., Москва, 2003. 45 с.).

Противолучевые свойства были обнаружены у некоторых биологически активных препаратов растительного происхождения (Радиомодифицирующие эффекты корня женьшеня на функциональное состояние сердечно-сосудистой системы / Лобанок Л.М., Лукина Л.С., Русяев Л.А., Федорович В.А. // Биоантиоксидант: Междунар. симп. в рамках междунар. выст. "Мед. и охрана здоровья. Мед. техн. и аптека", Тюмень, 16-19 сент., 1997. С.76-77; Богданова Т.Б., Иванова И.К. Радиозащитные и антиоксидантные свойства фитосборов ТАН-1 и ТАН-10 // Материалы Межд. науч. конф. "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм формацевтической деятельности", Томск, 2000. С.127-128; Заичкина С.И., Кондакова Н.В., Розанова О.Н. и др. Тестирование противолучевого действия биологически активных веществ в диапозоне средних и малых доз облучения с использованием цитогенетического показателя микроядерного теста // Хим.-фарм. ж., 2004, Т.38, №8, стр.3-8).

Известно применение ферментного комплекса из биомассы культивируемых клеток женьшеня и полисциаса папоротниколистного в качестве противолучевого средства (RU патент №2123348, А61К 35/78).

Известно средство, обладающее противолучевой активностью, содержащее экстракт листьев Gingo bilobo (РСТ №92/14478, А61К 35/78).

Известно, что растительный экстракт, содержащий 20-гидроксиэкдизон, и сам препарат, выбранный за прототип, при перроральном введении крысам, облученным в дозе 8 Гр, увеличивает среднюю продолжительность жизни на 6-9 суток (Зибарева Л.Н. Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyllaciae. Автореф. дис. д.х.н., Новосибирск, 2003. 31 с.).

Неизвестно эффективное действие указанного препарата при пролонгированном хроническом действии малых доз ионизирующей радиации.

Задачей изобретения является создание противолучевого средства, полученного из растений Serratula coronata L., используемого при длительном действии ионизирующего излучения в малых дозах, расширение ассортимента препаратов, обладающих противолучевыми свойствами.

Применение нового средства после облучения в субклинических дозах приводит к нормализации фосфолипидной компоненты клеточных мембран печени и эритроцитов, кортикостероидной функции надпочечников, значительно снижает генотоксический эффект, обусловленный облучением.

Технический результат достигается тем, что в качестве действующего вещества, обладающего противолучевым свойством, используют смесь экдистероидов, содержащую 20-гидроксиэкдизон и 25S инокостерон, выделенную из серпухи венценосной (Serratula coronata L.)

Было установлено, что в наземных органах серпухи венценосной содержание фитоэкдистероидов, в частности, 20-гидроксиэкдизона (20Е), на порядок выше, чем в левзее сафлоровидной. Смесь экдистероидов, выделяют по способу, описанному в патенте РФ№2153346. Способ позволяет получить 20-гидроксиэкдизона - не менее 75% и 25S-инокостерона - не менее 10%.

Способ осуществляется следующим образом.

Заготовку сырья, предпочтительно листьев, осуществляют в фазу вегетации, массовой бутонизации или начала цветения. Экспериментально установлено, что в эти фазы развития содержание экдистероидов максимально. Исследование распределения экдистероидов в растениях серпухи венценосной проводили у средневозрастных генеративных особей. По содержанию экдистероидов серпуха венценосная намного превосходит рапонтикум сафлоровидный. Использование надземной части растения в отличие от корневищ рапонтикума, значительно облегчает заготовку и переработку экдистероид содержащего растительного сырья.

Измельченное растительное сырье (надземная часть растения рода Serratula семейства Asteraceae) неоднократно экстрагируют водой при температуре не выше 100°С не более 1 ч при постоянном перемешивании и соотношении сырье: экстрагент - 1:10 соответственно. Густой водный экстракт упаривают при пониженном давлении, обрабатывают смесью этилацетат-метанол, взятой при соотношении 4:1 или хлороформ-метанол при соотношении 6:1. Процедуру повторяют до полного извлечения экдистероидов из густого экстракта. Органические извлечения упаривают досуха, затем экдистероиды очищают путем хроматографии на оксиде алюминия в системе хлороформ-метанол или этилацетат-метанол возрастающей полярности и перекристаллизацией в системе этилацетат-метанол или этилацетат-этанол при соотношении 9:1.

Предлагаемое противолучевое средство, представляет собой белый кристаллический порошок, не имеющий запаха, мало растворимый в воде, хорошо растворимый в метаноле и 70%-ном этаноле.

Проверку противолучевых свойств препарата из смеси экдистероидов, названного «Серпистен», проводили ранней весной (март-апрель) на 85 половозрелых одновозрастных (2.5-3 мес) самцах белых беспородных мышей, содержащихся в стандартных условиях вивария. Животные были разбиты на 8 групп, средняя масса зверьков каждой группы была одинаковой. Маркировку проводили окраской шерсти. Содержали по восемь особей в каждой клетке.

Животных экспонировали в течение 30-и дней от двух источников ²²⁶Ra (активность источников составляла 0.474-106 и 0.451·106 кБк). Общая поглощенная доза за месяц облучения составила 22.6 сГр. Серпистен мыши получали в водном растворе в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг массы тела зверьков либо в течение десяти дней до облучения, либо в течение 10 дней после облучения.

Были рассмотрены следующие варианты: I группа - контрольная; II группа - подвергалась облучению; III группа получала противолучевое средство Серпистен в дозе 5 мг/кг; IV группа получала Серпистен - 50 мг/кг; V группа получала Серпистен - 5 мг/кг и затем подвергалась облучению; VI группа получала Серпистен - 50 мг/кг и подвергалась облучению; VII группа подвергалась облучению с последующим приемом Серпистена в дозе 5 мг/кг; VIII группа подвергалась облучению с последующим приемом Серпистена - 50 мг/кг. В период проведения эксперимента исследовали динамику массы тела животных. После декапитации зверьков проводили биохимический, гистоморфологический, цитогенетический анализ.

Пример 1. Динамика массы тела мышей. В процессе проведения эксперимента животных взвешивали через каждые двое суток, наблюдая за изменениями массы тела. У животных, получавших в течение 10 дней вместо питьевой воды раствор Серпистена (5 и 50 мг/кг, соответственно, варианты III и IV) не произошло заметных изменений в массе тела по отношению к контролю (вариант I). Взвешивание животных, в течение месяца подвергавшихся облучению, не показало достоверного прироста массы тела за весь период наблюдений (напротив, отмечали некоторое снижение массы к концу эксперимента), тогда как масса контрольных зверьков увеличилась в среднем на 2 г.

Таблица 1. Прирост массы тела самцов белых беспородных мышей в различных вариантах эксперимента
Вариант	Число животных	Прирост массы за период облучения, г	Прирост массы за время употребления препарата, г	Прирост массы за весь период, г
I контроль	16 8			2.6 1.6
II облучение	8	-1.1		-1.1
V 5 мг/кг + обл.	8			-0.1
VI 50 мг/кг + обл.	8			1.7
VII обл. + 5 мг/кг	8	-0.1	1.9	1.8
VIII обл. + 50 мг/кг	8	-1,3	1.0	-0.3

Анализ динамики массы тела мышей показал, что введение Серпистена после облучения в дозах 5 (вариант VII) и 50 мг/кг (вариант VIII) вызывает существенный прирост массы тела (на 1-1.9 г). К концу эксперимента, увеличение массы тела опытных зверьков либо приближается к контрольным показателям (вариант VII), либо масса животных остается на исходном уровне (вариант VIII), в зависимости от того, насколько снизилась масса зверьков за время облучения и какова доза препарата. Использование Серпистена до облучения (вариант V) также препятствовало снижению массы тела, а в варианте VI способствовало ее приросту, близкому к контрольным показателям. Итак, во всех случаях применение Серпистена препятствовало снижению массы животных, обусловленному длительным облучением, что подтверждает наличие противолучевых свойств у данного препарата.

Пример 2. Анализ одного из параметров системы регуляции процессов перекисного окисления липидов - состава фосфолипидов. Для выделения липидов из гомогенатов органов животных использовали метод Блая и Дайера в модификации Кейтса (Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 322 с.). Содержание фосфолипидных компонентов в липидах тканей определяли методом тонкослойной хроматографии (Молочкина Е.М. Определение эффективности антиоксидантов по их влиянию на реакции окисления ненасыщенных липидов, катализируемых гомосодержащими соединениями // Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo. - М.: Наука, 1992. - С.62-64).

Помимо анализа количественного соотношения различных фракций ФЛ (%), оценивали обобщенные показатели состава ФЛ: содержание ФЛ в составе общих липидов (% ФЛ) отношение фосфатидилхолина к фосфатидилэтаноламину (ФХ/ФЭ), отражающее структурное состояние мембранной системы органа; отношение сумм более легкоокисляемых к более трудноокисляемым фракциям ФЛ ( ЛОФЛ/ ТОФЛ), отражающее способность липидов к окислению. Данные экспериментов обработаны методами вариационной статистики (Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1980. - 293 с.; Сусликов В.И. Об усилении смертности млекопитающих от кишечного синдрома и частичном экранировании кроветворной системы или постлучевой трансплантации кроветворных клеток // Радиобиология, 1973. - Т.13. - Вып.6. - С.880-883).

При различных комбинациях последовательного действия Серпистена и хронического облучения наблюдаемый эффект в значительной степени зависел от концентрации вещества, времени его поступления в организм (до или после облучения) и исследуемого органа. Более существенные изменения как по отдельным фракциям фосфолипидов, так и по обобщенным показателям липидного обмена обнаружены в эритроцитах, по сравнению с печенью. Так, введение серпистена в обеих дозах (5-50 мг/кг) до облучения животных вызывало существенный рост (в 3.7-4.1 раза) доли лизофосфатидилхолина (ЛФХ) в мембранах эритроцитов. Между тем, использование этих же доз препарата после облучения, напротив, не приводило к достоверным изменениям в содержании ЛФХ (5 мг/кг), либо способствовало исчезновению данной фракции (50 мг/кг). Известно, что увеличение доли лизоформ фосфолипидов обусловлено активацией фосфолипазы Ад, вызывающей гидролиз ФЛ. ЛФХ обладает детергентным действием и в большом количестве токсичен для клетки. Эритроциты, имеющие в своем составе ЛФХ, обладают пониженной осмотической устойчивостью. Увеличение доли лизоформ наблюдали в липидах различных тканей животных, подвергнутых как острому облучению в эксперименте, так и у грызунов, отловленных на радиоактивно загрязненных территориях (Биологические эффекты радиоактивного загрязнения в популяциях мышевидных грызунов / А.Г.Кудяшева, Л.Н.Шишкина, О.Г.Шевченко, Л.А.Башлыкова, Н.Г.Загорская. Екатеринбург, 2004. 214 с.; Биохимические механизмы радиационного поражения природных популяций мышевидных грызунов / А.Г.Кудяшева, Л.Н.Шишкина, Н.Г.Загорская, А.И.Таскаев. СПб.: Наука, 1997. 156 с.).

Таблица 2 Состав фосфолипидов и обобщенные показатели липидного обмена в печени половозрелых самцов беспородных мышей в различных вариантах опыта
Фракция (показатель)	Контроль n=29	5 мг/кг(10 сут) + хр. облуч. (1 мес) n=17	50 мг/кг (10сут)+ хр. облуч. (1 мес) n=16	Хр. облуч. (1 мес) + 5 мг/кг (10 сут) n=23	Хр. облуч. (1 мес) + 50 мг/кг (10 сут) n=23
ЛФХ	3.44±0.14	4.35±0.7	2.78±0.21	2.92±0.27	3.09±0.29
СМ	3.9±0.11	7.21±0.7 *	3.87±0.12	3.16±0.28	4.50±0.29
ФХ	52.19±0.52	39.43±2.03*	52.74±1.1	51.57±0.79	51.06±0.83
ФИ+ФС	9.17±0.28	10.58±0.5	9.86±0.17	9.06±0.18	9.16±0.26
ФЭА	27.72±0.33	28.79±0.5	26.29±1.2	28.89±0.40	27.87±0.35
КЛ+ФК	3.57±0.22	9.64±0.9 *	4.46±0.2	4.40±0.22	4.30±0.47
% ФЛ	48.42±1.02	77.86±2.3*	50.49±0.67	49.64±0.84	52.57±1.1
ФХ/ФЭА	1.89±0.04	1.38±0.08	2.10±0.17	1.79±0.04	1.83±0.03
ЛОФЛ/ ТОФЛ	0.68±0.01	0.98±0.05*	0.71±0.01	0.74±0.01	0.71±0.01
N - число хроматографических дорожек; * - достоверность различий от контроля при P<0.05

Введение Серпистена после облучения препятствовало не только накоплению в мембранах изученных тканей токсичных лизоформ фосфолипидов, но и падению доли основной структурной фракции (ФХ), а также способствовало сохранению нормальных соотношений ФХ/ФЭ и ЛОФЛ/ ТОФЛ (особенно в липидах печени), отражающих соответственно структурное состояние мембранной системы и способность липидов к окислению. Данные характеристики имеют большое значение при оценке способности клетки к нормальному функционированию, особенно в условиях хронического воздействия низкоинтенсивного излучения, когда создаются предпосылки для чрезмерной интенсификации процессов перекисного окисления липидов.

Таблица 3 Отдельные показатели состава фосфолипидов и обобщенные показатели липидного обмена в печени половозрелых самцов беспородных мышей при различных вариантах опыта
Фракция (показатель)	Контроль n=29	5 мг/кг (10 сут) + хр. облуч. (1 мес) n=17	50 мг/кг (10 сут)+ хр. облуч. (1 мес) n=16	Хр. облуч. (1 мес) + 5 мг/кг (10 сут) n=23	Хр. облуч. (1 мес) + 50 мг/кг (10 сут) n=23
ЛФХ	2.03±2.03	6.10±0.57*	5.18±2.79	2.91±2.54	0
КЛ+ФК	5.03±1.16	2.35±0.58*	1.69±0.51**	3.14±0.30	5.16±1.80
%ФЛ	10.23±2.42	16.36±0.30**	22.89±5.42	-	10.57±4.25
ФХ/ФЭА	4.06±0.97	3.43±0.30	4.27±0.33	3.42±0.06	3.03±0.70
лоФЛ/ ТОФЛ	0.375±0.09	0.355±0.019	0.211±0.005	0.340±0.005	0.355±0.075

Из четырех рассмотренных нами вариантов последовательного действия -облучения и Серпистена наиболее предпочтительным оказалось применение последнего в дозе 50 мг/кг после прекращения действия облучения, что привело к нормализации фосфолипидной компоненты клеточных мембран по большинству изученных нами показателей.

Пример 3. Содержание гормонов (глюкокортикоидов и альдостерона) в ткани надпочечника мышей.

При определении кортикостероидных гормонов применяли метод микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который позволяет проводить анализ стероидных гормонов в небольших количествах биологического материала. В гомогенатах ткани надпочечника определяли содержание кортикостерона, 11-дегидрокортикостерона и альдостерона.

Полученные данные показали, что использованный режим хронического облучения вызывает почти двукратный подъем уровня кортикостерона в ткани надпочечника. Параллельно отмечено значительное снижение уровня альдостерона - гормона клубочковой зоны, регулирующего водно-солевой обмен.

Введение препарата Серпистен и последующее облучение животных (варианты V, VI), так же как прием препарата после облучения (варианты VII, VIII), приближает результат по содержанию гормонов надпочечника к контрольному уровню, снижая уровень кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона. Обращает на себя внимание тот факт, что введение препарата до облучения приводит к уменьшению уровня кортикостерона по сравнению с интактными животными, тогда как введение препарата в концентрации 50 мг/кг после облучения практически восстанавливает уровень кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона до контроля. При этом наблюдается повышение содержания альдостерона в ткани надпочечника, превосходящее контрольный уровень, тогда как облучение приводило к снижению содержания данного гормона.

Таблица 4 Содержание кортикостероидных гормонов в надпочечниках в различных вариантах опыта
Варианты эксперимента	Кортикостерон, нг/орган	11-дегидрокортикостерон, нг/орган	Альдостерон, нг/орган
Контроль	90±11	10,7±3,7	72±18
Обл. + экд. 5 мг/кг	61±20	4,0±0,63	94±44
Обл. + экд. 50 мг/кг	103±17	13±6	136±40
Экд. 3 мг/кг + обл.	74±12	3±1	82±29
Экд. 50 мг/кг + обл.	79±16	2,6±0,4	137±33

Таким образом, Серпистен при комбинированном действии с облучением, оптимизирует кортикостероидную функцию надпочечников, препятствуя ее функциональному истощению.

Пример 4. Цитогенетические показатели в клетках костного мозга мышей.

Поскольку в нашу задачу входило исследование возможных противолучевых свойств Серпистена, мы провели оценку цитогенетических эффектов хронического излучения в малой дозе с использованием микроядерного теста (Hedlle J.A. A rapid in vivo test for chromosomal damage // Mutation Research. 1973. V.18. P.187-190.). Было обнаружено, что хроническое облучение в течение одного месяца (накопленная доза - 22.6 сГр) оказывает значительный генотоксический эффект, увеличивая частоту микроядер в 2,5 раза.

Применение Серпистена в дозе 50 мг/кг как до облучения, так и после него привело к значительному снижению генотоксического эффекта облучения. При этом частота микроядер, возникающих при облучении (12.9%), снижалась в два раза.

Таблица 5 Эффекты последовательного действия низкоинтенсивного -облучения и Серпистена в разных дозах
Варианты эксперимента	Число животных	клеток	Частота микроядер (%)	Митотический индекс (%)
Контроль	26	26000	5.0±0.35	3.0±0.41
Облучение 1 мес.	8	8000	12.9±3.76 *	4.3±0.84
Облучение 1 мес + Серпистен 5 мг/кг	8	8000	4.6±1.00	3.6±0.61
Облучение 1 мес + Серпистен 50 мг/кг	8	8000	6.7±1.11	4.8±0.52*
Серпистен 5 мг/кг + Облучение 1 мес	8	8000	12.6±2.52 *	2.3±0.70
Серпистен 50 мг/кг + Облучение 1 мес	8	8000	6.0±1.15	2.5±0.50
*) достоверность различий от контроля при P<0.05

Противолучевой эффект Серпистена в минимальной дозе (5 мг/кг) проявлялся только в условиях его применения после облучения - в этом случае частота микроядер в клетках костного мозга снижалась до контрольного уровня - (4.6% и 5% соответственно).

Таким образом, смесь экдистероидов, выделенная из серпухи венценосной, обладает выраженным противолучевым эффектом в области низкоинтенсивного облучения.

- использование препарата в дозе 50 мг/кг после действия облучения приводит к нормализации как фосфолипидной компоненты клеточных мембран печени и эритроцитов по большинству изученных показателей, так и кортикостероидной функции надпочечников;

- применение препарата в дозе 50 мг/кг в течение десяти дней как до, так и после облучения значительно снижает мутагенный эффект, вызванный облучением.